基于Sirt1/p53信號通路探究NK4基因?qū)Ψ腔羝娼鹆馨土黾?xì)胞增殖和凋亡的機(jī)制研究

賁海祥, 徐 娟

(江蘇省如皋市人民醫(yī)院血液科, 江蘇 如皋 226500)

惡性淋巴瘤(Malignant lymphoma,ML)是一種血液惡性腫瘤,發(fā)生在淋巴結(jié)或淋巴結(jié)外的淋巴組織[1]。非霍奇金淋巴瘤(Non-Hodgkin's lymphoma,NHL)是一類起源于淋巴系統(tǒng)的癌癥,由惡性B細(xì)胞的過度增殖引起,是美國第七大常見惡性腫瘤,通常被認(rèn)為是預(yù)后良好的惡性腫瘤,5年生存率約為70%[2]。但淋巴瘤的發(fā)病率在全球范圍內(nèi)持續(xù)增加,對人類健康造成嚴(yán)重危害[3]。NHL最常見的類型為彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤(DLBCL)、濾泡性淋巴瘤(FL)和套細(xì)胞淋巴瘤(MCL)[4]。NK4是一種特異性肝細(xì)胞生長因子(HGF)拮抗劑,由HGF的N端發(fā)夾結(jié)構(gòu)和α鏈的四個Kringle結(jié)構(gòu)域組成。NK4蛋白給藥或NK4基因治療抑制了各種腫瘤類型中的腫瘤生長、侵襲、轉(zhuǎn)移和血管生成,所述腫瘤類型包括乳腺癌、結(jié)腸癌、肺癌、胰腺癌、間皮瘤、前列腺癌、胃癌和腦癌[5～7]。另外,去乙酰化酶sirtuin-1(Sirt1)是一種NAD+依賴性Ⅲ類組蛋白去乙酰化酶,其功能上與細(xì)胞代謝相關(guān),并被視為代謝傳感器[8],可調(diào)節(jié)干細(xì)胞、細(xì)胞增殖、凋亡、DNA修復(fù)、自噬和腫瘤發(fā)生,Sirt1在許多癌癥中上調(diào),包括前列腺癌、白血病和皮膚T細(xì)胞淋巴瘤腫瘤細(xì)胞[9]。沉默或抑制Sirt1的表達(dá)水平會激活下游p53蛋白,并隨后加速或推動細(xì)胞衰老[10]。目前,NK4對NHL疾病的調(diào)控機(jī)制尚鮮有研究,尤其是NK4是否通過介導(dǎo)Sirt1/p53信號通路調(diào)控腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)行為仍未可知。因此,在這項研究中,我們旨在探究NK4基因?qū)HL細(xì)胞增殖、凋亡的調(diào)節(jié)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1細(xì)胞培養(yǎng):人類非霍奇金淋巴瘤細(xì)胞株(Jurkat和Raji)及正常B細(xì)胞系均購自美國典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC,Rockville,MD,USA)。Jurkat和Raji細(xì)胞在補充有10% FBS的RPMI 1640培養(yǎng)基中生長,B細(xì)胞維持在添加10%人血清、100U/mL青霉素、100μg/mL鏈霉素、2mM L-谷氨酰胺(Invitrogen,Carlsbad,CA,USA)的Iscove s改良培養(yǎng)基中(NABI Biopharmaceuticals,Boca Raton,FL,USA)。所有細(xì)胞系都在37℃,5% CO2條件下培養(yǎng)。

1.2細(xì)胞轉(zhuǎn)染:pcDNA3.1-NK4、pcDNA3.1-NC均購自Invitrogen(Carlsbad,CA,USA),Sirt1激動劑SRT1720購自碧云天生物科技有限公司(上海,中國)。oe-NK4/NC組細(xì)胞處理步驟如下:將細(xì)胞以1×106細(xì)胞/mL的密度置于6孔板上,按照操作說明書,使用LiPofectamine 2000 (11668-019,Invitrogen,Carlsbad,CA,USA)將50 nM pcDNA3.1-NK4/NC轉(zhuǎn)染到Raji細(xì)胞(培養(yǎng)至融合度80%以上)中,轉(zhuǎn)染48h。oe-Sirt1+SA/DMSO組處理步驟如下:在培養(yǎng)基中加入給定濃度的SIRT1激動劑SRT1720 (1moL/L)或者等量的DMSO,再轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-NK4 48h后進(jìn)行后續(xù)實驗。

1.3qRT-PCR(實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)):從人淋巴瘤細(xì)胞系或正常外周淋巴細(xì)胞中提取總RNA TRIzol試劑(Invitrogen),并使用反轉(zhuǎn)錄第一鏈cDNA合成試劑盒(K1622; Thermo Fisher Scientific)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。根據(jù)制造商的說明,使用Maxima SYBR Green/ROX qPCR master mix(K0223;Thermo Fisher Scientific)進(jìn)行qRT-PCR檢測NK4 mRNA水平,β-actin用于歸一化。用于qRT-PCR的引物如下,NK4 F:5′-GTGAATACTGCAGACCAATGTGCTA-3′和NK4 R:5′-GGTCAAATTCATGGCCAAATTC-3′;β-actin F:5′-TGGCACCCAGCACAATGAA-3′,R:5′-CTAAGTCATAGTCCGCCTAGAAGCA-3′。使用2-△△Ct比較Ct方法計算。

1.4CCK-8檢測細(xì)胞增殖:細(xì)胞增殖通過細(xì)胞計數(shù)試劑盒-8(CCK8)分析(C0039,碧云天生物科技有限公司,北京,中國)。將不同組的細(xì)胞以2×105細(xì)胞/孔的密度接種到96孔板中,并在37℃含5% CO2的濕潤培養(yǎng)箱中孵育隔夜。在第0小時、第12小時、第24小時、第48小時和第72小時收集細(xì)胞。去除培養(yǎng)基并用無血清基本培養(yǎng)基替換后,向每個孔中加入10μL CCK 8溶液并孵育1h,之后將100 μL樣品上清液轉(zhuǎn)移到96孔微孔板中,并根據(jù)光密度波長為450nm。

1.5流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡:細(xì)胞被胰蛋白酶消化并在冷PBS中洗滌兩次。在1000g離心5min后,收集細(xì)胞并濃縮至每孔1×106個細(xì)胞。將0.1mL細(xì)胞懸浮液與5μL FITC綴合的膜聯(lián)蛋白V混合,在室溫下避光孵育15min,然后與5μL PI 混合并孵育5min。然后使用流式細(xì)胞儀(FACSCanto Ⅱ,BD Biosciences,US)分析樣品。

1.6Transwell法檢測細(xì)胞遷移、侵襲:根據(jù)生產(chǎn)商說明,使用24孔Transwell小室(BD,Biosciences)檢測細(xì)胞遷移和侵襲能力。侵襲實驗時,先按1∶8的比例將50mg/L Matrigel膠稀釋后鋪于小室底部;遷移實驗時不鋪膠。24孔板下室加入完全培養(yǎng)基600μL,取各組細(xì)胞懸液200μL加入Transwell小室的上室,在37℃下孵育24h后,使用棉簽去除上室中的細(xì)胞。遷移或侵襲細(xì)胞用甲醇在4℃固定30min,用0.1%結(jié)晶紫溶液在37℃染色20min,用倒置顯微鏡(Nikon Corporation,Japan)進(jìn)行觀察。細(xì)胞實驗獨立重復(fù)3次。

1.7Western blot:用含有磷酸酶和蛋白酶抑制劑的RIPA裂解緩沖液(基爾頓生物科技上海有限公司,上海,中國)獲取細(xì)胞裂解液,使用BCA蛋白質(zhì)測定試劑盒(PICPI23223; Thermo Fisher Scientific)對樣品蛋白濃度進(jìn)行檢測。進(jìn)行加熱和變性后,使用10%(對于高分子量蛋白質(zhì))或15%(對于低分子量蛋白質(zhì))十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白質(zhì)樣品(25μg/泳道),并轉(zhuǎn)移到硝酸纖維膜(Millipore,Billerica,MA,USA)上。在室溫下用5%脫脂牛奶封閉1h后,將膜與一抗在4℃下單獨孵育過夜。一抗信息如下:Sirt1(ab189494,1∶1000,80kDa)、p53(ab32389,1∶10000,44kDa),GAPDH(ab9485,1∶2500,37kDa)所有抗體均購自Abcam(Cambridge,MA,USA)。用含Tween-20的Tris緩沖鹽水洗滌后,將膜與辣根過氧化物酶(HRP)偶聯(lián)的山羊抗兔二抗(1∶1000; ab150077)一起在室溫下孵育1h。在Tanon 5200化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)(上海天能科技有限公司,上海,中國)上觀察到蛋白質(zhì)條帶。使用ImageJ軟件(National Institutes of Health,Bethesda,MD,USA)分析條帶密度,GAPDH條帶用作內(nèi)參。

2 結(jié) 果

2.1NK4基因在NHL細(xì)胞低表達(dá):為評估NK4基因在NHL細(xì)胞中的表達(dá)水平,我們使用qRT-PCR檢測NHL細(xì)胞系(Jurkat和Raji)及正常B細(xì)胞(normal)中NK4 mRNA的表達(dá)。結(jié)果顯示,與正常B細(xì)胞相比,NK4 mRNA水平在NHL細(xì)胞系中顯著下降(圖1,均P<0.01),其中,NK4表達(dá)水平在Raji細(xì)胞中最低。因此在后續(xù)的研究中,我們采取Raji細(xì)胞作為研究對象。

圖1 NK4基因在NHL細(xì)胞低表達(dá)

2.2上調(diào)NK4基因表達(dá)水平抑制NHL細(xì)胞生長進(jìn)展:為探索NK4細(xì)胞在NHL細(xì)胞中的作用,我們使用pcDNA3.1-NK4及其陰性對照pcDNA3.1-NC轉(zhuǎn)染至Raji細(xì)胞中。qRT-PCR結(jié)果顯示,轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-NK4組(oe-NK4組)NK4 mRNA水平顯著上升,轉(zhuǎn)染成功(圖2A,P<0.001)。隨后,我們分別采取CCK-8和流式細(xì)胞術(shù)探究細(xì)胞增殖和凋亡,結(jié)果顯示,與轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-NC組(oe-NC組)相比,上調(diào)NK4表達(dá)水平顯著抑制NHL細(xì)胞增殖、促進(jìn)細(xì)胞凋亡(圖2B-C,均P<0.001)。此外,在NHL細(xì)胞中上調(diào)NK4表達(dá)水平后,NHL細(xì)胞遷移和侵襲能力顯著下降(圖2D,均P<0.01)。以上結(jié)果表明,上調(diào)NK4基因表達(dá)水平抑制NHL細(xì)胞生長進(jìn)展。

圖2 上調(diào)NK4基因表達(dá)水平抑制NHL細(xì)胞生長進(jìn)展

2.3NK4基因抑制Sirt1/p53信號通路:Western blot檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn),與正常B細(xì)胞相比,Sirt1蛋白表達(dá)水平在Raji細(xì)胞中顯著上調(diào)(圖3,P<0.001),而p53蛋白表達(dá)水平顯著下降(圖3,P<0.001)。而在Raji細(xì)胞中過表達(dá)NK4基因后,Sirt1蛋白表達(dá)水平顯著下降,p53水平顯著上升(圖3,均P<0.001)。以上結(jié)果表明,NK4基因抑制Sirt1/p53信號通路。

圖3 NK4基因抑制Sirt1/p53信號通路

2.4激活Sirt1/p53信號通路部分逆轉(zhuǎn)過表達(dá)NK4對NHL細(xì)胞生長進(jìn)展的抑制:為進(jìn)一步確定NK4/Sirt1/p53在NHL細(xì)胞生長進(jìn)展中發(fā)揮的作用,在上調(diào)NK4表達(dá)的Raji細(xì)胞中,同時添加Sirt1激活劑SRT1720上調(diào)Sirt1的表達(dá)。結(jié)果顯示,SRT1720顯著上調(diào)Raji細(xì)胞中Sirt1蛋白表達(dá)水平,顯著降低p53蛋白表達(dá)水平(圖4A,均P<0.01)。本研究還觀察到Sirt激活劑顯著促進(jìn)NHL細(xì)胞增殖、抑制細(xì)胞凋亡(圖4B-C,均P<0.01)。此外,在NHL細(xì)胞中添加Sirt激活劑后,NHL細(xì)胞遷移和侵襲能力顯著下降(圖4D,均P<0.01)。以上結(jié)果表明,激活Sirt1/p53信號通路部分逆轉(zhuǎn)過表達(dá)NK4對NHL細(xì)胞生長進(jìn)展的抑制。

圖4 激活Sirt1/p53信號通路部分逆轉(zhuǎn)過表達(dá)NK4對NHL細(xì)胞生長進(jìn)展的抑制

3 討 論

NHL覆蓋了約90%的影響淋巴結(jié)、脾、骨髓和免疫系統(tǒng)及其他器官的淋巴瘤。NK4基因療法可抑制多種腫瘤的生長、侵襲、轉(zhuǎn)移和血管生成[5]。在不同癌癥的實驗?zāi)Ｐ椭?NK4基因治療抑制了Met受體的激活,這與抑制腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移有關(guān)。類似地,NK4基因治療抑制腫瘤血管生成,從而抑制血管生成依賴性腫瘤生長[11]。因此,在本研究中筆者大膽假設(shè)NK4基因或許對NHL的發(fā)生發(fā)展發(fā)揮著關(guān)鍵作用。結(jié)果顯示,與正常B細(xì)胞相比,NK4基因在NHL細(xì)胞系(Jurkat和Raji)中低表達(dá)。這提示,差異表達(dá)的NK4或許對NHL細(xì)胞的生物學(xué)功能扮演了重要角色。接下來,我們通過過表達(dá)NK4來探究其對Raji生物學(xué)行為的影響。結(jié)果顯示,上調(diào)NK4基因表達(dá)水平能夠明顯抑制NHL細(xì)胞生長進(jìn)展。這暗示NK4在NHL細(xì)胞中作為抑瘤基因發(fā)揮著重要功能。

已有的研究證明,Sirtuin家族具有延緩細(xì)胞衰老和延長壽命方面的功能[10]。Sirt1有多種底物,如NF-κB、Ku70、p53、E2F1、TFR2、PPARγ、p73、BcL-XL、MyoD、AR、cI AP2和FOXO家族的轉(zhuǎn)錄因子。p53作為Sirt1底物的最具代表性的底物,被認(rèn)為是一種腫瘤抑制因子。有研究報道,Sirt1表達(dá)與彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤的不良預(yù)后相關(guān)。Ismail等的研究顯示p53的表達(dá)水平反映了侵襲性淋巴瘤亞型中有關(guān)基因突變的積累。因此,Sirt1/P53通路與抑瘤基因發(fā)揮功能密切相關(guān)。基于此,在本研究中,結(jié)果發(fā)現(xiàn),與正常B細(xì)胞相比,Sirt1蛋白表達(dá)水平在NHL細(xì)胞中顯著上調(diào),而p53蛋白表達(dá)水平顯著下降。這提示Sirt1/P53通路在NHL細(xì)胞中異常激活。然而,過表達(dá)NK4能夠抑制Sirt1/P53通路活性。另外,通過利用Sirt1/P53通路激活劑SRT1720筆者觀察到,激活Sirt1/p53信號通路能夠部分逆轉(zhuǎn)過表達(dá)NK4對NHL細(xì)胞生長進(jìn)展的抑制作用。因此,NK4可能通過抑制Sirt1/p53通路從而抑制NHL細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)NHL細(xì)胞凋亡。

總之,我們的結(jié)果提供了NHL中NK4過表達(dá)可能對削弱細(xì)胞生長進(jìn)展具有十分重要的作用,這表明NK4在NHL進(jìn)展中作為一種抗癌基因發(fā)揮作用,并可能作為一種新的潛在治療生物標(biāo)志物影響下游Sirt1/p53信號通路。但本研究中不足之處在于僅在Raji細(xì)胞中對該機(jī)制進(jìn)行驗證,未充分考慮該機(jī)制是否存在于其它NHL細(xì)胞系中。