柴胡4種活性成分的體外抗氧化作用*

王淑惠,劉澤干,黃小鳳,雷攀,王莉博,江明珠,蔡華,杜士明,

(1.湖北醫藥學院藥學院,十堰 442000;2.湖北醫藥學院附屬太和醫院科研處,十堰 442000;3.湖北醫藥學院武當特色中藥研究湖北省重點實驗室,十堰 442000)

柴胡(Bupleurumchinese)是傘形科植物柴胡(Bupleurumchinese DC.)或狹葉柴胡(Bupleurumscorzonerifolium willd.)的干燥根,具有疏散退熱、疏肝解郁、升舉陽氣等功效[1]。柴胡治療肝病的歷史悠久,張仲景《傷寒論》中記載小柴胡湯具有疏肝利膽、化濁解郁的功效[2];宋代《太平惠民和劑局方》中記載逍遙散,由柴胡、當歸、炒白術等8味中藥組成,用于肝郁氣滯所致疾病[3]等,在以柴胡為君藥的經典名方中,其主要發揮疏肝解郁的作用[4]。研究發現,柴胡的主要成分是柴胡多糖、柴胡黃酮、柴胡皂苷、柴胡揮發油等,具有抗氧化、抗炎、解熱、抗病毒和抗腫瘤等藥理作用,其主要成分可通過清除自由基、增強抗氧化酶活性等途徑發揮抗氧化的作用[5-6]。謝志明等[7]研究柴胡多糖減輕氧化反應,發揮小鼠肝損傷的保護作用;張娜等[8]研究發現,柴胡皂苷d抑制人正常肝細胞焦亡和上皮間質轉化減輕肝纖維化,但是柴胡4種活性成分抗氧化保肝作用及比較筆者尚未見報道。

慢性肝病持續進展可致肝炎、肝纖維化、肝硬化和肝癌[9]。氧化應激是影響慢性肝病發生發展的主要因素之一,體內氧化與抗氧化系統的動態失衡導致肝細胞功能和結構破壞,促進炎癥反應,進一步加重氧化應激并誘導肝細胞持續性損傷[10]。因此,抗氧化應激為慢性肝病提供新的治療策略。柴胡及其復方制劑在臨床上被運用于預防和治療肝臟疾病,謝維寧等[11]研究柴胡疏肝散改善非酒精性脂肪肝患者的肝功能;劉靜等[12]研究小柴胡湯減輕非酒精性脂肪性肝炎模型小鼠的病理損傷,改善小鼠肝臟功能等,但柴胡的活性成分基于抗氧化發揮保護慢性肝病的作用需進一步明確,因此本研究通過提取柴胡4種活性成分,采用1,1-二苯基-2-三硝基苯肼[1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl radical 2,2-diphenyl-1-(2,4,6-trinitrophenyl)hydrazyl,DPPH]法和2,2-聯氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二銨鹽[2,2'-azinobis-(3-ethylbenzthiazoline-6-sulpho-nate),ABTS]法比較其化學抗氧化作用強弱,篩選出抗氧化活性較好的柴胡3種活性成分,對過氧化氫(H2O2)誘導人正常肝細胞(LO2)的損傷模型進行干預,測定細胞存活率、抗氧化酶活性及丙二醛等指標,評價并比較柴胡3種活性成分的抗氧化作用,為柴胡在臨床上治療慢性肝病提供理論依據。

1 儀器與材料

1.1儀器 TU-1901型紫外分光光度儀(北京普析通用儀器有限責任公司);TS100型生物倒置顯微鏡(日本Olympus公司);HERACE11型二氧化碳(CO2)恒溫培養箱(美國Thermo Fisher公司);RE-3000A型旋轉蒸發儀(上海亞榮生化儀器廠);SB-079型多功能酶標儀(美國Thermo Scientific公司);SF-TDL-5A型臺式離心機(上海菲恰爾分析儀器有限公司)。

1.2藥物及試劑 柴胡飲片購于湖北神農本草中藥飲片有限公司(批號:20220301),由湖北醫藥學院杜士明教授鑒定為傘形科柴胡屬植物北柴胡(BupleurumchineseDC.)的干燥根,按2020年版《中華人民共和國藥典》中柴胡項下檢查,符合各項要求;DPPH、ABTS和乙醇等試劑購自阿拉丁試劑上海有限公司;達爾伯克改良伊格爾培養基和胎牛血清購自Gibco公司;水為純化水。

1.3細胞系 LO2由湖北醫藥學院附屬太和醫院生物醫學研究所饋贈,培養條件:37 ℃、5%CO2;培養液:含10%胎牛血清的達爾伯克改良伊格爾培養基,實驗選用對數生長期細胞。

2 方法與結果

2.1柴胡4種活性成分的提取及含量測定

2.1.1柴胡多糖的提取及含量測定 采用水提醇沉法[13]提取柴胡多糖,稱取柴胡飲片100 g,加入純化水750 mL,回流提取3 h,濾過,減壓濃縮,離心(4 000 r·min-1,r=32 mm,15 min,下同),取上清液,加入95%乙醇使提取液中乙醇濃度達60%,冷藏靜置過夜后,離心收集沉淀物,20 mL水復溶,加入等體積Sevage試劑[三氯甲烷-正丁醇(4：1)],劇烈振搖后離心,除去蛋白層,得柴胡多糖溶液,4 ℃保存備用。

以無水葡萄糖作為對照,采用苯酚硫酸法[14]測定柴胡多糖含量,精密吸取柴胡多糖溶液1.0 mL,置于冰水浴中,依次加入5%苯酚和95%濃硫酸各5.0 mL,搖勻后冷卻,室溫放置20 min,采用紫外-可見分光光度法于487 nm波長測定其吸光度(A值)。通過計算得標準曲線回歸方程:Y=0.007 5X+0.049 9,R2=0.999 2,測算得柴胡多糖的含量5.78 mg·mL-1。

2.1.2柴胡黃酮的提取及含量測定 采用堿溶酸沉法[15]提取柴胡黃酮,取柴胡飲片50 g,加入85%乙醇500 mL,回流提取2 h,減壓濃縮成浸膏狀,加入5%碳酸鈉(Na2CO3)溶液溶解粗提取物20 mL,再緩慢加入濃鹽酸(HCl),pH值為2時抽濾,收集沉淀,反復2次堿溶酸沉過程,低溫干燥法得柴胡黃酮,4 ℃保存備用。

以蘆丁作為對照,稱取柴胡黃酮提取物86.8 mg,加入60%乙醇50 mL溶解,精密吸取10.0 mL,依次加入5%亞硝酸鈉(NaNO2)1.0 mL、硝酸鋁[Al(NO3)3]1.0 mL和氫氧化鈉(NaOH)溶液(1 mol·L-1) 10.0 mL,搖勻后放置15 min,采用紫外-可見分光光度法于波長506 nm處測定A值[16],通過計算得標準曲線回歸方程Y=0.992 9X+0.036 7,R2=0.999 8,測算得柴胡黃酮的含量1.071 mg·mL-1。

2.1.3柴胡皂苷的提取及含量測定 采用熱回流法[17]提取柴胡皂苷,取柴胡飲片100 g,加入70%乙醇2 000 mL,加熱回流提取150 min,趁熱濾過并濃縮,得乙醇浸膏,正丁醇萃取3次,合并萃取液減壓濃縮,乙醇溶解得柴胡皂苷溶液。以柴胡皂苷A為對照,采用紫外-可見分光光度法[17]測定柴胡皂苷含量,依次加入5%香草醛-冰醋酸溶液0.2 mL和高氯酸0.8 mL,60 ℃恒溫水浴15 min,冷卻至室溫,再加入冰醋酸,于波長610 nm處測A值。通過計算得標準回歸方程Y=0.437 3X+0.091 2,R2=0.991 2,測算得柴胡皂苷的含量0.484 g·mL-1。

2.1.4柴胡揮發油的提取及含量測定 采用水蒸氣蒸餾法提取柴胡揮發油[18],取柴胡飲片100 g,加入10%NaCl溶液1 200 mL,水蒸氣蒸餾,收集初餾液進行重蒸餾得到柴胡揮發油精提液50 mL。以柴胡注射液為對照,通過紫外-可見分光光度法[18]測定柴胡揮發油濃度,甲醇溶解揮發油精提液,于波長276 nm處測定A值,分別測得柴胡揮發油精提液和柴胡注射液的吸光度為A1和A2,計算得柴胡揮發油含量1.893 g·mL-1(生藥含量)。

2.2柴胡4種活性成分化學抗氧化活性的測定

2.2.1DPPH法測定自由基清除能力 DPPH測定液的配置:分別量取等倍稀釋濃度的柴胡多糖、黃酮、皂苷和揮發油溶液各2 mL,分別加入DPPH乙醇溶液(0.1 mmol·L-1) 2 mL,搖勻后室溫避光30 min,即得DPPH測定液[19]。

DPPH清除能力的測定:采用紫外-可見分光光度法于517 nm波長測定樣品溶液吸光度(Ai)、空白組吸光度(A0)和無水乙醇對照組吸光度(Aj)。依據“公式1”計算得標準曲線回歸方程,采用SPSS 25.0版軟件計算得半數抑制濃度(half maximal inhibitory concentration,IC50),結果見表1和圖1。

圖1 4種活性成分的濃度與DPPH自由基清除能力的關系

表1 柴胡4種活性成分的DPPH自由基清除能力

DPPH自由基清除率(%)=[A0-(Ai-Aj)]/A0×100%

(公式1)

柴胡4種活性成分對DPPH自由基清除能力隨一定濃度升高而增強,IC50值分別為38.718 μg·mL-1(柴胡多糖)、51.297 μg·mL-1(柴胡黃酮)、3.149 mg·mL-1(柴胡皂苷)和2.426 g·mL-1(柴胡揮發油),而柴胡揮發油的最大提取濃度1.893 8 g·mL-1,無法達到其IC50值,表明柴胡揮發油對DPPH清除能力不足。由此得出,柴胡4種成分DPPH自由基清除能力與柴胡多糖、黃酮和皂苷密切相關。

2.2.2ABTS法測定自由基清除能力 ABTS測定液配置:取等體積ABTS溶液和過硫酸鉀溶液,混勻得ABTS工作液。分別量取等倍稀釋濃度的柴胡多糖、黃酮、皂苷和揮發油溶液各1.0 mL,依次加入ABTS工作液2.0 mL,混勻后室溫避光30 min,即得 ABTS測定液[20]。

ABTS清除能力的測定:采用紫外可見光分光度法于波長734 nm處測定樣品溶液吸光度(Ai),空白組吸光度(A0)。依據“公式2”計算得標準曲線回歸方程,采用SPSS 25.0版統計軟件計算得IC50,結果見表2和圖2。

圖2 4種活性成分的濃度與ABTS自由基清除能力的關系

表2 柴胡4種活性成分的ABTS自由基清除能力

ABTS自由基清除率(%)=(A0-Ai)/A0×100%

(公式2)

柴胡4種活性成分對ABTS自由基清除能力隨一定濃度范圍升高而增強,IC50值分別為130.931 μg·mL-1(柴胡多糖)、351.484 μg·mL-1(柴胡黃酮)、5.422 mg·mL-1(柴胡皂苷)和2.241 g·mL-1(柴胡揮發油),而柴胡揮發油的最大提取濃度1.893 8 g·mL-1時,對ABTS自由基清除率僅為39.80%,無法達到其IC50值,表明柴胡揮發油對ABTS清除能力不足。由此得出,柴胡發揮ABTS自由基清除能力與柴胡多糖、黃酮和皂苷密切相關。

2.3柴胡3種活性成分體外抗氧化活性的測定

2.3.1H2O2誘導LO2氧化損傷模型的建立 采用噻唑藍法檢測不同濃度H2O2誘導LO2細胞的存活率。培養LO2細胞,制備成單細胞懸液,按每孔100 μL(含細胞5×103個) 接種于96孔板中,設模型組(0 μmol·L-1H2O2)、對照組(100、200、300、400、500、600、700、800、900 μmol·L-1H2O2)和空白組(只加入培養液),每組設置5個復孔,于37 ℃、5% CO2下培養24 h,棄去培養液,每孔加入含有10%噻唑藍(0.5 mg·mL-1)的培養液100 μL,培養箱中孵育4 h后,加入二甲亞砜150 μL,搖床溶解15 min,于酶標儀λ=570 nm處測定A值,根據“公式3”計算細胞存活率,結果見圖3。

①與0 μmol·L-1 H2O2組比較,t=3.063～20.19,P<0.05。

細胞存活率(%)=(模型組A值-空白組A值)/(對照組A值-空白組A值)×100%

(公式3)

細胞存活率隨H2O2濃度增加而降低,當H2O2濃度為800 μmol·L-1時,細胞存活率降低至50%。因此實驗選取800 μmol·L-1H2O2作用24 h作為后續誘導LO2細胞氧化損傷模型的條件[21]。

2.3.2柴胡多糖、黃酮、皂苷的細胞毒性實驗 采用噻唑藍法測定柴胡多糖、黃酮、皂苷對LO2的細胞毒性,培養LO2細胞,制備成單細胞懸液,按每孔100 μL(含細胞5×103個) 接種于96孔板中,設正常對照組(不做任何處理),給藥組(給予不同濃度的柴胡多糖、黃酮、皂苷,二甲亞砜為溶媒)和空白對照組(只加入培養液),每組設置5個復孔,細胞存活率檢測依據“2.3.1節”,結果見圖4。

①與正常對照組比較,t=2.942～21.74,P<0.05。

LO2細胞存活率隨藥物濃度增加而降低,與正常對照組比較,當給予柴胡多糖(6.936 μg·mL-1)、柴胡黃酮(32 μg·mL-1)、柴胡皂苷(60 μg·mL-1)時,細胞存活率下降至90% (P<0.05)。因此實驗分別選取柴胡多糖的低中高濃度(2.312、4.624、6.936 μg·mL-1)、柴胡黃酮的低中高濃度(16、24、32 μg·mL-1)和柴胡皂苷的低中高濃度(20、40、60 μg·mL-1)作為LO2 細胞氧化損傷的作用濃度。

2.3.3柴胡多糖、黃酮、皂苷對H2O2誘導LO2氧化損傷模型存活率 采用噻唑藍法測定不同濃度柴胡多糖、黃酮和皂苷對細胞存活率的影響,設置正常對照組(不做任何處理),模型對照組(采用800 μmol·L-1H2O2誘導24 h),實驗組(分別同時用低、中、高濃度的柴胡多糖、黃酮、皂苷預處理LO2細胞6 h后,800 μmol·L-1H2O2誘導24 h),檢測方法與“2.3.1節”相同,結果見圖5。

①與正常對照組比較,t=30.16,P<0.01;②與模型對照組比較,t=3.630～10.90,P<0.05。

與正常對照組比較,模型對照組LO2細胞存活率顯著下降至51.65% (P<0.01);與模型對照組比較,柴胡多糖、黃酮和皂苷呈劑量依賴提高LO2細胞存活率,柴胡多糖(6.936 μg·mL-1)、柴胡黃酮(32 μg·mL-1)和柴胡皂苷(60 μg·mL-1)分別顯著提高LO2細胞存活率至63.92%、60.85%和67.47% (P<0.05)。因此實驗分別選取柴胡多糖(6.936 μg·mL-1)、柴胡黃酮(32 μg·mL-1)和柴胡皂苷(60 μg·mL-1)作為LO2 細胞氧化損傷的作用濃度。

2.3.4谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase,GSH-Px)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)活性及丙二醛(malondialdehyde,MDA)含量測定 試劑盒檢測柴胡3種活性成分對模型細胞中GSH-Px、SOD活性及MDA含量的影響。將LO2細胞接種于6孔培養板中,設正常對照組(不做任何處理)、模型對照組(800 μmol·L-1H2O2誘導24 h)、實驗組(柴胡多糖、黃酮、皂苷預處理細胞6 h后,800 μmol·L-1H2O2誘導24 h);棄去上清液,加入細胞裂解液,冰上裂解30 min后,4 ℃下離心(12 000 r·min-1,r=32 mm,15 min),棄去沉淀,試劑盒檢測GSH-Px酶活性、SOD酶活性和MDA含量,結果見圖6。

A.正常對照組;B.模型對照組;C.柴胡多糖組;D.柴胡黃酮組;E.柴胡皂苷組。 ①與正常對照組比較,t=9.886～16.71,P<0.05;②與模型對照組比較,t=4.81～13.65,P<0.05。

與正常對照組比較,模型對照組GSH-Px、SOD酶活性下降至11.17,35.18 U·mg-1(P<0.05),MDA含量提高至4.51 μmol·g-1(P<0.05);給予柴胡多糖(6.936 μg·mL-1)、柴胡黃酮(32 μg·mL-1)和柴胡皂苷(60 μg·mL-1)后,細胞內GSH-Px酶活性顯著增加至15.81,17.10和17.06 U·mg-1(P<0.05),SOD酶活性顯著增加至46.79,47.11和52.05 U·mg-1(P<0.05),MDA含量顯著降低至2.34,2.28和2.11 μmol·g-1(P<0.05)。結果表明柴胡多糖、黃酮、皂苷能顯著提高H2O2誘導LO2細胞氧化損傷的GSH-Px和SOD酶活性,降低MDA含量,其中柴胡皂苷作用最顯著。

3 討論

氧化應激是指機體或細胞暴露于氧化因子引起的損傷,同時機體自由基異常升高導致氧自由基累積,誘導細胞衰老、凋亡或壞死[22]。DPPH和ABTS法是體外評價自由基清除能力的常用方法[23],本實驗通過該方法測定并比較柴胡4種活性成分清除自由基作用的強弱,結果表明柴胡多糖、黃酮和皂苷具有較好的自由基清除能力。GSH-Px酶、SOD酶和MDA是反映機體氧化和抗氧化水平的重要指標,當肝細胞受到H2O2誘導時,氧化與抗氧化水平失衡,引起GSH-Px酶和SOD酶表達水平下降,MDA表達水平升高[22]。本實驗構建了H2O2誘導LO2模型,分別給予柴胡多糖、黃酮和皂苷干預,并測定GSH-Px酶、SOD酶和MDA的水平,結果顯示柴胡皂苷的抗氧化作用最顯著,為柴胡基于抗氧化治療慢性肝病提供理論依據。

3.1實驗結果與柴胡常用制劑的作用和用途相互印證 小柴胡湯、護肝片等均是以柴胡為君藥制成的制劑,主要成分為柴胡多糖、黃酮和皂苷等,具有抗氧化、提高免疫力等藥理作用,在臨床上主要用于治療慢性肝炎、肝硬化等肝臟疾病[24];柴胡注射液是柴胡經水蒸氣蒸餾法制成的溶液,主要成分為揮發油,具有解熱、鎮痛等藥理作用,在臨床上用于治療感冒及瘧疾等疾病引起的發熱[25]。本實驗結果提示柴胡4種活性成分中,柴胡多糖、黃酮和皂苷強于柴胡揮發油,因此本實驗印證了柴胡不同制劑發揮不同藥理作用與其活性成分密切相關。

3.2對柴胡產品開發的啟示 柴胡具有植物抗生素的[26]稱謂,揮發油是發揮解熱鎮痛作用的物質基礎,而柴胡注射液在臨床應用中風險高,成分復雜易引起不良反應,12歲以下兒童禁用,但這類人群又是呼吸道感染的好發群體。王莉博等[27]將揮發油制成栓劑,為治療12歲以下兒童治療呼吸道感染提供了安全、可靠的治療方案。臨床上常將柴胡煎煮成湯劑,此過程中揮發油部分揮發較多,若將柴胡提取成解熱和抗氧化兩大物質群,分為揮發油和多糖、黃酮和皂苷等,以顆粒劑的方式供應市場,將有利于合理運用中藥柴胡資源。

3.3對柴胡種植業的啟發 不同產地、采收時間柴胡的活性成分不盡相同[28],鄂西北地區柴胡多糖、黃酮和皂苷的含量與柴胡不同采收期密切相關,分別在種子成熟11、10、7月份采收最佳[29];產地甘肅、山西的柴胡皂苷的含量較高[30]。因此,可以根據使用柴胡的不同活性成分選取不同產地及適宜采收時間,獲取柴胡最大利用價值。

本實驗僅對柴胡單一活性成分抗氧化保肝作用進行探討,后期研究主要以柴胡皂苷為主,分析其關鍵活性成分和結構,在體內外探究其抗氧化改善慢性肝病的作用及分子機制,進一步探究柴胡3種成分在體內外協同抗氧化保肝作用及機制,為綜合開發和應用柴胡中藥資源奠定理論基礎。