帕金森病患者血漿外泌體中miR-331-5p的表達及臨床意義

馬 娟 馬建華 邵 華 雷 晶

新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院，新疆 烏魯木齊 830000

帕金森病（Parkinson’s disease，PD）是臨床中常見的神經(jīng)退行性疾病，其發(fā)病率較高，與年齡、環(huán)境、遺傳等眾多因素相關(guān)，主要臨床表現(xiàn)為認知損害、運動障礙等［1］。PD 患者出現(xiàn)認知損害后，極易進展為PD 性癡呆，其是腦皮質(zhì)、腦皮質(zhì)下性癡呆的一種，若臨床工作者對PD 患者病情及進展及早評估并干預(yù)，對控制患者病情、降低PD 性癡呆發(fā)病率具有重要意義［2］。PD 患者病情進展至癡呆的過程中，氧化應(yīng)激反應(yīng)發(fā)揮重要作用，其與神經(jīng)元慢性炎癥及線粒體損傷密切相關(guān)，但具體機制尚未闡明，故其預(yù)防和病情控制的時效性仍不理想。最近，有學(xué)者證實內(nèi)源性非編碼小分子RNA 通過抑制或促進靶基因調(diào)節(jié)目標因子轉(zhuǎn)錄水平，在神經(jīng)退行性疾病中發(fā)揮重要作用［3］。有研究發(fā)現(xiàn)，在PD 患者血漿外泌體中微小 RNA-331-5p（microRNA-331-5p，miR-331-5p）普遍高表達，可能與機體氧化應(yīng)激及炎癥反應(yīng)密切相關(guān)，但具體機制及量化關(guān)系并未闡明［4］。鑒于此，本研究分析PD 患者血漿外泌體中miR-331-5p 的表達及臨床意義，以期為PD 病情的及早評估診療、減慢病情進展提供新方向。

1 對象與方法

1.1 研究對象選取于新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院2020-01—2022-12 診治的PD 患者78 例作為研究對象（PD 組），其中男48 例，女30 例，年齡45～80（58.63±10.29）歲。另選取同期無任何基礎(chǔ)疾病的健康志愿者36例為對照組，其中男21例，女15例，年齡47～81（58.15±9.79）歲。2 組年齡、性別相比，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。納入標準：（1）PD組的診斷符合中國帕金森病的診斷標準［5］；（2）臨床資料完整，能夠完成各種認知功能及精神行為癥狀量表評價。排除標準：腦卒中、腦炎、癲癇、創(chuàng)傷性腦病、惡性腫瘤、心血管疾病事件、精神疾病病史、感染性疾病、嚴重臟器功能不全的患者予以排除。本研究已經(jīng)獲得我院倫理會的審批同意，入組對象知情同意并簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 認知功能及精神行為癥狀評估：所有PD患者至少停藥（如抗PD 相關(guān)藥物治療）12 h，采用神經(jīng)精神調(diào)查問卷（NPI）［6］評估精神行為癥狀。采用統(tǒng)一PD評定量表運動檢查（UPDRS）［7］評估運動功能。使用蒙特利爾認知評估量表（MoCA）、簡易精神狀態(tài)檢查表（MMSE）評估患者的認知功能［8］。采用生活活動能力量表（ADL）［9］評估日常生活活動能力。

1.2.2 血清學(xué)指標的檢測：采集入組患者入院24 h內(nèi)、同期健康志愿者空腹靜脈血10 mL，以3 000 r/min的速度，離心15 min（離心半徑13.0 cm），放于—80 ℃冷藏器中備用。（1）嚴格按照各指標檢測試劑盒操作說明，應(yīng)用雙抗體酶聯(lián)免疫吸附法檢測血清中氧化應(yīng)激反應(yīng)標志物：超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、過氧化氫酶（Catalase，CAT）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）、晚期氧化蛋白產(chǎn)物（late oxidized protein products，AOPP），及系統(tǒng)性炎癥介質(zhì)：腺苷脫氨酶（adenosine deaminase，ADA）、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、髓過氧化物酶（myeloperoxidase，MPO）、NLR 家族含熱蛋白結(jié)構(gòu)域蛋白1（NLR family containing heat protein domain protein 1，NLRP1）、IL-6、白細胞介素-1 β（interleukin-1β，IL-1β）。檢測試劑盒均購于BIM 公司（USA）。（2）使用定量聚合酶鏈反應(yīng)檢測血漿外泌體中miR-331-5p的水平。所獲靜脈血離心后獲得的血清，以3 000 r/min 速度離心15 min 以清除細胞碎片，使用TRI試劑分離血漿RNA，使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒（諾博萊德科技有限公司，北京）反向轉(zhuǎn)錄合成目標cDNA，采用實時聚合酶鏈反應(yīng)機（Applied Biosystems7900，美國）檢測血漿外泌體中miR-331-5p的水平。主要步驟包括：總RNA提取-逆轉(zhuǎn)錄-PCR的擴增，PCR反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性10 min，然后95 ℃變性15 s、60 ℃延伸1 min，總反應(yīng)共循環(huán)40次。miR-331-5p引物序列由生工生物工程有限公司提供（上海）：上游序列為（5'-GTCAACGGATTG-GTCTGTATT-3'），下游序列為（5'-AGTCTTCTGG-GTGGCAGTAT-3'）。miR-331-5p的PCR 判讀：ΔCt=樣品Ct 均值-內(nèi)參Ct 均值，以2-ΔCt表示基因的相對表達量。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理本研究數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析使用軟件SPSS version 23.0 進行。計量資料均符合正態(tài)分布，使用均數(shù)±標準差（±s）描述，2 組間差異比較，使用獨立樣本t 檢驗；計數(shù)資料使用例（%）表示，組間差異比較使用卡方檢驗。應(yīng)用Spearman法構(gòu)建各指標間的相關(guān)趨勢。應(yīng)用Logistic 回歸（進入法）分析PD發(fā)病的獨立影響因素，使用受試者工作特征曲線（ROC）計算miR-331-5p 對PD 發(fā)病的診斷價值。所有檢驗均為雙側(cè)檢驗，檢驗水準α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 miR-331-5p、炎癥、氧化應(yīng)激反應(yīng)指標及相關(guān)量表評分比較PD 組患者血漿外泌體miR-331-5p 水平、MPO、IL-1β、IL-6、TNF-α、SOD、MDA、UPDRS 評分、AOPP 水平、NPI 評分顯著高于對照組，MMSE 評分、MoCA 評分、ADL 評分明顯低于對照組（P＜0.05），ADA、NLRP1、CAT比較無統(tǒng)計學(xué)差異，見表1。

表1 2組患者miR-331-5p、炎癥、氧化應(yīng)激指標及相關(guān)量表評分比較 （±s）Table 1 Comparison of miR-331-5p，inflammation，oxidative stress indexes and related scale scores between the two groups （±s）

表1 2組患者miR-331-5p、炎癥、氧化應(yīng)激指標及相關(guān)量表評分比較 （±s）Table 1 Comparison of miR-331-5p，inflammation，oxidative stress indexes and related scale scores between the two groups （±s）

參數(shù)miR-331-5p ADA（U/L）MPO（U/L）NLRP1（pg/mL）IL-1β（pg/mL）IL-6（pg/mL）TNF-α（pg/mL）SOD（U/mL）CAT（U/L）MDA（nmol/L）AOPP（μmol/L）NPI評分/分UPDRS評分/分MoCA評分/分MMSE評分/分ADL評分/分PD組（n=78）1.43±0.36 2.87±0.32 2.07±0.43 108.41±17.67 5.67±1.37 13.29±2.57 6.83±1.56 10.01±1.33 6.16±2.74 9.03±2.19 54.61±11.49 16.39±3.57 24.55±6.32 19.59±5.88 18.47±4.29 50.27±13.74對照組（n=36）0.47±0.11 2.76±0.37 1.36±0.25 105.59±15.41 3.49±0.85 9.38±2.89 4.15±1.05 5.85±1.21 6.29±2.34 6.82±2.04 36.78±10.61 8.03±2.49 14.02±3.49 28.36±6.73 29.19±5.33 75.29±16.74 t值15.633 1.623 9.202 0.823 8.787 7.257 9.364 15.959 0.246 5.115 7.885 12.684 9.346 7.068 11.466 8.423 P值＜0.001 0.107＜0.001 0.412＜0.001＜0.001＜0.001＜0.001 0.806＜0.001＜0.001＜0.001＜0.001＜0.001＜0.001＜0.001

2.2 PD組患者miR-331-5p與炎癥及氧化應(yīng)激反應(yīng)指標的相關(guān)性PD 組患者miR-331-5p 與IL-1β、IL-6、TNF-α、SOD、MDA、AOPP 呈正相關(guān)（P＜0.05），見表2。

表2 PD組患者miR-331-5p與炎癥及氧化應(yīng)激反應(yīng)指標的相關(guān)性Table 2 Correlation between miR-331-5p and inflammation and oxidative stress response indexes in PD group

2.3 PD組患者血漿外泌體miR-331-5p與認知功能及精神行為癥狀評分的相關(guān)性PD 組患者血漿外泌體miR-331-5p與NPI評分、UPDRS評分呈正相關(guān)，與MoCA 評分、MMSE 評分、ADL 評分呈負相關(guān)（P＜0.05），見表3。

表3 PD組患者血漿外泌體miR-331-5p與認知功能及精神行為癥狀評分的相關(guān)性Table 3 Correlation between plasma exosome miR-331-5p and cognitive function and psychobehavioral symptom score in PD group

2.4 PD發(fā)病的影響因素分析Logistic多因素回歸分析顯示miR-331-5p（OR=2.024）、MDA（OR=1.925）、UPDRS評分（OR=2.447）、MoCA評分（OR=0.544）均是PD 發(fā)生進展的影響因素（P＜0.05），見表4。變量賦值：因變量（PD：是=1、否=0），自變量（miR-331-5p：實測值、MPO：實測值、MDA：實測值、IL-1β：實測值、IL-6：實測值、TNF-α：實測值、SOD：實測值、AOPP：實測值、NPI評分：實測值、UPDRS評分：實測值、MoCA評分：實測值、MMSE 評分：實測值、ADL 評分：實測值）。

表4 PD發(fā)病的影響因素分析Table 4 Analysis of influencing factors of PD incidence

2.5 miR-331-5p對PD的診斷價值分析miR-331-5p診斷PD 的ROC 曲線下面積（AUC）為0.809（95%CI：0.715～0.903），截斷值為0.833（2-ΔΔCt），靈敏度為75.6%，特異度為77.8%，約登指數(shù)為0.534，診斷曲線見圖1。

圖1 miR-331-5p診斷PD的ROC曲線Figure 1 ROC curve of miR-331-5p diagnosis of PD

3 討論

PD屬于神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，PD患者與多巴胺分泌不足有關(guān)，多巴胺在人體的神經(jīng)末梢中，促性腺激素釋放激素存在軸突釋放關(guān)系，多巴胺可抑制此激素的釋放，進而可損傷患者的運動能力、記憶能力、認知能力及注意力等［10］。本研究顯示PD 患者NPI 評分、UPDRS 評分明顯升高，MoCA 評分、MMSE評分及ADL 評分顯著降低，說明PD 患者的運動功能、認知功能及精神行為癥狀均受到損害，嚴重影響了患者的日常生活能力。目前世界范圍內(nèi)，尚無治愈PD的方法，且其發(fā)病機制亦未闡述明確，現(xiàn)階段，其發(fā)病及進展機制研究仍是臨床工作者的重心。

PD患者多巴胺分泌不足時，可使機體抗氧化物消耗嚴重，機體內(nèi)氧化自由基堆積，進而促進氧化應(yīng)激反應(yīng)和炎癥反應(yīng)，最終影響神經(jīng)元的代謝，引起神經(jīng)退行性變［11］。氧化應(yīng)激及慢性炎癥反應(yīng)是神經(jīng)細胞老化損壞的關(guān)鍵因素，其貫穿PD 整個病程，是機體線粒體缺乏或炎癥刺激導(dǎo)致的，此過程中產(chǎn)生大量活性氧化因子及炎癥因子［12］。活性氧化因子及炎癥因子可導(dǎo)致多巴胺神經(jīng)元的凋亡，從而形成神經(jīng)元損傷-炎癥-過渡氧化應(yīng)激反應(yīng)的惡性循環(huán)［13］。本研究顯示PD組患者血清氧化應(yīng)激反應(yīng)標志物（SOD、MDA、AOPP）及系統(tǒng)炎癥介質(zhì)（MPO、IL-1β、IL-6、TNF-α）明顯升高，且氧化應(yīng)激反應(yīng)標志物MDA 是PD發(fā)病的影響因素，提示氧化應(yīng)激反應(yīng)及炎癥反應(yīng)與PD患者疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。

微小miRNA 是人類高度保守的內(nèi)源性非編碼RNA小分子，其參與腫瘤、免疫、炎癥、微生物感染、心腦血管等眾多疾病的發(fā)生［14］。miR-331-5p 是微小miRNA家族重要成員之一，是調(diào)控機體免疫炎癥應(yīng)答水平的關(guān)鍵因子之一［15］。姜黎梅等［16］研究發(fā)現(xiàn)，miR-331-5p在PD性癡呆患者體內(nèi)表達明顯升高，且與患者體內(nèi)抗氧化酶水平、炎癥水平及病情嚴重程度有關(guān)。一項動物實驗研究證實，降低PD 大鼠miR-331-5p的表達后，大鼠的學(xué)習(xí)能力、記憶能力均明顯提升，對大鼠腦組織神經(jīng)元損害的改善效果極為顯著，可顯著的緩解腦組織內(nèi)的炎癥狀態(tài)及氧化應(yīng)激反應(yīng)，能夠有效抑制腦組織神經(jīng)元的自噬、凋亡，從而起到神經(jīng)元保護作用，且表示其靶因子可能為蘇氨酸蛋白磷酸酶1［17］。miR-331-5p可調(diào)節(jié)神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育，調(diào)控神經(jīng)元、軸突、樹突及突出生成，其表達異常可引發(fā)患者神經(jīng)元死亡［18］。一項研究證實miR-331-5p的靶基因為MAPK1 和PTEN，而MAPK1 的激活可降低神經(jīng)元的凋亡［19］，降低PTEN蓄積可顯著改善PD患者神經(jīng)退變［20］。由此表明，miR-331-5p 調(diào)控PD患者氧化應(yīng)激反應(yīng)及炎癥反應(yīng)，引發(fā)神經(jīng)元損害，但其具體機制及量化關(guān)系并不清楚。本研究顯示，PD患者血漿外泌體中的miR-331-5p表達水平明顯升高，其與患者氧化應(yīng)激指標（MDA、AOPP）、炎癥指標（IL-1β、IL-6、TNF-α、SOD）呈明顯相關(guān)性，且與患者認知功能損害及精神行為異常癥狀密切相關(guān)，提示miR-331-5p 表達水平的升高可能加重PD 患者體內(nèi)氧化應(yīng)激反應(yīng)及炎癥反應(yīng)，進而引發(fā)嚴重的精神行為異常。進一步分析顯示，miR-331-5p是PD發(fā)病的診斷因素，且其診斷AD發(fā)生的AUC可達0.809，進一步證實了miR-331-5p可作為診斷AD發(fā)生、進展的可靠指標之一。

血漿外泌體miR-331-5p與PD患者炎癥、氧化應(yīng)激反應(yīng)及認知功能及精神行為癥狀密切相關(guān)，且對PD 的發(fā)生具有良好的診斷價值，可為PD 的早期診治提供新方向。