痤瘡丙酸桿菌拮抗菌的篩選、發(fā)酵優(yōu)化及安全性評(píng)價(jià)

何夢(mèng)妮,彭政,張娟*

1(江南大學(xué),工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,江蘇 無錫,214122)2(江南大學(xué) 生物工程學(xué)院,江蘇 無錫,214122) 3(江南大學(xué),未來食品科學(xué)中心,江蘇 無錫,214122)

痤瘡 (acne) 是一種基于毛囊皮脂腺單位的慢性炎癥性疾病,多見于青少年時(shí)期,其中有15%～20%的人患有中度至重度的痤瘡[1]。痤瘡會(huì)對(duì)患者皮膚造成傷害,增加患者產(chǎn)生焦慮、抑郁的風(fēng)險(xiǎn)[2]。痤瘡丙酸桿菌是引發(fā)痤瘡的重要因素之一,它可以通過定植產(chǎn)生脂肪酶/酯酶、蛋白酶等酶類造成皮膚損傷,促進(jìn)白細(xì)胞及角質(zhì)形成細(xì)胞產(chǎn)生促炎因子等一系列過程誘導(dǎo)痤瘡發(fā)病[3-4]。因此,限制痤瘡丙酸桿菌的定植和增殖是痤瘡治療的關(guān)鍵。目前,局部或全身的抗生素使用是治療痤瘡的主要方法之一。然而,抗生素的長期使用會(huì)導(dǎo)致痤瘡丙酸桿菌耐藥性的增加[5]。此外,其他藥物的使用例如異維A酸和過氧苯甲酰等存在部分副作用,包括嘔吐、皮膚脫落、皮膚產(chǎn)生刺痛和灼燒感等[6-7]。基于以上問題,尋找可以有效地抑制痤瘡丙酸桿菌的生長,同時(shí)減少副作用的新型抗菌劑越來越受到關(guān)注。

微生物在自然界中廣泛存在、種類繁多,是探索和開發(fā)新型抗菌劑的重要來源。AGRAWAL等[8]從西海岸和印度安達(dá)曼島的樣本中篩選出35種海洋真菌并檢測(cè)它們的抗菌活性,其中14株真菌 (42%) 對(duì)痤瘡丙酸桿菌表現(xiàn)出不同水平的抗菌活性。CHA等[9]從傳統(tǒng)泡菜中分離出副植物乳桿菌 (Lactobacillusparaplantarum)THG-G10,并證實(shí)其對(duì)痤瘡丙酸桿菌具有抑菌作用,抑菌圈直徑達(dá)到15.00 mm。ONEILL等[10]研究發(fā)現(xiàn),從人體皮膚微生物組中分離出的頭狀葡萄球菌(Staphylococcuscapitis)E12可以抑制痤瘡丙酸桿菌的生長。雖然目前已有部分痤瘡丙酸桿菌拮抗微生物得到分離和純化,但已發(fā)現(xiàn)的拮抗菌對(duì)痤瘡丙酸桿菌抑菌活性不高。因此,本研究從酸菜中篩選能高效拮抗痤瘡丙酸桿菌的菌株,通過生理生化和16S rDNA測(cè)序比對(duì)分析對(duì)菌株進(jìn)行鑒定。采用發(fā)酵優(yōu)化的方法提升其抑菌活性,使用體外安全評(píng)價(jià)的方法評(píng)估菌株的安全性。以期能進(jìn)一步豐富痤瘡丙酸桿菌拮抗菌資源庫,為該菌株作為抗菌劑在痤瘡治療、化妝品和護(hù)膚品行業(yè)的應(yīng)用提供一定的研究基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 樣品與培養(yǎng)基

樣品:酸菜樣品購于碧水農(nóng)場(chǎng)(產(chǎn)自四川宜賓,品名為老壇酸菜),痤瘡丙酸桿菌(Cutibacteriumacnes)ATCC 6919購于廣東省微生物保藏中心。

RCM(reinforced clostridium medium)液體培養(yǎng)基(g/L):蛋白胨10.0,牛肉粉10.0,酵母粉3.0,葡萄糖5.0,可溶性淀粉1.0,氯化鈉5.0,醋酸鈉3.0,L-半胱氨酸鹽酸鹽0.5,瓊脂 0.5,調(diào)節(jié)pH 6.7～6.9,121 ℃滅菌15 min。

MRS液體培養(yǎng)基(g/L):K2HPO410.0,乙酸鈉5.0,MgSO4·7H2O 0.5,MnSO4·H2O 0.25,檸檬酸氫二銨2.0,葡萄糖5.0,蛋白胨10.0,吐溫80 1.0,牛肉膏10.0,酵母膏5.0,調(diào)節(jié)pH 5.5～5.9,115 ℃滅菌20 min。

LB液體培養(yǎng)基(g/L):酵母膏5.0,胰蛋白胨10.0,NaCl 10.0,調(diào)節(jié)pH 6.9～7.1,121 ℃滅菌15 min。

NB(nutrient broth)培養(yǎng)基(g/L):牛肉膏3.0,胰蛋白胨10.0,NaCl 5.0,調(diào)節(jié)pH 7.0～7.4,121 ℃滅菌15 min。

TSB(trypticase soy broth)培養(yǎng)基(g/L):胰酪蛋白胨17.0,大豆蛋白胨3.0,葡萄糖2.5,NaCl 5.0,K2HPO42.5,調(diào)節(jié)pH 7.1～7.5,121 ℃滅菌15 min。

BPY(beef peptone yeast)培養(yǎng)基(g/L):牛肉膏5.0,蛋白胨10.0,酵母膏5.0,NaCl 5.0,葡萄糖5.0,調(diào)節(jié)pH 7.0,121 ℃滅菌15 min。

Landy培養(yǎng)基(g/L):葡萄糖20.0,L-谷氨酸鈉5.0,蛋白胨10.0,MgSO40.5,KCl 0.5,KH2PO41.0,MnSO40.005,FeSO40.000 15,CuSO40.000 16,調(diào)節(jié)pH 7.0,121 ℃滅菌15 min。

NYD培養(yǎng)基(g/L):牛肉膏8.0,酵母膏5.0,葡萄糖10.0,調(diào)節(jié)pH 7.2,121 ℃滅菌15 min。

所有固體培養(yǎng)基在其液體培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上加入20 g/L的瓊脂粉。

1.2 主要試劑與儀器

血瓊脂平板,廣東環(huán)凱生物科技有限公司;藥敏紙片,杭州濱河微生物試劑有限公司;小型質(zhì)粒抽提試劑盒、細(xì)菌基因組DNA抽提試劑盒,上海生物工程有限公司;研究中引物合成與DNA測(cè)序均由上海生工生物工程有限公司完成。

HDPN-II-55電熱恒溫培養(yǎng)箱,上海躍進(jìn)醫(yī)療器械有限公司;5810R臺(tái)式高速離心機(jī),德國Eppendorf公司;DYY-6D瓊脂糖凝膠電泳儀,北京六一生物科技有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 菌株的分離純化

取購買的酸菜樣品10 g,放入50 mL無菌離心管中,加入玻璃珠以及25 mL無菌生理鹽水,220 r/min,37 ℃搖床振蕩30 min混勻。取1 mL混合液進(jìn)行梯度稀釋至10-4,涂布于LB和MRS平板,置于37 ℃培養(yǎng)24 h,根據(jù)菌落形態(tài)的不同,挑取單菌落進(jìn)行劃線分離,分離后得到的單菌落用LB或MRS液體培養(yǎng)基置于37 ℃,220 r/min培養(yǎng)24 h,獲取菌株發(fā)酵液,用于后續(xù)初篩實(shí)驗(yàn)。抑菌效果較好的菌株將置于-80 ℃冰箱進(jìn)行甘油管保存。

1.3.2 菌株的篩選

痤瘡丙酸桿菌的培養(yǎng):挑取RCM平板上痤瘡丙酸桿菌單菌落,接種至RCM液體培養(yǎng),37 ℃厭氧培養(yǎng)48 h至對(duì)數(shù)末期,用培養(yǎng)基調(diào)至其OD600值為1,用于菌株篩選實(shí)驗(yàn)。

初篩:采用瓊脂擴(kuò)散法進(jìn)行菌株抑菌活性的檢測(cè),參照文獻(xiàn)方法[11],稍作修改。用鑷子夾取牛津杯置于RCM固體平板上,上層傾注含5%(體積分?jǐn)?shù))痤瘡丙酸桿菌的RCM培養(yǎng)基10 mL。待凝固后夾出牛津杯,形成樣孔,向樣孔內(nèi)加入100 μL各菌株發(fā)酵液,置37 ℃厭氧培養(yǎng)48 h后,測(cè)量抑菌圈直徑。每個(gè)實(shí)驗(yàn)組設(shè)置3個(gè)平行,取平均值。選取抑菌圈直徑較大的菌株進(jìn)行復(fù)篩。

復(fù)篩:使用菌株過膜發(fā)酵上清液進(jìn)行復(fù)篩。菌株發(fā)酵液8 000 r/min離心10 min去除菌體保留上清液,上清液用0.22 μm濾膜進(jìn)行除菌處理,得到菌株過膜發(fā)酵上清液,采用瓊脂擴(kuò)散法測(cè)定抑菌圈直徑,條件與初篩一致。選取抑菌活性最高的菌株進(jìn)行鑒定及后續(xù)分析。

1.3.3 菌株的鑒定

形態(tài)學(xué)觀察:對(duì)菌株HA2進(jìn)行平板劃線,LB平板置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)12 h,觀察并記錄菌落形態(tài)特征。同時(shí)對(duì)菌株HA2進(jìn)行革蘭氏染色,用光學(xué)顯微鏡進(jìn)行觀察。

生化特征:參照《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》[12],對(duì)菌株HA2進(jìn)行生化實(shí)驗(yàn)。

分子生物學(xué)特征:使用細(xì)菌基因組抽提試劑盒提取菌株HA2基因組DNA,以細(xì)菌16S rDNA通用引物27F(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)和1492R(5′-GGTTACCTTGT TACGACTT-3′)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR產(chǎn)物經(jīng)電泳驗(yàn)證并純化回收后送往上海生工生物工程有限公司進(jìn)行測(cè)序。測(cè)序序列提交至NCBI進(jìn)行BLAST比對(duì),獲取同源性較高的菌株的16S rDNA序列,通過軟件MEGA-7.0進(jìn)行序列相似性分析,并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.3.4 菌株的培養(yǎng)基優(yōu)化

初始培養(yǎng)基的篩選:用接種環(huán)挑取平板上HA2單菌落,接種至LB培養(yǎng)基,37 ℃、220 r/min培養(yǎng)24 h得到拮抗菌株HA2種子液,種子液以3%的比例接種于50 mL的初始培養(yǎng)基 (LB、NB、BPY、Landy、TSB、NYD培養(yǎng)基),30 ℃、220 r/min培養(yǎng)48 h,測(cè)定其過膜發(fā)酵上清液抑菌圈直徑,選定最佳初始培養(yǎng)基。

培養(yǎng)基成分優(yōu)化:以最佳初始培養(yǎng)基LB作為出發(fā)培養(yǎng)基,培養(yǎng)基的成分和濃度作為初始水平,進(jìn)行培養(yǎng)基成分優(yōu)化。選擇不同的碳源(葡萄糖、蔗糖、半乳糖、麥芽提取物、果糖、糊精、可溶性淀粉)替換LB培養(yǎng)基中的碳源(酵母粉)確定最佳碳源種類,對(duì)碳源質(zhì)量濃度(2.5～25 g/L麥芽提取物)進(jìn)行優(yōu)化,確定最佳碳源濃度。在最佳碳源基礎(chǔ)上,選擇不同氮源種類(大豆分離蛋白、硫酸銨、脫脂奶粉、酪蛋白水解物、無氨基酵母氮源、牛肉膏和玉米漿)替換LB培養(yǎng)基中氮源(胰蛋白胨)確定最佳氮源種類,對(duì)氮源質(zhì)量濃度(5～30 g/L胰蛋白胨)進(jìn)行優(yōu)化,確定最佳氮源濃度。在最佳碳氮源的基礎(chǔ)上,選擇不同種類無機(jī)鹽[MgSO4·7H2O、ZnSO4、CaCl2、KCl、FeSO4·7H2O、CuSO4·5H2O、Fe2(SO4)3·7H2O]替換LB培養(yǎng)基中無機(jī)鹽(NaCl),確定最佳無機(jī)鹽種類,對(duì)無機(jī)鹽質(zhì)量濃度(5～40 g/L CaCl2)進(jìn)行優(yōu)化,確定最佳無機(jī)鹽濃度。以上培養(yǎng)基優(yōu)化實(shí)驗(yàn)中的發(fā)酵條件均與初始培養(yǎng)基的篩選實(shí)驗(yàn)條件保持一致。

正交試驗(yàn):以最佳碳源、氮源和無機(jī)鹽為自變量,進(jìn)行正交試驗(yàn)。選用三因素三水平試驗(yàn)正交表進(jìn)行,因素及水平設(shè)計(jì)見表1。

表1 正交試驗(yàn)的因素和水平

1.3.5 菌株的發(fā)酵條件優(yōu)化

挑取平板上HA2單菌落,接種至LB培養(yǎng)基,37 ℃、220 r/min培養(yǎng)24 h得到菌株HA2種子液。種子液按照3%的比例接入優(yōu)化后培養(yǎng)基中,30 ℃,220 r/min搖床培養(yǎng)。對(duì)發(fā)酵時(shí)間(12～96 h)、發(fā)酵溫度(20～40 ℃)、發(fā)酵液初始pH值(5.0～9.0)、接種量(1%～9%)、裝液量(10%～60%) 進(jìn)行優(yōu)化。后續(xù)發(fā)酵條件優(yōu)化實(shí)驗(yàn)均基于上一個(gè)最佳發(fā)酵條件的基礎(chǔ)上進(jìn)行,測(cè)定菌株HA2過膜發(fā)酵上清液的抑菌活性。

1.3.6 四環(huán)素效價(jià)曲線及發(fā)酵優(yōu)化驗(yàn)證

分別配制質(zhì)量濃度為8、16、32、64、128 μg/mL四環(huán)素溶液并使用0.22 μm濾膜進(jìn)行除菌處理,按照1.3.2 節(jié)方法測(cè)定不同濃度四環(huán)素溶液對(duì)痤瘡丙酸桿菌的抑菌活性。以抑菌圈直徑大小為縱坐標(biāo),以四環(huán)素效價(jià)的lg對(duì)數(shù)值為橫坐標(biāo)(四環(huán)素的效價(jià)為950 U/mg),建立四環(huán)素效價(jià)曲線。

接種環(huán)挑取平板上HA2單菌落,接種至LB培養(yǎng)基,37 ℃、220 r/min培養(yǎng)24 h得到菌株HA2種子液。將種子液分別接種至優(yōu)化前和優(yōu)化后的培養(yǎng)基中,對(duì)菌株HA2進(jìn)行優(yōu)化前和優(yōu)化后培養(yǎng)條件下的發(fā)酵,比較兩種條件下菌株HA2過膜發(fā)酵上清液的抑菌活性,并進(jìn)行效價(jià)換算。

1.3.7 菌株體外安全性評(píng)價(jià)

溶血性測(cè)定:參照文獻(xiàn)[13]方法,稍作修改。吸取5 μL菌株HA2菌懸液點(diǎn)板于血平板上,以金黃色葡萄球菌ATCC 6538作為陽性對(duì)照,以植物乳桿菌D8作為陰性對(duì)照,LB培養(yǎng)基作為空白對(duì)照。37 ℃培養(yǎng)12～18 h,觀察菌落周圍是否產(chǎn)生溶血圈。若菌落四周出現(xiàn)透明溶血環(huán),為β-溶血,若菌落四周出現(xiàn)草綠色環(huán),為α-溶血;若菌落四周無任何變化,則為γ-溶血,即不溶血。

耐藥性測(cè)定:采用藥敏紙片擴(kuò)散法[14]測(cè)定菌株HA2對(duì)各類抗生素的耐藥性?？股胤N類為氯霉素、卡那霉素、鏈霉素、氨芐青霉素、慶大霉素、紅霉素、強(qiáng)力霉素、四環(huán)素。

耐藥質(zhì)粒檢測(cè)及耐藥基因定位:參照文獻(xiàn)[15]方法,稍作修改。使用小型質(zhì)粒抽提試劑盒對(duì)菌株HA2進(jìn)行質(zhì)粒提取,以不含質(zhì)粒的大腸桿菌DH5α為陰性對(duì)照,以含質(zhì)粒的大腸桿菌pESC-URA為陽性對(duì)照,使用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)質(zhì)粒存在情況。參照文獻(xiàn)方法中的引物設(shè)計(jì)[16],以菌株HA2的DNA為模板,根據(jù)表2的引物進(jìn)行紅霉素耐藥基因ermD/K1、ermD/K2和鏈霉素耐藥基因str的擴(kuò)增,用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物,判定有無特異性目的條帶。

表2 耐藥基因引物信息

多種毒力基因的PCR檢測(cè):采用劉純等[17]的方法,參考文獻(xiàn)中芽孢桿菌毒力基因的引物信息。分別提取菌株HA2和陽性對(duì)照組蠟樣芽孢桿菌的基因組,以DNA為模板,根據(jù)特定的引物分別特異性擴(kuò)增溶血性腸毒素hbl(hblA、hblB、hblC、hblD)基因、非溶血性腸毒素nhe(nheA、nheB、nheC)基因、腸毒素T(bceT)基因、細(xì)胞毒素K(cytK)、和嘔吐毒素(ces)等10種毒力基因,用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物,引物信息見表3。

表3 毒力基因引物信息

1.3.8 數(shù)據(jù)處理

用SPSS 26.0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析,其中差異顯著性通過單因素方差分析,置信度為95% (P<0.05),采用分子生物學(xué)軟件MEGA-7.0構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株的篩選與鑒定

從酸菜樣品中共分離純化出187株菌株。通過瓊脂擴(kuò)散法篩選得到12株抑菌圈直徑在20 mm以上的菌株,其中菌株HA2拮抗效果最佳,過膜發(fā)酵上清液抑菌圈直徑達(dá)到35 mm,選取菌株HA2進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。對(duì)菌株HA2進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察,結(jié)果顯示,菌株HA2的菌落形態(tài)呈圓形、邊緣不規(guī)則,表面光滑,白色不透明 (圖1-a);革蘭氏染色呈陽性,菌體呈桿狀 (圖1-b)。

a-菌落形態(tài);b-革蘭氏染色(10×100)

生化鑒定結(jié)果表明菌株HA2兼性厭氧生長,不耐受100 g/L NaCl,淀粉水解、V-P實(shí)驗(yàn)、接觸酶實(shí)驗(yàn)、硝酸鹽還原結(jié)果均呈陽性、苯丙氨酸脫氨酶、甲基紅、水解明膠、丙酸鹽和檸檬酸鹽利用結(jié)果為陰性。菌株HA2可利用葡萄糖、甘露糖、半乳糖、蔗糖、麥芽糖,不能利用木糖、果糖。在糖醇發(fā)酵產(chǎn)酸實(shí)驗(yàn)中麥芽糖、蔗糖、甘露糖、阿拉伯糖、葡萄糖、甘露醇結(jié)果呈陽性,半乳糖、山梨糖、乳糖結(jié)果為陰性 (表4)。

表4 菌株HA2的生化實(shí)驗(yàn)

將菌株HA2的16S rDNA基因進(jìn)行序列分析及相似度比對(duì),構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(圖2)。菌株HA2(登錄號(hào)為OQ430809)與海恩西芽孢桿菌(Bacillushaynesii)NRRL B-41327(登錄號(hào)為NR_157609)在同一分支上,且相似性最高,達(dá)99.65%。結(jié)合形態(tài)學(xué)和菌株的生理生化特征,初步鑒定菌株HA2為海恩西芽孢桿菌。根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道,芽孢桿菌可以產(chǎn)生多種抗菌物質(zhì),例如細(xì)菌素、抗菌脂肽、聚酮類物質(zhì)等[18]。海恩西芽孢桿菌HA2過膜發(fā)酵上清液抑菌圈直徑可達(dá)35 mm,抗菌效果顯著,推測(cè)其可以產(chǎn)生至少一種以上的抑菌物質(zhì),具有一定的開發(fā)潛力。

圖2 菌株HA2基于16S rDNA序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹

2.2 培養(yǎng)基優(yōu)化

初始培養(yǎng)基篩選實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,以LB為初始培養(yǎng)基時(shí)抑菌圈直徑最大,為28.50 mm。以LB為出發(fā)培養(yǎng)基,進(jìn)行培養(yǎng)基成分優(yōu)化。以酵母粉為對(duì)照,篩選不同的碳源。結(jié)果顯示,最佳碳源為麥芽提取物。當(dāng)質(zhì)量濃度為15 g/L時(shí),抑菌圈直徑已達(dá)到最佳(圖3-a、圖3-b);在最佳碳源的基礎(chǔ)上進(jìn)行氮源種類優(yōu)化,圖3-c結(jié)果顯示,最佳氮源為胰蛋白胨,當(dāng)胰蛋白胨質(zhì)量濃度為25 g/L時(shí),抑菌圈直徑最大,為38.75 mm(圖3-d);在此基礎(chǔ)上,進(jìn)一步進(jìn)行無機(jī)鹽種類優(yōu)化。結(jié)果顯示,除Fe2(SO4)3·7H2O以外,其余無機(jī)鹽均能被菌株HA2利用,其中CaCl2的拮抗促進(jìn)作用最明顯,質(zhì)量濃度為5 g/L時(shí),抑菌圈直徑達(dá)到42.16 mm(圖3-e、圖3-f)。

a-碳源種類;b-麥芽提取物濃度;c-氮源種類;d-胰蛋白胨濃度;e-無機(jī)鹽種類;f-CaCl2濃度

正交優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果顯示,最佳培養(yǎng)基配方為A2B3C1,即麥芽提取物(15 g/L)、胰蛋白胨(30 g/L)和CaCl2(2.5 g/L),此時(shí)抑菌圈直徑達(dá)到(43.33±1.15) mm。極差分析的結(jié)果顯示,對(duì)菌株HA2抑菌活性的影響由大到小的順序?yàn)锽>A>C,因素B即胰蛋白胨濃度,對(duì)菌株HA2抑菌活性影響最為顯著(表5)。

表5 正交優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果

2.3 發(fā)酵條件優(yōu)化

發(fā)酵優(yōu)化是有效提高菌株抑菌活性的方式之一。葉云峰等[19]通過單因素試驗(yàn)和正交優(yōu)化,將枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis) B47無菌濾液抑菌圈直徑從15.23 mm提升至27.67 mm。高宇潔等[20]采用單因素試驗(yàn)和響應(yīng)面分析法優(yōu)化伯氏致病桿菌(Xenorhabdusbovienii)445培養(yǎng)條件,將抑菌效價(jià)提高39.16%。為此,本研究從5個(gè)方面(發(fā)酵時(shí)間、發(fā)酵溫度、發(fā)酵液初始pH值、接種量、裝液量)對(duì)菌株HA2發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化。如圖4所示,菌株HA2在12 h時(shí)開始產(chǎn)生抑菌物質(zhì),并在72 h時(shí)達(dá)到最高,此時(shí)抑菌圈直徑為48.33 mm(圖4-a)。35 ℃培養(yǎng)時(shí),HA2的無細(xì)胞發(fā)酵上清液抑菌活性最強(qiáng)(圖4-b)。在pH值為5時(shí),抑菌活性達(dá)到最大(圖4-c),為最佳發(fā)酵液初始pH。在3%和9%的接種量的條件下,抗菌活性均達(dá)到最佳,考慮到實(shí)驗(yàn)成本,選擇3%為最佳接種量(圖4-d)。裝液量為50%時(shí)最佳,抑菌圈直徑達(dá)到50.00 mm(圖4-e)。綜上,菌株HA2的最佳發(fā)酵培養(yǎng)基為麥芽提取物15 g/L、胰蛋白胨30 g/L和CaCl22.5 g/L,最佳發(fā)酵條件為發(fā)酵溫度35 ℃、發(fā)酵液初始pH 5、接種量3%、裝液量50%和發(fā)酵時(shí)間72 h。

a-發(fā)酵時(shí)間;b-溫度;c-pH;d-接種量;e-裝液量

2.4 發(fā)酵優(yōu)化驗(yàn)證

四環(huán)素是痤瘡丙酸桿菌常用抑制藥物,根據(jù)不同濃度四環(huán)素溶液對(duì)痤瘡丙酸桿菌抑菌活性的不同建立四環(huán)素效價(jià)曲線。圖5-a結(jié)果顯示,抑菌圈直徑與四環(huán)素效價(jià)的方程為y=20.131x-48.718,R2達(dá)到0.993 9,效價(jià)曲線建立成功。對(duì)菌株HA2進(jìn)行發(fā)酵優(yōu)化驗(yàn)證,圖5-b結(jié)果顯示,優(yōu)化后HA2菌株發(fā)酵過膜上清液抑菌圈直徑(53 mm)大于優(yōu)化前發(fā)酵過膜上清液抑菌圈直徑(38 mm)。根據(jù)四環(huán)素效價(jià)曲線進(jìn)行換算,優(yōu)化前菌株HA2發(fā)酵過膜上清液效價(jià)為20 308.6 U,優(yōu)化后效價(jià)為112 927.6 U,效價(jià)提升5.56倍。結(jié)果表明,優(yōu)化后的發(fā)酵培養(yǎng)基組分和培養(yǎng)條件更加有利于菌株HA2合成抑菌物質(zhì)。

a-四環(huán)素效價(jià)曲線;b-發(fā)酵優(yōu)化驗(yàn)證

2.5 體外安全評(píng)價(jià)

2.5.1 菌株溶血性

溶血性是評(píng)價(jià)菌株安全性的重要指標(biāo)之一。菌株溶血性結(jié)果如圖6所示,陽性對(duì)照組的金黃色葡萄球菌ATCC 6538周圍產(chǎn)生透明溶血環(huán),為β-溶血。陰性對(duì)照組的植物乳桿菌D8和空白對(duì)照組的LB培養(yǎng)基無透明圈,為γ-溶血,即不溶血。菌株HA2菌落周圍無透明圈,表明菌株HA2為γ-溶血,無溶血性。

圖6 菌株的溶血性檢測(cè)

2.5.2 菌株耐藥性

耐藥性檢測(cè)結(jié)果如表6所示,菌株HA2對(duì)大多數(shù)抗生素敏感,對(duì)氯霉素、卡那霉素、慶大霉素、強(qiáng)力霉素高度敏感,抑菌圈直徑在20 mm以上;對(duì)氨芐青霉素和四環(huán)素中度敏感、抑菌圈直徑在15～20 mm;對(duì)鏈霉素和紅霉素耐藥,抑菌圈直徑在15 mm以下。

表6 耐藥性測(cè)定結(jié)果

2.5.3 耐藥質(zhì)粒和耐藥基因檢測(cè)

耐藥質(zhì)粒檢測(cè)結(jié)果如圖7所示,菌株HA2的泳道3沒有出現(xiàn)任何條帶,表明菌株HA2無質(zhì)粒存在(圖7-a)。對(duì)菌株HA2所耐藥的鏈霉素、紅霉素的抗性基因進(jìn)行檢測(cè),發(fā)現(xiàn)鏈霉素抗性基因str和紅霉素抗性基因ermD/K1與ermD/K2在菌株HA2的基因組DNA上(圖7-b)。

a-耐藥質(zhì)粒檢測(cè)(M1-10 000 bp的DNA Marker;1-含有pESC-URA質(zhì)粒的大腸桿菌;2-不含質(zhì)粒的大腸桿菌;3-菌株HA2);b-耐藥基因定位(M2-2 000 bp的DNA Marker;4-鏈霉素抗性基因str;5-紅霉素抗性基因ermD/K1;6-紅霉素抗性基因ermD/K2)

耐藥性是目前臨床所面臨的重要難題之一。據(jù)報(bào)道,芽孢桿菌可通過質(zhì)粒等移動(dòng)元件的方式轉(zhuǎn)移自身耐藥基因,存在風(fēng)險(xiǎn)[21]。因此,對(duì)菌株進(jìn)行質(zhì)粒檢測(cè)和耐藥基因定位具有必要性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,菌株HA2雖然對(duì)鏈霉素和紅霉素耐藥,但菌株本身并不含有質(zhì)粒,且鏈霉素的抗性基因str及紅霉素抗性基因ermD/K1與ermD/K2位于菌株HA2的染色體上,保證了菌株HA2在耐藥基因轉(zhuǎn)移方面的低風(fēng)險(xiǎn)。

2.5.4 毒力基因的PCR檢測(cè)

芽孢桿菌中是否攜帶毒力基因是判斷菌株安全性的另一個(gè)重要方面。經(jīng)檢測(cè),菌株HA2無常見毒力基因,包括溶血性腸毒素hbl(hblA、hblB、hblC、hblD)基因、非溶血性腸毒素nhe(nheA、nheB、nheC)基因、腸毒素T(bceT)基因、細(xì)胞毒素K(cytK)、和嘔吐毒素(ces)等10種毒力基因(圖8-a),陽性對(duì)照組的蠟樣芽孢桿菌檢測(cè)到nheC、hblD和cytK基因(圖8-b)。在毒力基因方面,可初步判斷菌株HA2較安全。

M-2 000 bp的DNA Marker;1-nheA;2-nheB;3-nheC;4-hblA;5-hblB;6-hblC;7-hblD;8-bceT;9-cytK;10-ces

3 結(jié)論

本研究從酸菜樣品中篩選到1株能高效拮抗痤瘡丙酸桿菌的海恩西芽孢桿菌HA2,其過膜發(fā)酵上清液抑菌圈直徑可達(dá)35 mm。通過培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件的優(yōu)化,菌株HA2過膜發(fā)酵上清液抑菌圈直徑從38 mm提升至53 mm。根據(jù)四環(huán)素效價(jià)曲線進(jìn)行換算,效價(jià)從20 308.6 U提升至112 927.6 U,提升5.56倍。確定了菌株HA2的最佳發(fā)酵條件:培養(yǎng)基為麥芽提取物15 g/L、胰蛋白胨30 g/L、CaCl22.5 g/L;培養(yǎng)條件為接種量3%、裝液量50%、發(fā)酵液初始pH 5、發(fā)酵溫度35 ℃和發(fā)酵時(shí)間72 h。從溶血性、耐藥性和是否含有毒力基因三方面對(duì)菌株HA2進(jìn)行體外安全評(píng)價(jià)。結(jié)果表明,菌株HA2不具有溶血性,耐藥基因轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)較低,無毒力基因。因此,可初步判斷菌株HA2具有一定的生物安全性。菌株HA2能高效拮抗痤瘡丙酸桿菌,并通過體外安全評(píng)價(jià)。因此,在痤瘡治療方面具有一定的應(yīng)用前景。