腦性癱瘓生物標志物的研究進展

劉 宇，宋福祥

（1.佳木斯大學 a 康復醫學院* 護理學院 b 兒童神經康復實驗室，黑龍江 佳木斯 154007 ；2.深圳市龍華區婦幼保健院，廣東 深圳 518000）

腦性癱瘓（cerebral palsy，CP）簡稱腦癱，是由大腦發育不成熟、先天性發育缺陷或損傷等非進行性腦損傷引起的一組持續存在的中樞性運動和姿勢發育障礙、活動受限的癥候群[1]。我國目前1 ～6歲兒童腦癱的患病率為2.46‰[2]，國外的患病率為1.4‰～3.2‰[3-5]。目前，已有很多證據表明早期干預可以有效改善腦癱患兒的預后。但當前的早期診斷主要是基于神經系統檢查以及運動功能評估。為了能夠更準確、更早地診斷腦癱，越來越多的研究人員關注到生物標志物的篩查。通過生物標志物檢測進行早期診斷，并給予腦癱患兒早期干預和治療，可改善其預后。生物標志物是指具有“一種可客觀檢測和評價的特性，可作為正常生物學過程、病理過程或治療干預藥理學反應的指示因子”。尋找和發現有價值的生物標志物已成為當前醫學領域的研究熱點。生物標志物對疾病的早期診斷及干預策略的制定至關重要。本文總結了目前腦癱生物標志物以及針對這些生物標志物發展的檢測技術，以期為腦癱的提早發現及早期干預提供指導。

1 生物標志物

1.1 遺傳基因

目前越來越多的證據表明，10% ～30% 的腦癱兒童可以確定潛在的遺傳病因[6]。腦癱低風險嬰兒也應該進行遺傳病理學篩查，如沒有先天性出生缺陷的足月兒[7]。通過全外顯子組測序（Whole Exome Sequencing，WES）[8]，研究者報道了三個先前確定的 腦 癱 基 因（TUBA1A、SCN8A 和KDM5C）及 六個新的候選腦癱基因（AGAP1、JHDM1D、MAST1、NAA35、RFX2 和WIPI2）可能對腦癱具有潛在的致病性。最終，在14% 的腦癱病例中發現了新發和遺傳性單核苷酸變異，其中一半在候選基因中，同時確定了5 個基因的變異可能會導致腦癱的出現，分別為KDM5C、SCN8A、TUBA1A、L1CAM 和PAK3。遺傳的異質性突出了遺傳對腦癱影響的復雜性，需要進一步研究來確定這些假定致病性腦癱基因的致病作用。這些研究突出了下一代測序可提供精確的分子診斷作用，加深了對疾病病理學的理解，為完善遺傳機制和預后咨詢提供了機會。另外，當前此方法運用越來越多，操作也越來越便捷，希望未來在預測腦癱方面得到更多的重視。

1.2 DNA 甲基化

DNA 甲基化是一類發生在胞嘧啶5 號位碳原子上，可以通過改變基因和蛋白質的表達水平來穩定遺傳的表觀修飾。表觀遺傳學在改變基因表達以應對細胞壓力或疾病方面具有關鍵作用[9]。Mohandas 等[10]研究指出，同卵雙胞胎之間腦癱患病率的差異可能與DNA 甲基化改變有關，通過研究共鑒定出190 個差異甲基化基因，其中腦癱組37 個基因高甲基化，其余153 個基因低甲基化。另一項研究檢測了同卵雙胞胎新生兒期血液中的DNA 甲基化，發現與腦癱有關的多個基因胞嘧啶的CpG 位點有甲基化變化。差異甲基化的關鍵CpG 位點是HNRNPL、RASSF5、CD3D 和KALRN。Bahado-Singh 等[11]為評估腦癱兒童血液樣本中的DNA 甲基化，以及研究潛在的表觀遺傳生物標志物以預測腦癱，進行了全基因組DNA 甲基化分析，使用人工智能平臺分析了23 名腦癱病例和21 名正常兒童的新生兒期血液DNA 甲基化情況，發現258個基因中有230 個顯著差異的甲基CpG 位點，對新生兒腦癱的預測具有95% 的敏感性和94.4% 的特異性。說明使用人工智能平臺技術分析血液表觀遺傳變化似乎可以準確預測腦癱，缺點是樣本量不足。現階段，有關DNA 甲基化的研究仍有局限性，如難以獲得早期血液樣本、樣本來源者的年齡較大、樣本量較小，以及一些研究的重點是痙攣型腦癱等。未來的研究目標之一是開發系統的方法和數學模型，在出生時篩選受試者。此外，需要對更廣泛的腦癱分型以及來自其他神經運動和發育狀況受試者的樣本進行分析。

1.3 miRNAs

microRNAs（miRNAs）是 一 種 微 小 的 內 源 性非編碼調控RNA，其功能是基因表達的轉錄后調節，在中樞神經系統的發育和功能表達中發揮重要作用。Chapman 等[12]研究miRNAs 作為腦癱的潛在生物標志物，證實了通過檢測血漿miRNAs 譜預測腦癱兒童的可能性和潛力。Li 等[13]對腦癱兒童進行血漿miRNAs 檢測，通過qRT-PCR 確定miR-124 的表達，并用熒光素酶試驗和Western 印跡法來確認miR-124 對靶基因的調控，結果表明，成熟miR-124 的表達水平在體外被C-T 變異下調了，并且C-T 變異導致的miR-124 減少使得靶基因ITGB1、LAMC1 和BECN1 的抑制效率降低，而這些基因可能在神經系統的發育過程中發揮重要作用。同時，miR-124 表達的減少也與氧化應激下細胞凋亡誘導因子的核轉位增加有關，從而誘發更多的細胞凋亡。最終結果表明，pri-miR-124-1 的一個功能多態性可能通過干擾miR-124 的產生而導致兒童腦癱的遺傳易感性，進而干擾miR-124 靶基因的表達和功能。相關研究證明了miRNA 編碼區的核苷酸變異與兒童腦癱易感性之間的關系，顯示出miRNAs 作為生物標志物在預測腦癱方面的潛力。在過去的幾年中，醫學領域關于miRNAs 在大腦中的作用發表了大量的研究，作為基因表達的轉錄后調控因子，miRNAs 在大腦發育過程中無疑扮演著至關重要的角色，然而界定它們對發育和受傷大腦影響的研究仍處于初級階段。鑒于特定的miRNAs 在發育過程中可以表現出不同的功能作用，并且可以發揮協同作用，因此很難確定它們的精確功能和作用，這是在考慮將特定的miRNAs 作為生物標志物預測腦癱時需要注意的問題。

1.4 營養信號通路NTRK2（trkB）和FGFR1 的轉錄

轉錄分析能幫助我們了解細胞或生物體基因組的功能，同時揭示細胞或組織的分子成分，用于了解兒童發育和疾病。轉錄組由基因組產生的一整套RNA轉錄本組成，這使我們能夠將其與功能蛋白質的表達聯系起來。轉錄組學現已被用于研究廣泛的神經系統疾病，調查疾病的病因生理學和潛在的生物標志物，包括阿爾茨海默氏病、孤獨癥譜系障礙和腦癱[14]等。目前，關于轉錄組與腦癱的研究還較少。Van 等[14]對182 名腦癱兒童的大規模分析發現，營養信號通路的轉錄失調是腦癱的主要擾動之一，特別強調NTRK2（trkB）和FGFR1 的下調。他們將這些與腦源性神經營養因子、成纖維細胞生長因子信號通路以及炎癥標志物的上調聯系起來，認為這是導致腦癱中神經元保護能力下降的原因。同時有另一種解釋是，營養信號通路的下調可能是由子宮內或產后早期的慢性壓力造成的。識別這種分子異常的環境和遺傳觸發因素，將是理解腦癱和其他神經發育障礙的病因以及預測那些風險更大疾病的重要一步。但這項研究存在一定的局限性，其使用的細胞系來自外周血，不能像在大腦中觀察到的那樣概括所有的變化，但仍能為腦癱潛在的神經化學研究提供寶貴的見解。通過對腦癱的轉錄變化進行了大規模的分析研究，證明了臨床不同腦癱中存在趨同分子異常，為未來基因組和功能分析中進一步研究基因的優先排序提供了基礎。

1.5 白細胞介素-6（IL-6）和白細胞介素-8（IL-8）

當感染引發下游代謝途徑時，會釋放各種炎癥生物標志物，如細胞因子、白細胞介素（IL）和其他分子。炎癥過程的生物標志物與有害的神經學結果有關，如孤獨癥譜系障礙和神經發育障礙[15]。研究表明，炎癥生物標志物與腦癱的發生風險直接相關。在小鼠模型中，當胎兒暴露在細菌內毒素中導致全身炎癥反應時，其對缺氧損傷的易感性增加[16]。據報道，母親的宮內炎癥與嬰兒的腦癱風險增加有關[17]。Gomez 等[18]測量了早產或胎膜早破新生兒胎兒時期羊水和血漿中IL-6 的濃度，發現出現嚴重新生兒疾病的新生兒（包括腦癱前兆室周白斑）其胎兒時期血漿IL-6 的濃度高于未出現嚴重新生兒疾病的新生兒。有學者研究證實，IL-6、IL-8 水平升高和組織學胃底炎的證據與3歲時發生腦癱的概率增加呈獨立相關。這項研究表明，由于羊膜腔內感染而出現的胎兒全身炎癥與腦癱有很強的相關性。據報道，患有新生兒腦病的嬰兒腦脊液和血漿細胞因子水平升高[19]，包括那些后來出現神經預后不良的嬰兒。進一步的研究顯示，在圍產期窒息或新生兒腦病的嬰兒中發現臍帶血IL-6 水平升高[20]。與此相反，早產兒臍帶血IL-8、IL-1β 和腫瘤壞死因子-α（TNF-α）水平與腦癱患兒的預后沒有明顯的關聯[21]。此外，腦癱風險或長期神經發育結果不良與臍帶血中中樞神經特異性蛋白（S100β）、神經元特異性烯醇化酶的濃度沒有顯著相關性[22]。最近的一項系統綜述提出了腦癱兒童的神經發育結果與全血、血漿、血清、腦脊液或尿液中的炎癥生物標志物之間的關聯證據[23]。大多數研究報告了最初幾年的神經系統損傷與外周炎癥之間的關系。神經系統發育異常與較高的細胞因子循環水平有關，包括IL-1β、IL-6、IL-8 和TNF-α[24]，增加了腦癱的發生風險。極端早產兒產后2 周內TNF-α、TNF-α 受體-1、IL-8 和細胞間黏附分子-1 的反復升高也與腦癱發生風險的增加有關[25]。此外，內源性紅細胞生成素也與極端早產兒腦癱的發生有關[26]。在兒童出生時通過檢測血液、尿液或腦脊液中的炎癥生物標志物，可能有助于早期診斷和干預腦癱。目前，生物標志物檢測被認為是準確及早期診斷腦癱的關鍵，但仍缺乏能夠一致識別腦癱兒童的生物標志物，故現階段對于生物標志物的尋找還在進行中。

1.6 代謝組學生物標志物

代謝組學的研究重點是生物系統中的代謝途徑，重點是代謝物[27]。由于腦癱發病機制的復雜性，目前文獻中關于腦癱代謝標志物的研究資料較少。通常研究對象為圍產期窒息和缺氧缺血性腦病（hypoxicischemic encephalopathy，HIE）新生兒，以確定反應預后的生物標志物。一維核磁共振波譜成像顯示，與對照組相比，圍產期窒息和HIE 嬰兒臍血中與能量相關的代謝物發生了顯著變化[28]。嚴重HIE 病例的代謝物中琥珀酸和甘油增加，酮類、丙酮和3- 羥基丁酸減少。酮類的減少和琥珀酸的增加可能意味著新生兒能量的不斷消耗和向無氧代謝的轉變。高危新生兒臍帶血的代謝組分析顯示，與對照組新生兒相比，高危新生兒臍帶血中膽堿、脯氨酸、谷氨酰胺、丙氨酸、葡萄糖的水平較低，苯丙氨酸和瓜氨酸的水平較高[29]。同樣，在低出生體重的新生兒中，通過檢測臍帶血中苯丙氨酸和色氨酸等必需氨基酸的水平能夠準確區分胎兒生長受限和正常生長的胎兒[30]。HIE 的病理生理機制是多因素且十分復雜的，代謝組學是對代謝物的系統評價，提供了其相互作用的證據。由于缺氧會抑制有氧能量代謝，而有氧能量代謝是全身代謝的核心，因此代謝組學為發現HIE 的生物標志物和疾病的發病機制提供了強大的系統生物學方法。近些年的幾項研究已經使用代謝組學來評估動物模型的圍產期窒息，但缺乏將代謝圖譜與圍產期窒息和HIE 的分子病理學知識結合起來的人體研究。當前，對代謝組學生物標志物的研究有助于進一步深入了解腦癱的復雜病理生理學，同時確定腦癱的預測性生物標志物。

2 小結

腦癱是我國兒童肢體殘疾的主要致病因素之一。大量研究已經表明通過早期干預及治療能夠改善腦癱兒童及腦癱高風險狀態兒童的預后，因此腦癱的早期診斷和干預至關重要。生物標志物檢測是臨床診斷早期腦癱的方法之一，但目前國內有關生物標志物的研究較少，尤其是腦癱領域用于早期預測/ 診斷的生物標志物仍有待研究和明確。在國外，關于腦癱生物標志物的研究逐漸成為熱點，陸續有相關生物標志物發現的報道。但現在由于研究尚在試驗進展階段，同時缺乏大樣本量的試驗數據，以及臨床手段的局限等，目前可用于臨床實踐的生物標志物很少。隨著對腦癱和相關生物標志物的進一步認識，相信未來會出現更多、更大樣本量的試驗，使腦癱生物標志物真正應用于臨床。本文總結了目前已有的關于腦癱生物標志物的知識和文獻，希望未來在研究人員的持續努力下，我們能對這種復雜的疾病有更多的了解，給予腦癱兒童及腦癱高風險狀態兒童早期診斷和干預，充分利用生物標志物的作用，使患兒獲得更好的預后，為患兒、患兒家庭乃至社會帶去更多的福音。