基于UPLC-Q-Orbitrap HRMS的痂狀炭角菌子實體化學成分分析

王志花, 劉國慶, 韓東晶, 周 寧, 楊少華, 汪文君

(合肥工業大學 食品與生物工程學院,安徽 合肥 230601)

炭角菌(Xylariasp.)屬真菌集中分布在溫帶、亞熱帶和熱帶地區,其中的主要化學成分是萜類、生物堿、甾醇及聚酮等次生代謝產物,已發現炭角菌的菌絲體或發酵液具有抗炎[1]、細胞毒[1]、抗真菌[2]、抗菌[3]、抗瘧[4]、抑制α-葡萄糖苷酶[4]、抗線蟲[5]和神經保護活性[6]。近年來,從炭角菌中不斷發現一些新的生物活性成分[7-11]。表明該真菌屬可能是開發藥用化合物的一個有前途的來源。目前,炭角菌的研究工作主要集中在化學成分的分離與鑒定及藥理作用研究等方面,使用液質聯用技術對痂狀炭角菌(Xylariasp.L1)子實體化學成分進行分析的相關報道并不多[12]。本課題組于 2019年開始該菌的研究工作,目前已成功馴化一個痂狀炭角菌菌種,建立了完善的實驗室人工培養方案。前期研究表明,痂狀炭角菌具有高效率利用生物質的特點,其發酵底物具有抗氧化的藥理活性。本文繼續研究該菌子實體活性成分,以明確痂狀炭角菌的化學成分,對揭示其化學物質基礎及配伍規律具有指導意義。

LTQ-Orbitrap 質譜儀綜合了 LTQ 的多級質譜功能以及 Orbitrap 的高分辨能力,可短時間內同時實現母、子離子的高分辨采集和多級質譜碎裂,顯著提高了對真菌復雜體系中化學成分的快速鑒定與分析能力[13]。因此,本文采用超高效液相色譜(ultra-high performance liquid chromatography UPLC)-四極桿-靜電場軌道阱高分辨質譜(quadrupole-orbitrap high-resolution mass spectrometry,Q-Orbitrap HRMS)技術對痂狀炭角菌子實體的主要化學成分進行快速、全面地鑒定,便于為進一步闡明該炭角菌的藥效物質奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

痂狀炭角菌(Xylariasp.L1)由本實驗室從廢棄白蟻窩中分離純化獲得,將痂狀炭角菌子實體50 ℃烘干至恒重后,粉碎后36目孔過篩密封備用。

乙腈、甲醇、甲酸均為色譜純試劑,購于賽默飛世爾科技有限公司;去離子水由Milli-Q 純水系統制備。

MS105DU電子天平(賽多利斯(上海)貿易有限公司);DHG-9146A電熱恒溫鼓風干燥箱(上海一恒科技有限公司);D3024R速微量冷凍離心機(北京大龍興創實驗儀器有限公司);MX-F渦旋振蕩器(武漢賽維爾生物科技有限公司);MTV-100多管渦旋混合儀(杭州奧盛儀器有限公司);JP-040S超聲波清洗器(深圳潔盟清洗設備有限公司);UltiMate 3000 RS色譜儀、Q Exactive質譜儀(賽默飛世爾科技(中國)有限公司)。

1.2 樣品的制備

稱量樣本約 200 mg,加入 1 mL 80% 甲醇[14-15],渦旋混勻。加入2～3顆二氧化鋯研磨珠,研磨提取 3 min;4 ℃條件下8 000 r/min離心10 min。取上清液過 0. 22 μm 微孔濾膜,即得。

1.3 液相和質譜條件

液相色譜條件如下:色譜柱為Welch RP-C18色譜柱(150 mm×2.1 mm,1.8 μm);流動相 A 為0.1%甲酸水溶液,流動相B為0.1%甲酸乙腈;流速為0.3 mL/min,進樣室溫度為10 ℃,柱溫為35 ℃;進樣量為5 μL;檢測波長為200～400 nm。梯度洗脫條件見表 1所列。

質譜條件如下:離子源為電噴霧離子源 (electrospray ionization source,ESI),正負離子模式檢測,離子源溫度為 350 ℃,鞘氣流速為30 L/min,輔助氣流速為10 L/min,掃尾氣流速為0.2 L/min,噴霧電壓為3 800 V,毛細管溫度為300 ℃,掃描模式為全掃描/數據依賴二級掃描(Full MS/dd-MS2),一級分辨率 70 000,二級分辨率17 500,二級離子碎片的質荷比(m/z)掃描范圍為150～2 000。

2 結果與分析

2.1 痂狀炭角菌子實體化學成分鑒定

將UPLC-QE所采集的原始數據導入 Thermo Compound Discover 2.0 (CD) 分析軟件進行初步計算,該軟件可充分利用高保真的Orbitrap數據來準確鑒定復雜基質中的化合物,通過定制相應的工作流程,結合了多種識別技術,包括與 mzCloud 庫、mzVault庫、Chemspider 庫進行碎片及分子量匹配,從而初步篩選得出痂狀炭角菌子實體提取物中可能存在的化合物。此外,借助 Thermo Xcalibur 2.2 分析軟件對質譜數據進行進一步分析和處理,根據高分辨質譜信息對其分子式進行推導,偏差不得大于5×106,對照參考文獻和上述在線數據庫,推導可能的裂解碎片,最終確定痂狀炭角菌子實體提取物中存在的化合物,該提取物的ESI-MS質譜總離子流圖如圖1所示,其化學成分鑒定結果見表2所列。

圖1 痂狀炭角菌子實體提取物的ESI-MS 質譜總離子流圖

表2 痂狀炭角菌子實體提取物化學成分鑒定結果

2.2 萜類化合物

萜類化合物以單萜、二萜、三萜及倍半萜等形式存在,本實驗從痂狀炭角菌子實體提取物中共鑒定了 6種萜類化合物,包括3種三萜和3種倍半萜。在二級碎裂過程中,萜類化合物的裂解特征主要為H2O、CO2H自由基和HCO2H分子離子的損失。以化合物25和27為例,化合物27,tR=17.36 min,正離子模式下得到準分子離子m/z為456.360 30的[M+H]+,預測其分子式為C30H48O4。母離子失去1個—OH形成m/z為439.356 230的[M+H-OH]+,再經過裂解形成2個離子碎片,其m/z為245.189 88、 175.148 15,前者依次失去—COOH和—C6H12形成碎片離子m/z為201.163 71的[M+H-COOH]+和m/z為119.085 76的[M+H-COOH-C6H12]+,后者丟失一分子甲基自由基形成m/z為161.132 57的[M+H-CH3]+。參考文獻[16-17]分析其可能的裂解途徑,結合在線網絡數據庫比對鑒定該化合物為齊墩果酸。質譜裂解途徑如圖2所示。同樣,對于化合物25,其在正離子模式下準分子離子為m/z為942.517 83的[M+H]+和m/z為965.506 35的[M+H+Na]+,二級質譜中存在m/z為796.373 03[M-rha]+、m/z為615.393 01 [M+H-rha-gal-H2O]+、m/z的439.356 23[gal+H-H2O]+等碎片離子。根據文獻[18]比對,可以確定該化合物為大豆苷元。根據上述總結,推斷化合物15、16、24、41分別為園柚酮、花姜酮、大豆皂苷Ⅱ和藿香醇。

圖2 齊墩果酸可能的裂解途徑

2.3 不飽和脂肪酸類化合物

本實驗從痂狀炭角菌子實體提取物中共鑒定了10個長鏈不飽和脂肪酸,其裂解方式相似,二級質譜中主要丟失 H2O、HCOOH、CO2等中性分子。以化合物34為例,在負離子模式下得到準分子離子m/z為303.230 57的[M-H]-,預測其分子式為C20H32O2。二級質譜中可見失去1分子 H2O形成的碎片m/z為285.222 20的[M-H-H2O]-,或依次失去1分子C7H13和1分子C3H5形成的碎片m/z為205.195 43的[M-H-C7H13]-、m/z為163.075 61[M-H-C3H5]-,或依次失去1分子HCOOH和1分子C2H4,形成的碎片m/z為259.242 86的[M-H-HCOOH]-、m/z為231.210 82的[M-H-HCOOH-C2H4]-。

經過數據庫檢索及與文獻[19]比對,可推斷該化合物為花生四烯酸。質譜裂解途徑如圖3所示。

圖3 花生四烯酸可能的裂解途徑

同理,根據相對分子質量、碎片離子與MassBank數據庫比對結果,推斷化合物19、26、28、29、31、33、35、38、39分別為芥子酸、棕櫚油酸、16(R)-HETE、二十碳五烯酸、11(Z),14(Z),17(Z)-二十碳三烯酸、α-桐酸、亞油酸、二十二碳三烯酸、油酸。

2.4 生物堿類化合物

本實驗從痂狀炭角菌子實體提取物中共鑒定了14種生物堿類化合物,包括化合物1～14。生物堿多以正離子形式存在,因此正離子模式響應很強,且二級質譜碎片離子多是以N+為中心發生斷裂,失去若干個甲基[20-21]。例如,化合物1的準分子離子m/z為268.103 52的[M+H]+,C10H13N5O4為其預測分子式,在二級質譜中,失去1分子呋喃核糖殘基形成碎片離子m/z為136.061 81的[M+H-C5H8O4]+,再丟失1分子 NH3形成m/z為119.035 46的[M+H-NH3]+,經過數據庫檢索比對,鑒定該化合物為腺苷。

腺苷可能的裂解途徑如圖4所示。

圖4 腺苷可能的裂解途徑

2.5 苯丙素類化合物

本實驗從痂狀炭角菌子實體提取物中共鑒定了4種苯丙素類化合物,包括1種香豆素和3種黃酮類化合物,已鑒定的多數苯丙素的結構相似,裂解特征主要為丟失 CO、CO2、CH3等中性分子。以化合物20和23為例。化合物23,tR=16.22 min,正離子模式下得到準分子離子m/z為163.038 60的[M+H]+,預測其分子式為C9H6O3。在二級質譜中,可見其分別丟失1分子CO或1分子CO2形成的碎片離子m/z為135.044 11的[M+H-CO]+、m/z為119.085 77的[M+H-CO2]+。根據化合物的二級質譜裂解特征,經過數據庫檢索及與文獻[22]比對,確認該化合物為7-羥基香豆素。質譜裂解途徑如圖5所示。化合物20,負離子模式下得到準分子離子m/z為269.045 750的[M+H]+,預測其分子式為C15H10O5。在二級質譜中,可見其分別丟失1分子CO或1分子C8H7O形成的碎片離子m/z為241.050 42的[M+H-CO]+、m/z為151.002 49的[M+H-C8H7O]+。根據化合物的二級質譜裂解特征,經過數據庫檢索及與文獻[23]比對,確認該化合物為染料木黃酮,質譜裂解途徑如圖6所示。

圖5 7-羥基香豆素可能的裂解途徑

圖6 染料木黃酮可能的裂解途徑

圖7 過氧化麥角甾醇可能的裂解途徑

2.6 甾體類化合物

本實驗從痂狀炭角菌子實體提取物中共鑒定了7種甾體類化合物,分別為睪酮、7α-羥基睪酮、孕酮、5α-二氫睪酮、11-酮本膽烷醇酮、過氧化麥角甾醇、諾龍葵酸酯。甾體類化合物A環和C環的合適位置上有雙鍵,容易進行RDA反應,產生RDA反應的產物離子。以化合物40為例,準分子離子m/z為429.335 97的[M+H]+,其預測分子式為C28H44O3,在二級質譜中,依次失去1分子水和1分子C9H12形成碎片離子m/z為411.325 29的[M+H-H2O]+、m/z為287.200 81的[M+H-H2O-C9H12]+,產生A環和D環上的烯鍵,接著進行RDA反應產生RDA產物離子m/z為191.106 63的[M+H-C4H6-C3H6]+,經過數據庫檢索,及與文獻[24]比對,推斷該化合物為過氧化麥角甾醇。質譜裂解途徑如圖 7所示。

3 結 論

本文采用UPLC-Q-Orbitrap HRMS技術快速、全面地對痂狀炭角菌(Xylariasp. L1)子實體的化學成分作出鑒定,最后確定成分有6種萜類、10種長鏈不飽和脂肪酸、14種生物堿、4種苯丙素、7種甾體類。在鑒別出的41種成分之外,痂狀炭角菌子實體提取物中有一些響應較好,但在已有的數據庫中未找到相應的分子量,說明痂狀炭角菌子實體中還有一些未知成分有待于進一步研究。

本實驗從痂狀炭角菌子實體中鑒定出的化學成分與前人分析炭角菌屬的化學成分有較大不同,倍半萜類化合物園柚酮、花姜酮,甾體類化合物睪酮、7α-羥基睪酮、孕酮、5α-二氫睪酮、11-酮本膽烷醇酮以及8種長鏈不飽和脂肪酸類化合物芥子酸、16(R)-HETE、二十碳五烯酸、11(Z),14(Z),17(Z)-二十碳三烯酸、α-桐酸、亞油酸、二十二碳三烯酸、油酸。在過去的研究中并不多。大豆苷元、黃豆黃素和染料木黃酮也為首次從炭角菌中鑒定出來,可能與本實驗用豆渣作為炭角菌的培養基有關。

本實驗雖然色譜峰沒有完全分開,但是通過數據庫比對確定總離子流圖中的化學成分,排除外界干擾,對不同種類的化合物進行部分質譜解析。研究結果表明,UPLC-Q-Orbitrap HRMS 技術可以快速系統地鑒定痂狀炭角菌子實體的化學成分,并對其化學成分進行初步的探索,可為該真菌的合理利用與開發提供依據。