不同比例濃縮牛乳蛋白及大豆分離蛋白干預對胎鼠及仔鼠小腦代謝組的影響

洪昱廷 楊晨 鐘瑾璟 侯艷梅 謝奎 王琳琳

作者單位：100191,北京大學生育健康研究所/國家衛生健康委員會生育健康重點實驗室;北京大學公共衛生學院流行病與衛生統計學系(洪昱廷,楊晨,王琳琳);410000,海普諾凱營養品有限公司(鐘瑾璟,侯艷梅,謝奎)

膳食中的蛋白來源一直被人們關注[1]。食物中的蛋白質含有某些特定的氨基酸序列,這些氨基酸構成的肽或稱生物活性肽已被發現可以調節多種生理過程[1];氨基酸本身也可以作為信號分子影響多種代謝過程,從而對人類健康產生影響[2-3]。

研究發現,膳食蛋白質不同來源可能會影響腦中血清素及兒茶酚胺類物質的合成[4]。不同來源的高蛋白攝入可能會對小鼠血腦屏障造成不同影響[5];來源于酪蛋白和大豆蛋白的肽對小鼠大腦部分腦區中的單胺神經遞質代謝的影響也有所不同[6]。

牛乳及其制品是最常見的膳食蛋白來源之一,牛乳中的蛋白質主要包含酪蛋白和乳清蛋白兩大類[7]。酪蛋白及乳清蛋白中已經分離鑒別出多種生物活性肽[8-10]。來源于大豆的蛋白質則被認為是植物性食物中少有的優質蛋白,大豆蛋白及其肽則被認為具有包括降低血脂,抗糖尿病、高血壓、癌癥,減輕氧化應激及炎癥反應,調節免疫及神經活動在內的廣泛的生物活性[11],相關干預實驗及機制研究已經較充分的證明了上述生物活性源于蛋白或肽自身,而非大豆中所包含的其它營養成分[12-14]。

上述研究揭示了不同來源蛋白及其肽影響神經系統功能的可能性。然而目前尚無研究探討不同來源蛋白對神經系統發育的影響。對包括人類在內的哺乳動物而言,胚胎及幼年期神經系統的發育對其功能十分重要,在神經系統中,小腦主要負責對運動功能進行調節,與具有更復雜的腦區分布和更復雜功能的大腦相比,其結構功能均較為獨立,故本研究希望通過動物模型,探索攝入不同來源蛋白后,大鼠胎鼠及仔鼠小腦代謝組的改變,以初步探索不同來源的蛋白成分對子代運動及協調能力發育的可能影響。

材料與方法

一、實驗材料

大豆分離蛋白(soy protein isolate,純度≥90%,西安維特生物科技有限責任公司),濃縮牛乳蛋白(milk protein concentrate,純度≥85%,美國Grassland Dairy Products Inc.)。

二、實驗動物

12周齡雌性SPF級Sprague-Dawley(SD)大鼠,每組24只,共3組,體重260～290 g,由北京大學醫學部實驗動物科學部提供[許可證號：SCXK(京)2016-0010]。飼養于恒溫(24±0.5)℃,恒濕(50±10%)并用燈光模擬日夜循環的環境中[許可證號：SYXK(京)20160041]。

三、主要試劑及儀器

樣本處理及檢測所用主要試劑為：蒸餾水(屈臣氏),質譜級乙腈(Thermo Fisher)、甲醇(Thermo Fisher)、甲酸(Sigma-Aldrich)。主要儀器為：Thermo Scientific M16710-33型漩渦振蕩器、昆山市超聲儀器有限公司KQ5200DE型超聲波清洗器、Beckman Coulter Microfuge22R型臺式高速冷凍離心機、Eppendorf Concentrator plus型真空濃縮儀、島津SHIMADZU Nexera UHPLC LC-30A型超快速液相色譜儀、AB SCIEXTMTripleTOF5600+型質譜儀。

四、動物干預實驗

1.實驗流程：實驗雌鼠適應性飼養3 d后,在下午18：00與健康SD雄鼠按雌雄性別比2：1合籠。次日晨檢查陰栓,見到陰栓的雌鼠認為受孕,并記為妊娠第0.5天(gestational day 0.5, GD0.5)。將受孕雌鼠按孕前體重隨機分為3組,每組24只,分別記為S1、S2、S3組,于GD0.5始每組飼喂不同配方飼料進行干預,持續至妊娠第18.5天(GD18.5)或出生后21天(postnatal day 21, PD21)。S1組飼料中蛋白成分50%來源于大豆分離蛋白,50%來源于濃縮牛乳蛋白;S2組則75%來源于大豆分離蛋白,25%來源于濃縮牛乳蛋白;S3組則均來源于大豆分離蛋白。

2.干預飼料配制：干預飼料配制遵循美國營養學會AIN93嚙齒類實驗動物生長繁殖期(G型)純化飼料標準,其詳細配方請詳見表1,每組飼料中僅蛋白來源不同,其余營養素均保持平衡。

3.生物樣本收集：GD18.5晚,每組按體重隨機選取12只孕鼠,隔夜禁食后,乙醚麻醉處死,完整剝離子宮并逐只解剖胎鼠。從上丘和下丘處小心剝分胎鼠小腦,并剪除連接在腦干上的蒂。每5只胎鼠小腦混合為1份樣本,每只孕鼠收集2份胎鼠小腦樣本,立即液氮速凍后保存于-80 ℃超低溫保存箱中。

其余孕鼠使其自然分娩,持續飼喂干預飼料至仔鼠出生后第21天(PD21)。PD2-3時,將每窩仔鼠數減少至10只,盡量雌雄各半。PD21晨,離乳仔鼠,每窩隨機選取雌雄各1只仔鼠進行禁食,8小時后乙醚麻醉處死。從上丘和下丘處小心剝分胎鼠小腦,并剪除連接在腦干上的蒂。記錄仔鼠性別,每只仔鼠小腦單獨保存,共收集20份仔鼠小腦樣本,同樣立即液氮速凍后保存于-80℃超低溫保存箱中。

本實驗方案已獲北京大學生物醫學倫理委員會實驗動物福利倫理分會委員審批(倫理批準號：LA2020440)。

五、非靶向代謝組學檢測方法

1.樣本前處理：簡單隨機選取來自10只不同孕鼠的10份胎鼠小腦,以及來自不同10窩的5只雄性、5只雌性仔鼠小腦進行非靶向代謝組學檢測。4℃解凍后準確稱取100 mg小腦組織,加入1000 μL冷乙腈,研磨,混懸液于冰浴中超聲提取30 min,在12 000 rpm,4 ℃下離心10 min,取出100 μL在37 ℃下真空離心濃縮至干。殘渣用100 μL乙腈溶解,于12 000 rpm,4 ℃下離心10 min,取上清液進樣10 μL,用超高效液相色譜-串聯質譜法(ultra-high performance liquid chromatography-mass spectrometry,UPLC-MS)進行檢測。

2.色譜條件：色譜柱為Waters BEH HILIC Column(100×2.1mm, 1.7 μm)。柱溫為35 ℃,流速為0.300 mL/min,流動相A：0.1%甲酸,1 mM乙酸銨溶液,流動相B：乙腈。洗脫程序為：0 min,A：5%、B：95%;8 min,A：50%、B：50%;10 min,A：50%、B：50%;12 min,A：95%、B：5%;15 min,A：5%、B：95%。

3.質譜條件：質譜則分別采用電噴霧電離(electrospray ionization, ESI)正離子和負離子模式進行檢測。ESI源霧化氣50 psi(1psi≈6.9 kPa),輔助氣50 psi,氣簾氣25 psi,霧化溫度：正離子500 ℃、負離子400 ℃,噴霧電壓：正離子5 500 V、負離子4 400 V。TOF MS掃描范圍100～1 200 Da,產物離子掃描范圍50～1 000 Da。

4.質量控制：隨機選取胎鼠小腦及仔鼠小腦前處理后上清液各5份,少量等體積混合后制得質控(QC)樣本,每檢測10例樣本后插入1例QC樣本,通過QC樣本的重現性和穩定性評估儀器狀態及方法可靠性。

六、統計學方法

通過Analysis Base File Converter軟件將原始數據轉換成ABF格式,導入MS-DIAL 4.60預處理后得到原始數據矩陣。對MassBank,Respect,GNPS三個數據庫進行全庫檢索,將提取的峰信息與數據庫進行比對,鑒定樣本中所包含的代謝物種類。

使用主成分分析(principal component analysis, PCA)觀察各樣本總體代謝輪廓及樣本間的天然區分情況,然后用偏最小二乘判別分析(partial least-squares discrimination analysis, PLS-DA)區分各組間代謝輪廓的總體差異,并計算各代謝物的變量投影重要性(variable importance for the projection, VIP),通過置換檢驗判斷PLS-DA模型的過擬合情況;同時計算不同組間代謝物的差異倍數(fold change, FC),并應用t檢驗判斷組間代謝物水平有無統計學差異。綜合VIP值、FC、t檢驗結果,篩選出各實驗組間的差異代謝物,本研究中的篩選標準為：VIP>1且組間差異倍數FC>1.5或<2/3且t檢驗中P值<0.05。篩選出組間差異代謝物后,比較不同組間有無共同差異代謝物,并對原始特征離子響應強度行趨勢方差分析,趨勢方差分析中采用Bonferroni方法進行多重校正檢驗。上述數據分析均采用R4.1.2完成。

結 果

一、一般情況

S1、S2、S3組孕鼠GD0.5至GD18.5平均增重依次為(130.2±18.3)g、(137.4±16.8)g、(133.9±17.5)g(依次n=10, 11, 11);PD21日仔鼠離乳時平均體重依次為(52.2±4.4)g、(53.9±5.3)g、(52.6±4.3)g(依次n=20, 20, 22)。孕鼠孕期增重及仔鼠離乳體重三組間均不存在統計學差異。

各組間胎鼠小腦及仔鼠小腦樣本的PCA得分圖如圖1所示。結果表明胎鼠小腦中僅S1組與S3蛋白組間代謝輪廓有一定天然區分;而仔鼠小腦中,S1組與S2組或S3組間代謝輪廓均有一定天然區分。

圖1 各組樣本間PCA得分圖 c1：胎鼠小腦,c2：仔鼠小腦,n=10Figure 1 PCA scores between samples in each group c1：fetal rat cerebellum, c2：offspring rat cerebellum, n=10

二、差異代謝物篩選

為尋找兩組仔鼠血漿及小腦間對分類貢獻最大的潛在小分子代謝物,進一步對樣本數據進行PLS-DA分析,并對PLS-DA模型進行置換檢驗。各組樣本間PLS-DA得分圖如圖2所示,置換檢驗結果則如表2所示。

圖2 各組樣本間PLS-DA得分圖 c1：胎鼠小腦,c2：仔鼠小腦,n=10Figure 2 PLS-DA scores between samples in each group c1：fetal rat cerebellum, c2：offspring rat cerebellum, n=10

表2 PLS-DA模型的置換檢驗結果aTable 2 Permutation test results of PLS-DA

進行PLS-DA分析后,兩組血漿及小腦樣本均得到完全分離。置換檢驗中,模型的R2及Q2越接近于1,過擬合現象越輕微。一般認為小樣本時若R2及Q2均大于0.2,則模型的過擬合程度可以接受。置換檢驗結果表明,在針對胎鼠小腦及仔鼠小腦進行分析的過程中,S2與S3組間的PLS-DA模型均存在一定過擬合現象,不再適宜進行后續差異代謝物的篩選。

綜合PLS-DA分析結果,以及FC和t檢驗結果,篩選出兩組間相對含量存在顯著性差異的代謝物。依據質譜數據庫信息,對所鑒定的差異代謝物進行初步分類,排除其中來源于植物的活性物質及確證的外源性藥物成分,各組胎鼠小腦及仔鼠小腦樣本間潛在內源性差異代謝物如表3及表4所示。兩組小腦間內源性差異代謝物包括多種氨基酸及衍生物、維生素及衍生物、多種其它活性物質。

表3 各組胎鼠小腦間內源性差異代謝物Table 3 Endogenous differential metabolites between fetal rat cerebellum in each group

表4 各組仔鼠小腦間內源性差異代謝物Table 4 Endogenous differential metabolites between offspring rat cerebellum in each group

三、共有差異代謝物的進一步分析

進一步分析不同組間共有的差異代謝物。其中胎鼠小腦間未見共有的差異代謝物,仔鼠小腦間共有差異代謝物的特征離子平均相對相應強度、趨勢檢驗結果如表5所示,趨勢檢驗結果進行了多重校正檢驗。

表5 仔鼠小腦間共有差異代謝物的質譜響應強度及趨勢檢驗結果aTable 5 The mass spectral response intensity and trend test results of common differential metabolites in the cerebellum of offspring rata

趨勢檢驗結果表明,N-甲基組氨酸(N-methylhistidine)、4-氨基戊酸甜菜堿(4-aminovaleric acid betaine)、1-甲基煙酰胺(1-methylnicotinamide)、鳥嘌呤(Guanine)、5-一磷酸胞苷(Cytidine 5′-monophosphate)、1-甲基腺苷(1-methyladenosine)等物質在仔鼠小腦中水平隨大豆分離蛋白干預比例增加呈增加趨勢。

討 論

本研究使用不同比例濃縮牛乳蛋白及大豆分離蛋白的飼料對大鼠妊娠期及哺乳期進行了干預,并通過代謝組學方法探索GD19.5胎鼠小腦及PD21仔鼠小腦中的物質水平變化。結果表明胎鼠及仔鼠小腦中多種潛在活性物質水平發生了明顯改變,且在仔鼠小腦中,隨飼料中大豆分離蛋白的含量增加,N-甲基組氨酸、4-氨基戊酸甜菜堿、1-甲基煙酰胺、鳥嘌呤、5-一磷酸胞苷、1-甲基腺苷水平亦增加,并存在劑量反應關系。

既往探討不同蛋白來源或其肽對神經系統影響的有關研究相對較少。有研究者曾探討高蛋白飲食中,牛乳酪蛋白或大豆分離蛋白對成年小鼠血腦屏障的影響,結果發現高酪蛋白飲食對小鼠血腦屏障功能造成損害,但高大豆蛋白飲食則未發現此種現象[13];也有日本學者曾探討大豆和酪蛋白衍生肽對成年小鼠大腦皮層、腦干、海馬中酪氨酸和單胺神經遞質代謝的影響,結果發現大豆蛋白和酪蛋白肽攝入對小鼠上述腦區中相關神經遞質的代謝影響有所不同[14]。此外,稍早有國內研究發現對缺碘小鼠補充大豆蛋白可以降低腦組織受自由基損傷的程度[15];細胞實驗中也發現大豆蛋白肽可以減輕β-淀粉樣蛋白肽誘導的小鼠原代海馬神經元損傷[16]。在針對牛乳蛋白及其肽的研究中,則發現酪蛋白及其肽具有預防壓力引起的應激行為及抗焦慮作用[7, 17];針對衰老、阿爾茨海默模型的小鼠的研究中,則發現了乳清蛋白肽的有利影響[18, 19]。綜上,既往研究揭示了不同來源蛋白或其肽對神經系統功能的作用差異,功能差異往往與物質基礎改變有關,尤其是發育階段形成的物質結構變化,但目前尚無研究探討不同來源蛋白對發育中的神經系統的代謝組學影響。

本研究中發現,蛋白來源中大豆蛋白比例增加使得仔鼠小腦中N-甲基組氨酸、4-氨基戊酸甜菜堿、1-甲基煙酰胺、鳥嘌呤、5-一磷酸胞苷、1-甲基腺苷等物質水平增加,且存在劑量反應關系。上述物質中,N-甲基組氨酸是組氨酸甲基化后的產物,然而目前罕有研究探討組氨酸甲基化在蛋白質功能和細胞生理學中的作用,其對神經系統的可能影響也并不清楚[20]。4-氨基戊酸甜菜堿則是甜菜堿類化合物中的一種,甜菜堿又稱為三甲基甘氨酸,被認為具有對抗氧化應激、調節能量代謝等多種功能[21]。近期研究中還發現甜菜堿可以預防阿爾茨海默模型小鼠中認知障礙的發展,并降低腦中的氧化應激水平及相關基因的表達[22-23]。1-甲基煙酰胺則是另一種可能對神經系統產生有利影響的物質,目前已經發現其可以拮抗外源性物質帶來的神經炎癥、凋亡以及伴隨而來的認知能力下降[24-25]。鳥嘌呤、5-一磷酸胞苷、1-甲基腺苷則均屬于嘌呤或嘧啶及其衍生物,很早人們就已意識到嘌呤能系統在哺乳動物中樞神經系統中可能具有重要功能[26]。目前研究發現鳥嘌呤及其核苷酸同樣對神經系統具有有益作用,鳥苷被認為可以減少腦中的神經炎癥、氧化應激和興奮性毒性,并在神經元和神經膠質細胞中發揮營養作用[27]。近期研究同樣發現鳥苷可以對抗抑郁作用,并在缺血性中風中起到保護作用[28-29]。腺嘌呤及其衍生物對神經系統的有關影響也有一些研究[28],但胞嘧啶及其衍生物的相關研究則相對很少。

在神經系統中,與具有更復雜的腦區分布和更復雜功能的大腦相比,小腦主要負責對運動功能進行調節,其結構功能均較為獨立,在代謝組學研究中,有利于集中發現重要的線索。然而由于中樞神經系統各部分結構和功能存在差異,其代謝組也可能存在差別,故而本研究中發現的差異代謝物可能僅能表征胎鼠及仔鼠小腦的代謝組改變,而不能直接反應中樞其它部分的代謝組改變,需要進一步的研究來闡明。除此之外,本研究中采用非靶向代謝組學方法進行研究,無法獲得對應物質的絕對定量水平,故而無法對胎鼠及仔鼠小腦中相應代謝物水平是否超出生理限度做出判斷,也是本研究的不足之處之一。

綜上所述,本研究通過代謝組學方法揭示了不同比例濃縮牛乳蛋白及大豆分離蛋白干預會對胎鼠及仔鼠小腦的代謝組產生影響,但其具體作用機制及這種差異的功能性影響還需要進一步的研究來闡明。