吳茱萸堿對腫瘤血管增生的抑制作用及其機制*

劉磊,彭琴,吳澤明,黃欣慧,張廣獻,譚宇蕙

(廣州中醫藥大學基礎醫學院,廣州 510006)

統計報告顯示,2020年全球新發癌癥約1 930萬例,癌癥患者死亡1 000萬例,其中我國新增癌癥病例約457萬,死亡病例300萬[1]。大多數癌癥患者確診時已進入進展期或者中晚期,腫瘤已開始通過血行播散轉移。腫瘤血管生成是腫瘤生長、進展和轉移的重要因素[2],抑制血管生成已成為臨床批準的治療方法,然而目前卻受到可選藥少、療效不足或耐藥性的限制。由于腫瘤細胞迅猛增殖,代謝水平高,實體腫瘤中心區域容易出現缺血缺氧的狀態,而缺氧能促進血管增生,誘導血管生成是腫瘤的十大特征之一,其病理性血管增生是以新生毛細血管的形成為主,而內皮細胞是構成毛細血管管壁的主要細胞,其來源于內皮祖細胞增殖分化或自身的繼續增殖分裂,而內皮(祖)細胞增殖分化及遷移被證實是惡性腫瘤血管增生的重要環節[3-4]。有報道指出,內皮(祖)細胞增殖也像癌細胞一樣依賴瓦伯格效應(Warburg effect,即依靠大量糖酵解提供合成代謝和能量代謝的原料)[5-6],因此,通過調整內皮(祖)細胞代謝以抑制血管增生可能是抗癌的新策略。

吳茱萸堿(evodiamine,EVO)是吳茱萸的主要活性成分之一。現代研究發現,EVO具有抗腫瘤、抗炎、抗菌、保護心血管系統及神經等藥理作用[7]。本課題組前期已證實EVO對肝癌細胞的瓦伯格效應有顯著的抑制作用,那么EVO能否抑制血管內皮細胞的瓦伯格效應?EVO是否通過影響內皮細胞糖代謝而抑制其增殖生長從而抗血管增生?這些尚不明確。本研究通過體外模擬人臍靜脈內皮細胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVECs)體內的缺氧狀態,觀察常氧和缺氧下內皮細胞糖代謝相關酶的變化、EVO的干預作用及相關信號通路變化,探討EVO抗血管增生的作用及機制。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1細胞 HUVECs購自廣州浩瑪生物科技有限公司(貨號:CL-0122);人肝母細胞肝癌細胞株(HepG2),由廣州中醫藥大學基礎醫學院生物化學實驗室長期保存。

1.1.2藥物及試劑 EVO購自成都曼思特有限公司(批號:MUST-21050405);六水合氯化鈷(CoCl2·6H2O)購自上海麥克林生化科技有限公司(批號:C13563922);內皮細胞專用培養基購自廣州浩瑪生物科技有限公司(貨號:CM-0122);胎牛血清購自武漢普諾賽生命科技有限公司(批號:SA220119);高糖達爾伯克必需基本培養基(Dulbecco's minimum essential medium,DMEM)購自美國Gibco公司(貨號:8122480);噻唑藍(methyl thiazolyl tetrazolium,MTT)試劑盒、二甲亞砜、Annexin V/PI細胞凋亡檢測試劑盒均購自廣州瑞舒生物科技有限公司(貨號分別為:10004162、MB2470、MA0220-1);聚偏二氟乙烯(polyvinylidene fluoride,PVDF)膜購自Roche(貨號:62344100);山羊抗鼠二抗、山羊抗兔二抗均購自ABclonal(批號:AS014、AS003);鼠抗β-actin抗體、兔抗HIF-1α抗體、兔抗PFKFB3抗體均購自ABclonal公司(批號分別為AC004、A6265、A6945);兔抗VEGFR2抗體購自Abcam公司(批號:GR256989-1)。

1.1.3儀器與設備 二氧化碳(CO2)細胞培養箱(美國Thermo Fisher公司,型號:FORMA371);超凈工作臺(上海博迅醫療生物儀器股份有限公司,型號:SW-CJ-2F);多功能酶標儀(PE公司,型號:PerKinElmer);流式細胞分析儀(美國BD公司,型號:Accuri C5);蛋白垂直電泳系統、蛋白轉印系統(美國Bio-Rad公司);全自動化學發光圖像分析系統(上海天能儀器有限公司,型號:5200)。

1.2方法

1.2.1細胞培養 將HUVECs、HepG2細胞分別置于內皮細胞專用培養基、10%胎牛血清+90%高糖DMEM培養基中,37 ℃、5%CO2飽和濕度條件下常規培養。細胞密度達到80%～90%,用含0.25%乙二胺四乙酸(ethylene diamine tetraacetic acid,EDTA)的胰酶消化、離心并收集細胞(離心率1 000 r·min-1,r=7 cm,離心5 min),加入內皮細胞專用培養基或DMEM培養液制成單細胞懸液,選取第3～6代細胞進行后續實驗。

1.2.2MTT法檢測細胞增殖情況 取對數生長期HUVECs、HepG2細胞分別制成單細胞懸液,均以每孔2 000個、細胞懸液100 μL接種于96孔板,培養24 h,即細胞貼壁,設置空白組(無細胞對照)、對照組(細胞對照)、實驗組[EVO 和(或)CoCl2],實驗組每孔加入不同濃度的EVO(0.1、0.2、0.4、0.8、1.6 μmol·L-1)或CoCl2(50、100、200、400、800 μmol·L-1)或二者聯合100 μL,每個濃度梯度設置5個平行復孔。藥物干預24 h,避光,每孔加入5 mg·mL-1MTT溶液10 μL,繼續孵育4 h,吸棄上清液后每孔加入二甲亞砜150 μL,避光震蕩10 min。酶標儀檢測波長處490 nm吸光度值(A值)。細胞存活率(%)=(A實驗組-A空白組)/(A對照組-A空白組)×100%。改良寇式法計算半數抑制濃度(half madimal inhibitory concentration,IC50):Lg(IC50)=Xm-I[P-(3-Pm-Pn)/4]及IC50=10 Lg(IC50)。

1.2.3流式細胞術檢測HUVECs細胞凋亡水平 以每孔106個HUVECs接種至6孔板,待細胞貼壁后,設置對照組和EVO各濃度組,EVO處理24 h,用不含EDTA的胰酶消化、離心細胞,磷酸鹽緩沖液重懸并離心細胞2次,收集細胞制成單細胞懸液,使用Annexin-V/PI雙染料聯合標記,避光孵育20 min,流式細胞儀檢測各組細胞凋亡率。

1.2.4CoCl2體外模擬缺氧模型建立 參照“1.2.2節”以CoCl2(50、100、200、400、800 μmol·L-1)干預HUVECs 24 h,MTT法檢測CoCl2對細胞增殖的影響,和參照“1.2.5”項CoCl2(50、100 μmol·L-1和5、10、20、40 μmol·L-1)干預HUVECs 24 h,Western blotting檢測HUVECs的HIF-1α蛋白表達水平,以選擇合適濃度的CoCl2建立體外模擬缺氧模型。

1.2.5Western blotting檢測 以每孔106個HUVECs接種至6孔板,待細胞貼壁后,經EVO或(和)CoCl2干預24 h,使用RIPA裂解液提取細胞內總蛋白,BCA法測定總蛋白濃度,加入5倍十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)上樣緩沖液稀釋為1倍工作液,置于金屬浴中加熱10 min使蛋白變性。然后使用8%～10% SDS-PAGE凝膠電泳分離目的蛋白,采用濕轉法將目的蛋白轉印至PVDF膜上,5%脫脂奶粉室溫封閉4 h,分別放入鼠抗β-actin抗體、兔抗HIF-1α、PFKFB3、VEGFR2抗體中(1：1 000稀釋),4 ℃孵育過夜。經TBST緩沖液洗滌5 min,重復3次后,加入辣根過氧化酶(horseradish peroxidase,HRP)標記二抗,室溫孵育1 h,TBST緩沖液再洗滌3次后采用電化學發光法顯影,拍照并保存圖像。使用ImageJ軟件測量條帶灰度值,β-actin作為內參,分析目的蛋白相對表達水平。

2 結果

2.1EVO對HUVECs、HepG2細胞增殖的影響 MTT檢測結果顯示,EVO對HUVECs、HepG2細胞的增殖均有顯著抑制作用(P<0.05或P<0.01),對HUVECs、HepG2細胞IC50分別為1.15、1.07 μmol·L-1。由此可見,EVO對HUVECs抑制作用較對HepG2細胞稍弱,但抑制程度基本一致(圖1)。

①與對照組比較,t=2.420,P<0.05;②與對照組比較,t=7.436～32.403,P<0.01。

2.2EVO對HUVECs誘導凋亡的影響 流式細胞術檢測結果顯示,各組EVO作用濃度分別為0、0.1、0.2、0.4 μmol·L-1,HUVECs凋亡率逐漸升高,分別為5.05%、7.26%、8.30%、8.61% (P<0.01),見圖2。

①與對照組比較, t=-8.131,-8.461,-12.356,P<0.01。

2.3EVO對HUVECs的HIF-1α、PFKFB3和VEGFR2蛋白表達的影響 Western blotting檢測結果顯示,常氧條件下EVO對細胞的HIF-1α、Warburg效應的主要關鍵酶PFKFB3(內皮細胞主要表達的PFK的同工酶)沒有明顯下調作用,但對VEGFR2有明顯的下調作用(P<0.01)(圖3)。

①與對照組比較,t=6.706,7.867,P<0.01。

2.4CoCl2體外模擬缺氧模型的建立及CoCl2對HUVECs糖酵解代謝的影響 不同濃度CoCl2干預HUVECs 24 h,MTT檢測結果見圖4,隨著CoCl2濃度的增加,HUVECs增殖有所增加,CoCl2作用濃度≤50 μmol L-1時,HUVECs增殖活性沒有受到明顯影響,也沒有細胞毒性;100～400 μmol·L-1CoCl2明顯促進生存率(P<0.01),800 μmol·L-1CoCl2時HUVECs生存率明顯下降,濃度過高出現細胞毒現象,可能是體外細胞的非特異性死亡,但這么高的濃度才有抑制生長作用也說明CoCl2的細胞毒性很低。

①與對照組(0 μmol·L-1CoCl2)比較, t=-15.337～5.109,P<0.01。

Western blotting檢測結果(圖4)顯示,常氧對照組HIF-1α蛋白表達水平很低,而隨著CoCl2濃度的增加,CoCl2激活HIF-1α表達明顯增加(P<0.01),說明CoCl2誘導的高表達HIF-1α的模型已成功建立。在HIF-1α高表達條件下,糖酵解關鍵酶PFKFB3與HIF-1α共同高表達,且均隨CoCl2濃度升高而升高(P<0.01)。CoCl2濃度>5 μmol·L-1可顯著提高HIF-1α的表達,但>50 μmol·L-1明顯影響生存率,因此模擬缺氧模型的CoCl2合適濃度范圍為5～50 μmol·L-1,選擇對HUVECs生存率影響較小又顯著提高HIF-1α蛋白表達的20 μmol·L-1CoCl2來建立模擬缺氧模型。

2.5EVO對內皮細胞代謝機制的影響 Western blotting結果(圖5)顯示,在常氧條件下EVO組HIF-1α、PFKFB3蛋白沒有明顯改變,而在CoCl2組即模擬缺氧模型組中HIF-1α、PFKFB3表達皆非常顯著地升高(P<0.01),并且聯合組(EVO+CoCl2)被CoCl2上調的HIF-1α、PFKFB3蛋白表達均受到EVO抑制(P<0.01),說明EVO在模擬缺氧條件下才抑制HIF-1α、PFKFB3,在常氧下沒有此作用。HIF的激動劑CoCl2能上調EVO對PFKFB3的作用(P<0.05),說明EVO對PFKFB3的抑制是通過抑制HIF實現的。

①與對照組比較,t=-17.379～-4.670,P<0.01;②與EVO組比較,t=-3.202、-2.886,P<0.05;③與CoCl2組比較,t=4.196、9.350,P<0.05; ④與對照組比較,t=-4.255、-3.188,P<0.05;⑤與CoCl2組比較,t=26.963、4.387,P<0.01;⑥與EVO組(0.2、0.4 μmol·L-1)比較,t=-2.526、-3.836、-5.107,P<0.01。

在常氧條件下VEGFR2蛋白表達在EVO組中明顯下調(P<0.01),而在CoCl2組中明顯升高,說明HIF-1α能上調VEGFR2表達,在聯合組中VEGFR2蛋白表達仍受到EVO明顯抑制(P<0.01),聯合組與EVO組的抑制作用相差不大,說明CoCl2不能逆轉EVO對VEGFR2的抑制,EVO下調VEGFR2不是通過HIF通路實現的,也就是說,EVO可獨立地抑制VEGFR信號通路。

MTT檢測結果顯示,CoCl2作用濃度為20 μmol·L-1時,HUVECs增殖活性沒有受到明顯影響,在EVO濃度為0.4 μmol·L-1時,HUVECs增殖活性受到明顯抑制(P<0.01);在模擬缺氧條件下0.4 μmol·L-1EVO仍能抑制細胞增殖生長(P<0.01),但此抑制作用被CoCl2減弱,即CoCl2能夠逆轉EVO對細胞增殖生長的抑制作用(P<0.05),說明EVO是通過HIF抑制HUVECs增殖生長。

3 討論

20世紀20年代,德國生物化學家Otto Warburg發現,與正常細胞比較,快速增殖的腹腔積液腫瘤細胞以驚人的高速率消耗葡萄糖,但它并不是完全用于氧化生成CO2和H2O,而是以乳酸的形式分泌并堆積為主,這種現象被稱為瓦伯格效應,即指癌細胞無論有氧還是無氧均可進行大量的糖酵解。有學者提出,除腫瘤細胞外,大量糖酵解適用于所有的增殖細胞[5]。由于腫瘤細胞惡性增殖,腫瘤中心區域嚴重的缺氧狀態是大多數實體腫瘤普遍存在的現象,這導致了腫瘤細胞代謝的改變,腫瘤細胞可通過穩定缺氧誘導因子并誘導其下游靶基因的激活,包括血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)、代謝關鍵酶基因HK2等[8],當大量分泌的促血管生成因子超過抗血管生成因子占據主導地位時,血管內皮細胞迅速地從分裂的休眠狀態中被喚醒,同時開始大量地增殖、遷移,同樣需要高速率的糖酵解來滿足其生物合成和能量需求,而增殖、遷移的內皮細胞逐漸形成管狀樣的病理性血管。目前抑制血管生成以饑餓腫瘤已成為臨床批準的有效治療方法,其中最經典的是阻斷VEGF/VEGFR通路以抑制新生血管的生長[9],幾乎在所有內皮細胞上都有表達VEGFR2,它主要通過與VEGFA結合后激活下游一系列的細胞信號通路,導致內皮細胞增殖、遷移以及腫瘤新生血管的形成。因此,建立體外模擬缺氧模型對于研究內皮細胞的代謝非常有必要。目前常用的有物理和化學2種缺氧模型,其中,物理缺氧模型是最好的選擇,但由于其需要昂貴的儀器設備和更為嚴謹的操作而限制了推廣應用。而以CoCl2化學誘導法建立的體外模擬缺氧模型在常氧條件下就能夠穩定細胞內HIF-1α蛋白的表達,因此也得到了普遍的認可[10]。目前已有報道指出CoCl2對多種類型的腫瘤細胞刺激的敏感性和耐受性不同[11],因此需要確定CoCl2對HUVECs增殖影響較小又能顯著激活HIF-1α蛋白表達的合適濃度以建立體外模擬缺氧模型。

EVO是中藥吳茱萸的主要藥效成分。吳茱萸始載于《神農本草經》,列為中品;《中華人民共和國藥典》記載:吳茱萸,性熱,味辛、苦,有小毒;歸肝、脾、胃、腎經;功效:散寒止痛,降逆止嘔。由吳茱萸、黃連組成的左金丸源自朱丹溪的《丹溪心法》,主治肝胃不和,中醫臨床多用于消化系統疾病,而消化系統腫瘤多伴有肝胃不和證。本課題組前期已證實EVO對多株人肝癌細胞有明顯抑制增殖生長、抑制瓦伯格效應和誘導凋亡作用;并能明顯抑制小鼠肝癌移植瘤生長和延長荷瘤小鼠生存期。有研究證明EVO可以下調人結直腸癌HCT116中HIF-1α、VEGFA基因和蛋白的表達[12],還可以降低移植瘤組織中β-連環蛋白、VEGFA蛋白的表達和CD31、CD34的水平[13]。盡管目前對腫瘤血管增生與內皮細胞代謝、Warburg效應的關系已有不少文獻報道,但EVO通過抑制內皮細胞代謝抗血管增生未見文獻報道。

本研究結果表明,EVO對HUVECs 24 h的IC50為1.15 μmol·L-1,故選擇低于IC50的EVO濃度進行后續實驗。常氧條件下,EVO對HUVECs的HIF-1α、PFKFB3沒有明顯下調作用,提示EVO對正常血管內皮細胞代謝沒有影響;MTT檢測結果表明在CoCl2作用濃度≤50 μmol·L-1時,HUVECs增殖活性沒有受到明顯影響,也沒有細胞毒性,同時Western blotting檢測結果顯示HUVECs的HIF-1α蛋白表達水平顯著高于常氧對照組,這表明以CoCl2化學誘導模擬缺氧模型建立成功,PFKFB3與HIF-1α共同高表達,且均隨CoCl2濃度升高而升高,說明HIF-1α的高表達能促進內皮細胞的糖酵解,并選擇模擬缺氧模型的CoCl2作用濃度為20 μmol·L-1。EVO僅在模擬缺氧模型中有下調PFKFB3的作用,只影響HIF高表達的血管內皮細胞的糖酵解。研究表明,阻斷PFKFB3可使HUVECs增殖和遷移能力減弱,抑制了移植瘤中腫瘤血管的生成及誘導腫瘤血管正常化[14-15];在血液系統中毛細血管內皮細胞的糖酵解速率更快、增殖能力更強,并且在血管分支形成的過程中其糖酵解速率還會進一步提高[16]。因此,EVO在模擬缺氧條件下可能下調PFKFB3進而抗腫瘤血管增生。CoCl2不能逆轉EVO下調VEGFR的作用,說明雖然HIF能影響VEGFR表達,但EVO抑制VEGFR不是必須通過HIF通路實現的,即EVO可能分別獨立地抑制HIF、VEGFR這兩條信號通路。綜上所述,本研究顯示EVO可能通過HIF和VEGFR通路抑制內皮細胞的瓦伯格效應及增殖,從而抗腫瘤血管增生。