干酪乳酪桿菌Zhang在酸和低溫脅迫下“活的非可培養”態的誘導研究

代利霞,馬學波,王會瑩,劉春芳,薄曉宇,包秋華

(內蒙古農業大學,乳品生物技術與工程教育部重點實驗室,農業農村部奶制品加工重點實驗室,內蒙古 呼和浩特, 010018)

有些細菌在不利于生存的環境下,可能會進入活的非可培養(viable but non-culturable,VBNC)狀態[1]。細菌處于該生理狀態下,不能在常規培養基上生長繁殖,但仍然保持一定的代謝活性,當給予適宜的條件時,又會恢復到可培養狀態,被認為是細菌躲避不利環境的一種特殊存活形式[1-2]。細菌進入VBNC態后細胞形態特征會發生變化,有的細胞表面出現褶皺,菌體體積變小或菌體聚集等變化[3-4]。目前報道能進入VBNC態的微生物有100多種[1],如大腸桿菌[5]、鼠傷寒沙門氏菌[6]、金黃色葡萄球菌[7]、短乳桿菌[8]和德式乳桿菌保加利亞亞種ND02[3]等。大多數都為革蘭氏陰性致病菌,少數為革蘭氏陽性非致病菌。不同細菌在不同條件下VBNC態的誘導、檢測方法、形成和復蘇機理等研究方向被深入探究[9]。

乳酸菌(lactic acid bacteria,LAB)是能利用可發酵碳水化合物產生大量乳酸的一類革蘭氏陽性細菌的統稱[10]。乳酸菌在發酵過程中產生大量酸性代謝產物,使發酵液pH值降低,抑制了致病菌生長,延長了產品貨架期,提供了誘人風味[11]。同時,乳酸的累積也一定程度抑制了乳酸菌的生長,所以酸脅迫是乳酸菌發酵后期面臨的最大不利生存環境之一。乳酸菌在生產、貯藏過程中,除酸脅迫外,還不可避免地受到低溫等多種不利生長的環境脅迫[12-13]。在這些不利生存的條件下,有些乳酸菌可能會進入VBNC態,目前報道能進入VBNC態的乳酸菌有腸球菌、雙歧桿菌、保加利亞乳桿菌、短乳桿菌等[1,3,8]。乳酸菌進入VBNC態有利有弊,如果啤酒中存有雜菌短乳桿菌VBNC態,一旦復蘇會使其產品質量不穩定[8]。也可以將不利變成有利,如果乳酸菌從VBNC態轉為可培養態,將會增加活菌數量、利于挖掘各種生境中大量不可培養的乳酸菌資源等[9]。

干酪乳酪桿菌Zhang(LacticaseibacilluscaseiZhang)是一株分離篩選自內蒙古地區傳統酸馬奶中的具有耐酸、耐膽鹽、改善腸道菌群、提高免疫力等多種優良特性的益生菌,已被廣泛應用到發酵乳、飼料和醫藥等領域[14-15]。益生乳酸菌在酸脅迫下進入VBNC態鮮有報道。由于在實驗室條件下誘導細菌VBNC態時,常常采用多個條件復合誘導[16],所以本研究以L.caseiZhang為研究對象,在酸和低溫復合條件下脅迫,定期取樣檢測,通過對誘導過程中菌體細胞的活性、細胞完整性及形態的測定,初步探究L.caseiZhang是否能夠在酸和低溫脅迫條件下形成VBNC態。

1 材料與方法

1.1 菌株來源

干酪乳酪桿菌Zhang(LacticaseibacilluscaseiZhang),由內蒙古農業大學乳品生物技術與工程教育部重點實驗室保藏并提供。

1.2 主要試劑

MRS培養基(pH 6.8,g/L):無水葡萄糖20.0、牛肉膏10.0、大豆蛋白胨10.0、酵母浸粉5.0、無水乙酸鈉5.0、無水磷酸氫二鉀2.0、檸檬酸鈉2.0、七水硫酸鎂0.2、五水硫酸錳0.05,混和均勻,于121 ℃下滅菌15 min。

PBS緩沖溶液(0.01 mol/L,pH 7.2):氯化鈉0.8 g,磷酸二氫鉀0.02 g,磷酸氫二鈉0.115 g,100 mL蒸餾水、充分攪拌至溶解后于121 ℃滅菌15 min。

食品級乳酸購自天津鑫鉑特有限公司;LIVE/DEAD?BacLightTMBacterial Viability試劑盒(L7012)購自美國Molecular probes公司。

1.3 儀器與設備

DHP-9272恒溫培養箱,上海一恒科技有限公司;AR2202CN電子天平, 奧豪斯儀器上海有限公司;R5810高速冷凍離心機,德國Eppendorf公司;DMi8熒光顯微鏡、DM4000B熒光顯微鏡,德國Leica公司;CytoFLEX流式細胞儀,美國貝克曼庫爾特有限公司;GE4852T PCR儀,杭州 BIO-GENER公司。

1.4 實驗方法

1.4.1L.caseiZhang VBNC態的誘導

將L.caseiZhang接種于5 mL MRS液體培養基中,在37 ℃恒溫靜置培養,培養3代,擴培后鏡檢為純的L.caseiZhang后,取對數生長末期的菌懸液4 000×g離心5 min,棄上清液,用PBS緩沖溶液洗滌2次。將菌液按2%的接種量接種到5種不同pH值(用乳酸調節MRS液體培養基pH值至2.5、3、4、5、6)的誘導液中,置于4 ℃進行酸和低溫脅迫,不同時間點取樣,采用3種方法檢測細胞活性和完整性。

1.4.2L.caseiZhang的可培養數檢測

在誘導L.caseiZhang VBNC態過程中階段性取0.5 mL樣品,用4.5 mL的滅菌生理鹽水按10倍梯度稀釋,選擇合適梯度采用平板傾注法利用MRS固體培養基進行可培養菌數計數。每次試驗3個平行。

1.4.3L.caseiZhang細胞完整性的檢測

LIVE/DEAD BacLightTM試劑盒已被廣泛應用在細菌完整性的檢測中。將試劑盒中兩種染料SYTO 9和碘化丙啶染料(propidium iodide,PI)各稀釋至濃度0.1 mmol/L和0.2 mmol/L于-20 ℃保存,取1 mL的液體樣品離心,用PBS緩沖液洗2次,并用200 μL PBS緩沖液回溶,加入PI和 SYTO 9各5 μL,振蕩均勻后避光染色15 min。在熒光顯微鏡下觀察其細胞完整性,有完整細胞膜結構(活的可培養和VBNC態)的細胞呈綠色,細胞膜結構被破損(死細胞)的細胞呈紅色。

1.4.4L.caseiZhang細胞活性檢測

利用流式細胞儀與熒光染料相結合的非培養方法檢測L.caseiZhang在不同脅迫下的細胞活性。取1 mL的誘導菌懸液4 000×g離心5 min,棄上清液,用PBS緩沖液洗滌2次后回溶,將菌濃度稀釋至106CFU/mL左右,然后加入兩種熒光染料(0.1 mmol/L SYTO 9和0.2 mmol/L PI)各10 μL,充分混合,避光染色15 min后,采用CytoFLEX流式細胞儀檢測其細胞活性。

1.4.5L.caseiZhang VBNC態純度鑒定與細胞形態觀察

為避免在誘導過程中進行階段性取樣時雜菌污染而影響檢測結果,每次實驗都做革蘭氏染色觀察其細胞形態,并每隔一段時間取適量樣本,采用16S rDNA序列分析法進行細菌鑒定以檢驗樣本純度。

2 結果與分析

2.1 L.casei Zhang可培養活菌數的變化

L.caseiZhang在不同pH MRS液體培養基誘導VBNC態過程中可培養細胞數的變化如圖1所示。

圖1 不同脅迫條件下L.casei Zhang可培養細胞數的變化

由圖1可知,不同脅迫條件下L.caseiZhang的可培養數隨著誘導時間而降低。當細胞被置于pH 2.5和pH 3的MRS液體培養基時,菌體的可培養數分別在第3天和第7天降為0;當L.caseiZhang被置于pH 4 的MRS液體培養基時,菌體的可培養數先增加后降低,從初始3.4×107CFU/mL先升高到3 d的1.36×108CFU/mL,隨后下降,其中3～28 d內呈緩慢下降趨勢,28 d后下降速度加快,直到120 d活菌數降為0;當L.caseiZhang被置于pH 5和pH 6的誘導培養基中,菌體的可培養數先上升后下降,下降速度較pH 4條件緩慢。

2.2 L.casei Zhang細胞完整性檢測

VBNC態的細胞膜保持著完整性和被檢測性[17]。LIVE/DEAD BacLightTM試劑盒結合熒光顯微鏡在檢測細菌完整性方面已被廣泛應用[18]。熒光染料SYTO 9可以透過所有細胞膜與DNA結合,在熒光顯微鏡下呈綠色熒光;而熒光染料PI只能透過破損的細胞膜與SYTO 9競爭結合位點,在熒光顯微鏡下產生紅色熒光[19]。當平板菌落計數法檢測的可培養菌數為0,且熒光顯微鏡視野中仍然存在完整性的綠色熒光細胞時,認為菌體在誘導條件下可以獲得VBNC態[20]。

L.caseiZhang在可培養數為0時的細胞完整性部分檢測結果如圖2所示。L.caseiZhang被pH 2.5和pH 3的MRS液體培養基處理第7天,在熒光顯微鏡視野中細胞全部均為紅色,如圖2-a所示,說明在此條件下細胞直接進入了死亡態,未進入VBNC態。L.caseiZhang被pH 4的MRS液體培養基處理120 d時,從圖2-b可以看出當可培養菌數為0時,熒光顯微鏡視野中存在綠色細胞,說明綠色細胞是VBNC態細胞,在此誘導條件下,L.caseiZhang能夠進入VBNC態。

a-死菌;b-pH 4.0

2.3 流式細胞術檢測L.casei Zhang細胞活性

近幾年,利用流式細胞儀(flow cytometer, FCM)與熒光染料相結合的非培養方法在檢測細胞活性方面被廣泛應用,常用的檢測細菌活性的熒光染料有PI與SYTO 9,當采用SYTO 9處理樣品時,SYTO 9會使具有完整細胞膜的細胞發出綠色熒光,當采用PI處理樣品時,PI只能透過死菌發出紅色熒光[21-22]。

在不同pH的MRS液體培養基誘導L.caseiZhang VBNC態過程中,采用流式細胞儀檢測L.caseiZhang的細胞活性,結果如圖3所示。圖3是以FITC(SYTO 9)為x軸,PE(PI)為y軸。其中Q1為未染色區域,Q2為死菌區域,Q3為活菌區域,Q4為VBNC態區域。

a-空白對照組;b-pH 2.5;c-pH 3.0;d-pH 4.0;e-pH 5.0;f-pH 6.0

L.caseiZhang被pH 2.5和pH 3的MRS液體培養基分別誘導第3天和第7天時,大部分細胞處于死菌區域(圖3-b、圖3-c),表明細胞未進入VBNC態,而是直接進入死亡;L.caseiZhang被pH 5和pH 6的MRS液體培養基誘導120 d,Q3區域細胞顆粒數分別為88.19%和75.40% (圖3-e、圖3-f),表明處于活性狀態的細胞大于75%,結合圖1結果,推斷這2個條件和120 d的時間節點未能獲得VBNC態。

采用流式細胞術檢測L.caseiZhang被pH 4的MRS液體培養基誘導120 d的結果見圖3-d,Q4區域細胞顆粒數(VBNC態)占59.18%,Q2區域細胞顆粒數占14.18%,說明細胞此時大部分處于VBNC態,少數細胞進入了死亡態。該結果和前文的可培養數與細胞膜完整性結果相結合,完全符合細胞進入VBNC態的特征。PALOMA等[23]通過使用流式細胞術也檢測到了大量常規平板計數法無法檢測到的阪崎腸桿菌受損細胞,并且能夠將VBNC態細胞與活細胞和死細胞區分開。

綜上所述,L.caseiZhang在pH 4的MRS液體培養基作為誘導液時可以獲得VBNC態。

2.4 L.casei Zhang VBNC態的純度鑒定與細胞形態觀察

2.4.1 純度鑒定

為了排除誘導過程中對L.caseiZhang進行階段性取樣時引入雜菌污染菌體影響檢測結果。部分實驗樣本采用16S rDNA進行細菌鑒定。所測樣本的16S rDNA序列單一、無雙峰,經BLAST(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)比對,與L.caseiZhang的基因組序列同源性為100%,說明菌體在誘導過程中未發生污染。

2.4.2 細胞形態觀察

采用顯微鏡觀察L.caseiZhang正常態(對數期細胞)和VBNC態(酸和低溫誘導120 d的細胞)細胞形態,革蘭氏染色結果如圖4所示。從圖4-a可以看到L.caseiZhang對數期細胞呈直桿狀且成鏈狀排列;L.caseiZhang VBNC態細胞的細胞長度變短變彎曲,且大部分細胞呈聚式排列(圖4-b)。這一結果與許多研究[24-25]的結果相似,其中金磊等[25]在MRS液體培養基中-20 ℃有氧條件誘導植物乳桿菌,發現進入VBNC態細胞的體積變小,菌體較聚集,且細胞結構完整。

a-L.casei Zhang正常態細胞;b-L.casei Zhang VBNC態細胞

3 結論與討論

本研究通過低溫和酸的不同條件對L.caseiZhang進行VBNC態誘導,誘導過程中采用平板計數法、熒光顯微鏡觀察法和流式細胞術3種方法對L.caseiZhang的細胞活性和完整性進行檢測。結果表明L.caseiZhang在pH 4的MRS液體培養基4 ℃低溫脅迫菌體120 d時能夠形成VBNC態。革蘭氏染色觀察到VBNC態細胞長度變短變彎曲。

乳酸菌具有很高的耐酸性,在低濃度的酸脅迫下,為了維持細胞內的酸平衡,保護細胞免受損傷,細胞會產生許多應激反應來應對酸脅迫,譬如通過改變細胞膜通透性、胞內pH和產生應激蛋白等[26-27]。本研究L.caseiZhang在pH 4的低溫脅迫條件下,細胞會通過進入VBNC態躲避酸脅迫。研究發現乳酸可能也是一個促進乳酸菌進入VBNC態的條件,可能由于乳酸是一種弱酸,其pKa為3.86,大多數弱酸是以分子狀態存在于pKa的酸性中,分子態的弱酸很容易通過細胞膜進入細胞,隨著乳酸濃度的增加,細胞內游離有機陰離子的積累可能會由于滲透壓和壓力的增加而導致細胞受損[28]。所以導致L.caseiZhang進入了VBNC態。該研究為益生菌L.caseiZhang進入VBNC態的條件及菌體活力提升提供了一定的參考依據。