miR-214-5p靶向FGFRL1對甲狀腺癌細胞TPC-1增殖、侵襲和遷移影響

高建華，杜甲錄，李今

1.榆林市第一醫院普通外科二病區，陜西 榆林 719000；2.西北婦女兒童醫院乳腺甲狀腺外科，陜西 西安 710061

甲狀腺癌是一種常見惡性腫瘤，嚴重影響患者生存質量[1-3]。微小RNA(microRNA，miRNA)在多種惡性腫瘤中異常表達，并可參與腫瘤發生及發展過程[4]。例如，miR-139-5p[5]、miR-335-5p[6]、miR-4319[7]在甲狀腺癌中表達上調或下調，并可調節細胞增殖及轉移等生物學過程從而參與甲狀腺癌發生發展過程。微小RNA-214-5p (microRNA-214-5p，miR-214-5p)在胰腺癌[8]、骨肉瘤[9]中表達降低并可參與腫瘤發生及發展過程。但miR-214-5p 在甲狀腺癌中的研究尚未見報道。成纖維細胞生長因子受體樣1 (fibroblast growth factor receptor-like 1，FGFRL1)在膀胱癌[10]、喉癌[11]、食道鱗狀細胞癌[12]等腫瘤中表達升高，沉默FGFRL1 可阻礙細胞增殖、轉移。靶基因預測發現FGFRL1 與miR-214-5p 存在結合位點。本研究通過對比甲狀腺癌細胞中miR-214-5p 與FGFRL1 表達水平，探究miR-214-5p對甲狀腺癌細胞增殖、遷移及侵襲的影響及調控機制。

1 材料與方法

1.1 材料 于2019 年1 月至2019 年5 月收集榆林市第一醫院收治的47 例甲狀腺癌患者的癌組織及其相應癌旁組織標本置于-80℃冰箱內保存，均經病理診斷確診為甲狀腺癌，其中男性27 例，女性20 例，年齡50~67歲，平均(55.36±3.29)歲。

1.2 試劑 正常甲狀腺HT-ori3 細胞與甲狀腺癌BCPAP、TPC-1、SW1736 細胞均購自中國典型培養物保藏中心。Lipofectamine2000 購自上海陽光生物；miR-214-5p 抑制劑/模擬物(anti-miR-214-5p/miR-214-5p mimics) 及其陰性對照(anti-miR-con/miR-con)、FGFRL1 小干擾RNA(si-FGFRL1)及其陰性對照(si-con)均購自上海吉瑪制藥；FGFRL1 過表達載體(pcDNA-FGFRL1)及其對照(pcDNA-con)購自美國Invitrogen；Matrigel基質膠購自美國BD公司；Transwell小室購自美國Corning 公司；MTT檢測試劑盒、PBS 緩沖液購自上海碧云天生物技術有限公司；Trizol試劑購自美國Thermo Fisher公司；反轉錄試劑盒購于大連寶生物；實時熒光定量PCR試劑盒購于上海欣百諾生物工程有限公司；兔抗人FGFRL1、CyclinD1、MMP-2、MMP-9抗體均購自北京博爾邁生物技術有限公司；山羊抗兔IgG二抗(HRP)購于武漢艾美捷。

1.3 方法

1.3.1 免疫組化檢測甲狀腺癌組織中FGFRL1 陽性率 使用乙醇對制備的甲狀腺癌組織石蠟切片進行梯度脫水，加入檸檬酸鹽溶液反應20 min，添加3%過氧化氫，25 min 后加山羊血清，15 min 后加入FGFRL1一抗，4℃過夜孵育加入二抗，室溫下反應2 h，使用DAB 顯色，蘇木素復染，經蒸餾水沖洗后置于1%鹽酸中5 s 后清洗，二甲苯透明，中性樹脂封片，顯微鏡下選10個較清晰的視野統計陽性染色細胞數量，并計算其百分比。根據染色程度進行計數：未顯色，0 分；淺黃色，1 分；棕黃色，2 分；棕褐色，3 分。陽性細胞數目<25%為0 分；陽性細胞數目在25%~50%為1分；數目在50~75%記為2分；陽性數目≥75%記為3分。取兩組計分乘積：≤1分記為陰性，>1分記為陽性。

1.3.2 細胞轉染及實驗分組 甲狀腺癌TPC-1細胞以2×105個/mL的密度接種于6孔板，分別將miR-con(miR-con 組)、miR-214-5p mimics (miR-214-5p 組)、anti-miR-con (anti-miR-con 組)、anti-miR-214-5p (anti-miR-214-5p組)、si-con(si-con組)、si-FGFRL1(si-FGFRL1組)、miR-214-5p mimics與pcDNA-con(miR-214-5p+pcDNA-con組)、miR-214-5p mimics與pcDNA-FGFRL1(miR-214-5p+pcDNA-FGFRL1組)轉染至TPC-1細胞。未進行任何處理的細胞為NC組。

1.3.3 qRT-PCR檢測miR-214-5p、FGFRL1 mRNA表達 參照廠家說明書，使用Trizol 從組織或細胞中分離總RNA。使用反轉錄試劑盒合成cDNA。然后，將稀釋后的cDNA用實時熒光定量PCR試劑盒在ABI StepOnePlus 實時熒光定量PCR 儀上進行qRT-PCR。以U6 和β-actin 為內參，分析miR-214-5p、FGFRL1 mRNA的表達量。

1.3.4 MTT 檢測甲狀腺癌TPC-1 細胞存活率 TPC-1細胞(5×103/孔)接種于96孔板。轉染后，用移液槍向每孔中加入MTT溶液(50 μL)，37℃孵育4 h。接下來，用移液槍小心地去除培養基，加入DMSO(150 μL/孔)溶解甲瓚。最后，通過在490 nm處用酶標儀檢測吸光度(OD)來計算細胞存活率(以實驗組與對照組OD值的百分比表示)。

1.3.5 Transwell 實驗檢測TPC-1 細胞遷移 將經過1.3.2 處理的各組TPC-1 細胞加入Transwell小室的上室，同時將含有10%FBS的DMEM培養基加入下室，孵育24 h 后，過濾細胞的下室用4%的多聚甲醛固定15 min，用0.2%結晶紫染色，25 min，然后用顯微鏡成像，計數遷移細胞數。Transwell 上室預先涂上Matrigel，每孔30 μL，其他步驟與遷移實驗相同。

1.3.6 雙熒光素酶報告基因檢測miR-214-5p靶基因 miR-214-5p 和FGFRL1 的結合序列由TargetScan 提供。將含有miR-214-5p 結合位點的FGFRL1 3'UTR的野生型(WT)或突變型(MUT)序列分別插入pmirGLO 熒光素酶報告載體，以創建WT 和MUT 質粒(WT-FGFRL1 和MUT-FGFRL1)。將上述報告質粒與miR-214-5p mimics或其對照(miR-NC)共轉染TPC-1細胞。共轉染24 h后，測定熒光素酶活性。

1.3.7 Western blot 檢測FGFRL1、CyclinD1、MMP-2、MMP-9蛋白表達 提取組織或細胞總蛋白，用BCA 法定量蛋白后，將蛋白煮沸變性。10%~12%SDS-PAGE 分離蛋白，將蛋白轉移到PVDF 膜上。然后，將膜封閉2 h，與FGFRL1、CyclinD1、MMP-2、MMP-9一抗(1∶1 000)的條件與時間分別為4℃孵育，24 h，TBST 洗膜后孵育二抗(1∶5 000)1 h，用ECL 檢測結合信號。用Image J軟件評估蛋白表達水平。

1.4 統計學方法 應用SPSS21.0 統計軟件分析數據。計數資料比較采用χ2檢驗，計量資料符合正態分布，以均數±標準差()表示，兩組間比較采用t 檢驗，多個組間比較采用單因素方差分析，進一步兩兩比較行LSD-t檢驗。以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 甲狀腺癌組織與癌旁組織的miR-214-5p和FGFRL1 表達水平比較 與癌旁組織比較，甲狀腺癌組織的miR-214-5p 表達下降，FGFRL1 的表達量升高，差異均有統計學意義(P<0.05)，見圖1和表1。同時免疫組化檢測結果顯示，甲狀腺癌組織中的FGFRL1陽性率為68.09%(32/47)，明顯高于癌旁組織的6.38%(3/47)，差異有統計學意義(χ2=453.729，P<0.05)。

圖1 FGFRL1在甲狀腺癌患者中的表達情況Figure 1 Expression of FGFRL1 in patients with thyroid cancer

表1 甲狀腺癌組織與癌旁組織的miR-214-5p和FGFRL1表達水平比較(，n=47)Table 1 Comparison on the expression levels of miR-214-5p and FGFRL1 in thyroid cancer tissues and adjacent tissues (,n=47)

表1 甲狀腺癌組織與癌旁組織的miR-214-5p和FGFRL1表達水平比較(，n=47)Table 1 Comparison on the expression levels of miR-214-5p and FGFRL1 in thyroid cancer tissues and adjacent tissues (,n=47)

組別癌旁組織癌組織miR-214-5p 1.00±0.15 0.40±0.06a FGFRL1 mRNA 1.00±0.03 2.18±0.25 FGFRL1蛋白0.42±0.04 0.86±0.10 t值P值25.461 0.001 32.128 0.001 28.007 0.001

2.2 甲狀腺癌細胞系的miR-214-5p 和FGFRL1表達水平比較 miR-214-5p 在甲狀腺癌BCPAP、TPC-1、SW1736 細胞中表達低于HT-ori3，FGFRL1 mRNA及蛋白表達高于HT-ori3，差異均有統計學意義(P<0.05)。TPC-1 細胞中miR-214-5p 表達最低，表明miR-214-5p 可能通過負向調控FGFRL1 的表達而參與甲狀腺癌發生過程。故選擇TPC-1 細胞進行下一步研究，見圖2和表2。

圖2 Western Blot檢測FGFRL1蛋白表達情況Figure 2 Detection of FGFRL1 protein expression by Western blot

表2 甲狀腺癌細胞系和正常甲狀腺細胞中miR-214-5p、FGFRL1 mRNA和FGFRL1 protein表達量比較(，n=9)Table 2Comparison of miR-214-5p, FGFRL1 mRNA, and FGFRL1 protein expression levels in thyroid cancer cell lines and normal thyroid cells(,n=9)

表2 甲狀腺癌細胞系和正常甲狀腺細胞中miR-214-5p、FGFRL1 mRNA和FGFRL1 protein表達量比較(，n=9)Table 2Comparison of miR-214-5p, FGFRL1 mRNA, and FGFRL1 protein expression levels in thyroid cancer cell lines and normal thyroid cells(,n=9)

注：與HT-ori3細胞組比較，aP<0.05.Note:Compared with HT-ori3 cell group,aP<0.05.

組別HT-ori3組BCPAP組TPC-1組SW1736組F值P值miR-214-5p 1.03±0.11 0.66±0.09a 0.26±0.03a 0.35±0.02a 67.705 0.001 FGFRL1 mRNA 1.00±0.10 3.59±0.36a 4.01±0.40a 3.21±0.32a 53.746 0.001 FGFRL1蛋白0.36±0.05 1.02±0.10a 1.15±0.11a 0.95±0.09a 44.759 0.001

2.3 miR-214-5p 對TPC-1 甲狀腺癌細胞增殖、遷移和侵襲的影響 與miR-con組比較，miR-214-5p組甲狀腺癌TPC-1細胞存活率、遷移、侵襲細胞數及蛋白CyclinD1、MMP-2、MMP-9表達降低，差異均有統計學意義(P<0.05)；與anti-miR-con組比較，anti-miR-214-5p組甲狀腺癌TPC-1細胞存活率、遷移、侵襲細胞數及蛋白CyclinD1、MMP-9、MMP-2表達升高，差異均有統計學意義(P<0.05)，表明miR-214-5p 可阻礙甲狀腺癌細胞增殖、遷移及侵襲，而抑制miR-214-5p 表達可促進甲狀腺癌細胞增殖、遷移及侵襲，見圖3和表3。

圖3 miR-214-5p對TPC-1甲狀腺癌細胞增殖、遷移和侵襲的影響Figure 3 Effect of miR-214-5p on proliferation,migration,and invasion of TPC-1 thyroid cancer cells

表3 miR-214-5p對TPC-1甲狀腺癌細胞增殖、遷移和侵襲的影響(,n=3)Table 3 Effect of miR-214-5p on the proliferation,migration,and invasion of TPC-1 thyroid cancer cells(,n=3)

表3 miR-214-5p對TPC-1甲狀腺癌細胞增殖、遷移和侵襲的影響(,n=3)Table 3 Effect of miR-214-5p on the proliferation,migration,and invasion of TPC-1 thyroid cancer cells(,n=3)

注：與miR-con組比較，aP<0.05；與anti-miR-con組比較，bP<0.05。Note:Compared with miR-con group,aP<0.05;compared with anti-miR-con group,bP<0.05.

組別miR-con anti-miR-con miR-214-5p anti-miR-214-5p F值P值細胞侵襲數量(個)95.23±9.56 94.56±9.50 42.79±4.30a 128.63.±12.90b 41.128 0.001 miR-214-5p 1.00±0.10 1.02±0.10 3.45±0.35a 0.35±0.05b 154.266 0.001 CyclinD1 1.25±0.12 1.20±0.12 0.40±0.05a 1.65±0.16b 57.686 0.001 MMP-2 1.15±0.11 1.13±0.11 0.35±0.04a 1.50±0.15b 58.445 0.001 MMP-9 1.00±0.10 1.01±0.12 0.40±0.05a 1.48±0.15b 47.414 0.001細胞活力(%)100.00±10.01 102.16±10.22 55.26±5.25a 135.48±13.5b 31.394 0.001細胞遷移數量(個)201.36±20.11 200.16±20.01 146.45±14.60a 286.06±28.62b 21.744 0.001

2.4 敲減FGFRL1 抑制TPC-1 甲狀腺癌細胞增殖、遷移和侵襲 與si-con 組比較，si-FGFRL1 組甲狀腺癌TPC-1細胞存活率、遷移及侵襲細胞數降低，蛋白FGFRL1、CyclinD1、MMP-9、MMP-2表達降低，差異均有統計學意義(P<0.05)，表明敲減FGFRL1可明顯降低甲狀腺癌細胞增殖、遷移及侵襲能力，見圖4、表4。

圖4 敲減FGFRL1，Western Blot 檢測FGFRL1、CyclinD1、MMP2、MMP9的蛋白表達Figure 4 Knockdown of FGFRL1 and detection of the expression of FGFRL1, CyclinD1, MMP2, and MMP9 protein by Western blot

表4 敲減FGFRL1抑制甲狀腺癌細胞系TPC-1增殖、遷移和侵襲(,n=3)Table 4 Knockdown of FGFRL1 inhibits the proliferation,migration,and invasion of thyroid cancer cell line TPC-1(,n=3)

表4 敲減FGFRL1抑制甲狀腺癌細胞系TPC-1增殖、遷移和侵襲(,n=3)Table 4 Knockdown of FGFRL1 inhibits the proliferation,migration,and invasion of thyroid cancer cell line TPC-1(,n=3)

注：與si-con組比較，aP<0.05。Note:Compared with si-con group,aP<0.05.

組別NC si-con si-FGFRL1 F值P值FGFRL1 1.18±0.12 1.15±0.11 0.41±0.05a 58.352 0.001 CyclinD1 1.21±0.12 1.18±0.11 0.36±0.05a 71.410 0.001 MMP2 1.15±0.11 1.12±0.11a 0.43±0.05a 55.713 0.001 MMP9 1.01±0.12 1.00±0.10a 0.35±0.05a 48.224 0.001細胞活力(%)100.00±10.03 101.05±10.11 48.35±4.84a 36.146 0.001細胞遷移數量(個)205.12±20.06 202.46±20.24 135.16±13.64a 14.173 0.001細胞侵襲數量(個)96.08±9.65 95.14±9.52 50.28±5.19a 29.268 0.001

2.5 miR-214-5p 靶向FGFRL1 靶基因預測顯示FGFRL1 的3’UTR 區域存在miR-214-5p 的結合位點。miR-214-5p過表達抑制了WT-FGFRL1的熒光素酶活性，差異有統計學意義(P<0.05)。miR-214-5p 組甲狀腺癌TPC-1 細胞中FGFRL1 蛋白表達水平明顯低于miR-con 組，差異具有統計學意義(P<0.05)；anti-miR-214-5p組甲狀腺癌TPC-1細胞中FGFRL1蛋白表達水平明顯高于anti-miR-con組，差異有統計學意義(P<0.05)，表明miR-214-5p 可靶向結合FGFRL1，并可負向調控FGFRL1的表達及活性，見圖5。

圖5 miR-214-5p靶向調控FGFRL1表達Figure 5 MiR-214-5p targeted regulation of FGFRL1 expression

2.6 FGFRL1高表達可部分逆轉miR-214-5p高表達對TPC-1增殖、遷移和侵襲的抑制作用 miR-214-5p+pcDNA-FGFRL1組甲狀腺癌TPC-1細胞存活率、遷移及侵襲細胞數、蛋白CyclinD1、MMP-2、MMP-9 表達較miR-214-5p+pcDNA-con 組增高，差異有統計學意義(P<0.05)，表明高表達FGFRL1 可以部分逆轉miR-214-5p高表達對TPC-1增殖、遷移和侵襲的抑制作用，見圖6和表5。

圖6 Western blot檢測FGFRL1、CyclinD1、MMP2、MMP9蛋白表達Figure 6 Detection of FGFRL1, CyclinD1, MMP2, MMP9 protein expression by Western blot

表5 FGFRL1高表達可部分逆轉miR-214-5p高表達對TPC-1增殖、遷移和侵襲的影響(,n=3)Table 5 FGFRL1 overexpression can partially reverse the effects of miR-214-5p overexpression on TPC-1 proliferation, migration, and invasion(,n=3)

表5 FGFRL1高表達可部分逆轉miR-214-5p高表達對TPC-1增殖、遷移和侵襲的影響(,n=3)Table 5 FGFRL1 overexpression can partially reverse the effects of miR-214-5p overexpression on TPC-1 proliferation, migration, and invasion(,n=3)

注：與miR-con組比較，aP<0.05；與miR-214-5p+pcDNA-con組比較，bP<0.05。Note:Compared with miR-con group,aP<0.05;compared with miR-214-5p+pcDNA-con group,bP<0.05.

組別miR-con組miR-214-5p組miR-214-5p+pcDNA-con組miR-214-5p+pcDNA-FGFRL1組F值P值FGFRL1 1.15±0.11 0.38±0.05a 0.40±0.05 0.99±0.10b 69.826 0.001 CyclinD1 1.22±0.12 0.42±0.05a 0.40±0.05 1.05±0.11b 68.949 0.001 MMP-2 1.15±0.11 0.38±0.04a 0.40±0.05 1.00±0.11b 66.843 0.001 MMP-9 1.05±0.10 0.35±0.05a 0.40±0.05 0.90±0.09b 63.910 0.001細胞活力(%)100.01±2.46 50.26±5.03a 52.04±5.20 91.23±9.12b 57.011 0.001細胞遷移數量(個)202.79±20.28 140.24±14.25a 138.89±13.90a 182.78±18.30b 10.621 0.001細胞侵襲數量(個)95.79±9.50 41.25±4.12a 40.14±4.02a 83.35±8.34b 51.140 0.001

3 討論

miR-214在卵巢癌、舌鱗癌等腫瘤中呈高表達，并可影響腫瘤發生及發展進程[13-14]。Yao 等[15]研究表明miR-214-5p 在胰腺癌細胞中下調表達，LncRNA DANCR 可通過競爭性吸附miR-214-5p 而上調E2F2表達進而加速胰腺癌惡性進展。有報道顯示miR-214-5p 可抑制肝癌細胞轉移[16]。本研究結果顯示，甲狀腺癌組織及細胞中miR-214-5p 表達下降，上調miR-214-5p 表達后甲狀腺癌細胞增殖、遷移及侵襲能力均明顯降低；下調miR-214-5p 表達后可促進甲狀腺癌細胞增殖、遷移及侵襲，提示miR-214-5p 在甲狀腺癌細胞中發揮抑癌作用。進一步研究發現CyclinD1、MMP-2、MMP-9 表達水平與甲狀腺癌細胞增殖、遷移及侵襲能力的強弱呈正相關，提示上調miR-214-5p 表達可通過降低CyclinD1、MMP-2、MMP-9 表達水平抑制甲狀腺癌細胞增殖、遷移及侵襲。

FGFRL1 通過調控Hedgehog 信號進而促進卵巢癌進展[17]。miR-210 通過靶向FGFRL1 進而促進肝細胞癌、肺腺癌細胞增殖[18-19]。本研究結果表明FGFRL1在甲狀腺癌組織及細胞中表達升高，抑制FGFRL1 表達可明顯抑制甲狀腺癌細胞增殖、遷移及侵襲，提示FGFRL1的高表達可能是促進甲狀腺癌發生及發展的重要原因之一。靶基因預測顯示FGFRL1與miR-210存在結合位點，本研究采用雙熒光素酶報告基因實驗證實miR-210 可靶向結合FGFRL1，進一步研究證實miR-210可負向調控FGFRL1表達；通過上調FGFRL1表達發現，FGFRL1可明顯逆轉miR-214-5p的抗甲狀腺癌細胞增殖、遷移、侵襲功能。表明miR-214-5p 可通過下調FGFRL1 表達抑制甲狀腺癌細胞增殖、遷移及侵襲。提示miR-214-5p 可能作為甲狀腺癌靶向治療的潛在靶點。

綜上所述，miR-214-5p在甲狀腺癌中發揮抑癌作用，其通過負向調控靶基因FGFRL1 表達抑制甲狀腺癌細胞增殖、遷移及侵襲，為甲狀腺癌早期診斷及治療靶點提供新方向。但本研究僅采用一種甲狀腺癌細胞進行研究，miR-214-5p/FGFRL1對其他甲狀腺癌細胞生物學行為的影響尚需進一步探究。