卡格列凈對糖尿病腎病的保護作用及對TGF-β1和CTGF表達的影響

曹冰 張靜 陸晨

糖尿病腎病(diabetic kidney disease)是糖尿病患者嚴重的微血管并發癥之一,也是目前導致終末期腎病發生的主要原因之一。目前治療糖尿病腎病的最佳治療措施包括嚴格控制血糖、血壓及降低尿蛋白的排泄,雖然該病的治療方案選擇性很多,但這并沒有使糖尿病腎病發病率降低。鈉葡萄糖共轉運體2(sodium-glucose cotransporter 2,SGLT2)抑制劑是一種新型的糖尿病治療藥物,研究表明SGLT2抑制劑具有降糖、降壓、降低蛋白尿排泄、改善腎纖維化等腎臟保護作用[1]。研究證實,轉化生長因子β1(transforming grouth factor beta 1,TGF-β1)合成增加的許多原因是由于高血糖的作用,TGF-β1可導致基底膜增厚、系膜基質增生及腎小球結節性硬化的發生,促進腎臟纖維化發生,與此同時,結締組織生長因子(connective tissue grouth factor,CTGF)也是一種新的促進纖維化生長因子,它的表達在一定程度上受到TGF-β1的調節,在糖尿病腎病的組織中表達量增加,參與致腎臟纖維化的作用中。有研究表明SGLT2抑制劑可通過抑制糖尿病大鼠腎臟 TGF-β1的水平對大鼠的腎臟存在保護作用[1]。卡格列凈為目前臨床應用的SGLT2抑制劑之一,本實驗通過建立對照組、糖尿病腎病組、卡格列凈干預組3種大鼠模型,分別給予蒸餾水及卡格列凈藥物干預,觀察大鼠血糖變化、尿蛋白變化情況,同時評價卡格列凈對糖尿病腎病的保護作用機制及對TGF-B1及下游因子CTGF表達的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 由新疆醫科大學第一附屬醫院動物飼養中心提供SPF級雄性 Wistar 大鼠共28只,于新疆醫科大學動物實驗中心進行繁育。選8～10周齡,體重200～250 g進行飼養。飼養溫度(23±3)℃,相對濕度40%～70%。該研究通過新疆醫科大學實驗動物倫理委員會審批,倫理審批號:IACUC-20210425-14。

1.2 主要試劑 (1)45%高脂飼料(日糧型,大鼠)、普通飼料(對照組)(江蘇協同公司);(2)鏈脲菌素(sigma公司);(3)卡格列凈片(規格100 mg,生產企業:Janssen-CilagS.p.A.意大利);(4)RIPA裂解液、蛋白酶抑制劑(博士德公司);(5)山羊抗兔IgG H&L (HRP)、山羊抗小鼠IgG H&L (HRP)(Abcam公司);(6)Rabbit Anti-TGF beta 1 antibody、Rabbit Anti-CTGF antibody等(博奧森公司)。

1.3 主要儀器 手動單道移液器(德國Eppendorf公司 Research plus);羅氏(ROCHE)血糖儀家用血糖試紙(羅氏卓越型);電熱恒溫培養箱(上海精宏試驗設備有限公司DNP-9272);酶標儀(美國Bio-Rad xMarkTM);高速冷凍離心機(賽默飛世爾科技公司);漩渦混合器(海門市其林貝爾儀器制造有限公司);微量分光光度計(杭州奧盛Nano-100;BG-Power600i);常規電泳儀電源(北京百晶生物技術有限公司BG-Power600i);電泳儀(北京六一DYCZ-21);Real Time PCR instrument(美國ABI 7500 Fast);化學發光成像儀系統(上海勤翔科學儀器有限公司 Chemiscope 3000);蛋白轉膜儀[Bio-Rad(USA) Mini-PROTEAN Tetra system]。

1.4 方法

1.4.1 實驗分組:將28只雄性SD大鼠適應性喂養1周后,隨機數字表法隨機分為:對照組(8只);糖尿病腎病組(10只);卡格列凈干預組(10只)。

1.4.2 糖尿病腎病大鼠模型造模過程:大鼠普通飼料適應性喂養1周后,繼續給予高脂高糖飼料喂養4周(對照組大鼠給予普通飼料喂養4周),第5周第1天糖尿病腎病組和卡格列干預組大鼠腹腔注射鏈脲佐菌素50 mg/kg(pH值4.45、0.01 mol/L無菌檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液)1次,對照組大鼠注射等體積溶劑。注射第3天測隨機血糖1次,隨機血糖<11.1 mmo/L的大鼠,需重新注射1次STZ(50 mg/kg),7 d后,連續3 d尾靜脈取血,隨機血糖≥16.7 mmo/L,若大鼠出現多飲、多食、多尿、體重下降的典型的“三多一少”癥狀,以及尿檢白蛋白升高、毛發枯黃、精神萎靡、反應遲鈍等現象則證明造模成功。次日開始卡格列凈干預組給予卡格列凈 (10 mg/kg)灌胃,對照組及糖尿病腎病組給予蒸餾水(等體積)灌胃,持續灌胃37 d后處死大鼠。

1.4.3 標本的收集與處理:①血清樣本收集:大鼠處死以后,收集腹腔動脈血>1～2 ml,分離血清,保存于-80℃冰箱中,為檢測空腹血糖,大鼠處死12 h之前禁食;②組織樣本收集:大鼠處死后,收集腎臟組織,稱重完以后,在液氮速凍后,-80℃凍存,用于Westerm blot和RT-PCR檢測。

1.4.4 qRT-PCR檢測腎臟組織中TGF-β1、CTGF基因表達水平:取腎臟組織提取RNA,進行qRT-PCR檢測TGF-β1、CTGF基因表達水平。

1.4.4.1 RNA提取步驟:將組織在液氮包圍的情況下,研磨成粉,取100 mg加入有1 ml TRLZOL的離心管中,混勻。室溫放置>15 min。加入200 μl的氯仿,顛倒混勻后室溫放置5 min。4℃下12 000 r/mim離心15 min。吸取上清至另一個新的離心管中,加入等體積的異丙醇混勻,-20℃放置60 min。4℃下12 000 r/min離心15 min,小心倒掉上清液。加入75%的乙醇,使沉淀漂浮起來洗滌。4℃ 12 000 r/min離心15 min,小心倒掉上清液。重復上述步驟1次。空管離心,吸盡液體。用RNase free的水溶解沉淀。核酸蛋白定量儀檢測RNA濃度,瓊脂糖電泳檢測RNA完整性。RNA反轉錄用于后續實驗。

1.4.4.2 第一鏈cDNA合成。

1.4.4.3 熒光定量實驗:熒光定量PCR體系包含:Eva Green 2×qPCR MasterMix 10 μl、cDNA 1 μl、RNase-free Water Up to 20 μl,上下游引物各0.6 μl。熒光定量引物信息:Tgfb1-F:5’-CTGCTGACCCCCACTGATAC-3’,Tgfb1-R:5’-AGCCCTGTATTCCGTCTCCT-3’,CTGF-F:5’-CCCAACTATGATGCGAGCCA-3’,CTGF-R:5’-CATTGGTAACC CGGGTGGAG-3’,rat GAPDH_F:5’-CAGGGCTGCCTTCTCTTGTG-3’,rat GAPDH_R:5’-GATGGTGATGGGTTTCCCGT-3’。反應條件:95℃ 10 min 預變性;95℃ 15 s 變性; 60℃ 60 s 退火并延伸;循環40 次。

1.4.5 Westerm blot檢測腎臟組織中TGF-β1、CTGF蛋白表達水平:取腎臟組織提取蛋白,Western blot檢測TGF-β1、CTGF蛋白表達水平。

2 結果

2.1 3組大鼠血糖情況 糖尿病腎病組及卡格列凈干預組的大鼠血糖監測水平均明顯高于對照組,差異有統計學意義(P<0.05),卡格列凈干預組在給藥第18天后血糖水平明顯低于糖尿病腎病組,差異有統計學意義(P<0.05)。見表1。

表1 3組大鼠血糖情況 mmol/L,

2.2 3組大鼠尿液中蛋白情況 注射STZ第2、3天,糖尿病腎病組及卡格列凈干預組尿液中的蛋白含量均明顯高于對照組,差異有統計學意義(P<0.05);處死前糖尿病腎病組的尿蛋白定量水平明顯高于對照組(P<0.05),卡格列凈干預組明顯低于糖尿病腎病組,差異有統計學意義(P<0.05)。見表2。

表2 3組大鼠尿液中蛋白含量情況 mg/L,

2.3 3組大鼠組織中各基因表達情況 糖尿病腎病組及卡格列凈干預組的TGF-β1及CTGF的基因表達水平均明顯高于對照組,差異有統計學意義(P<0.05),卡格列凈干預組的TGF-β1及CTGF的基因表達水平明顯低于糖尿病腎病組,差異有統計學意義(P<0.05)。見表3。

表3 3組大鼠組織中各基因表達情況

2.4 3組大鼠腎臟組織各蛋白表達水平情況 糖尿病腎病組及卡格列凈干預組大鼠腎臟組織中的TGF-β1及CTGF蛋白表達水平均明顯高于對照組,差異有統計學意義(P<0.05),卡格列凈干預組大鼠腎臟組織中的TGF-β1及CTGF蛋白表達水平明顯低于糖尿病腎病組,差異有統計學意義(P<0.05)。見表4,圖1。

圖1 Western blot印跡檢測不同因子在3組中表達水平

表4 3組大鼠腎臟組織各蛋白表達水平情況

3 討論

糖尿病腎病是目前導致終末期腎病發生發展的主要原因之一,大約25%的糖尿病患者會出現持續性蛋白尿和(或)腎小球濾過率持續性下降[2]。腎間質纖維化的嚴重程度是反映糖尿病腎病患者腎功能下降程度和預后判斷的一項重要指標,也是DKD及其他慢性腎臟疾病進展為終末期腎病的共同致病機制[3]。持續高血糖的存在可以導致糖基化中間產物堆積以及脂蛋白代謝異常,使腎臟血流動力學發生變化,最終導致糖尿病腎病的發生[4]。既往研究證實,高血糖參與調解TGF-β1的合成,導致基底膜增厚、系膜基質增生及腎小球結節性硬化的發生,成為糖尿病腎病發病的基礎[5]。

SGLT2抑制劑是一類新型降糖藥物,它通過抑制 SGLT2的轉運作用從而使腎臟對葡萄糖重吸收減少,促進尿糖、尿鈉的排出,為降低糖尿病腎病早期高濾過提供了基礎[6]。SGLT2抑制劑不刺激胰島素分泌,低血糖的發生風險極低,許多研究均證實了該藥物的有效性及安全性[7]。研究顯示SGLT2抑制劑除了能有效降低血糖及HbA1c外,對心血管疾病的其他危險因素包括體重、血壓、血脂、血尿酸、高胰島素血癥、動脈硬化及氧化應激均有保護性調節作用,同時可使尿蛋白水平下降[8],以上均提示 SGLT2抑制劑對DKD具有直接或者間接的腎臟保護作用。本實驗建立了對照組、糖尿病腎病組、卡格列凈干預組3種大鼠模型,分別給予蒸餾水及卡格列凈藥物干預,觀察大鼠血糖變化、尿蛋白變化情況,同時評價SGLT2抑制劑對糖尿病腎病的保護作用機制及對TGF-B1及其下游因子CTGF表達的影響。

本研究結果顯示,卡格列凈干預組在給藥第18天后血糖水平明顯低于糖尿病腎病組(P<0.05),提示卡格列凈具有較好的降糖作用。糖尿病腎病組、卡格列凈干預組尿液中的蛋白含量均明顯高于對照組(P<0.05),卡格列凈干預組在處死前的尿蛋白定量水平明顯低于糖尿病腎病組(P<0.05),提示卡格列凈可降低大鼠的尿蛋白水平,起到一定程度的腎臟保護作用。

除此之外,本研究結果顯示糖尿病腎病組、卡格列凈干預組的TGF-β1及CTGF的基因表達水平、大鼠腎臟組織中的TGF-β1及CTGF蛋白表達水平均明顯高于對照組(P<0.05),卡格列凈干預組的TGF-β1及CTGF的基因表達水平、大鼠腎臟組織中的TGF-β1及CTGF蛋白表達水平明顯低于糖尿病腎病組(P<0.05)。卡格列凈藥物干預治療后TGF-β1和CTGF水平較糖尿病腎病組明顯下降,提示SGLT2抑制劑可能通過抑制TGF-β1及其下游的CTGF途徑發揮抗纖維化作用,進一步保護腎臟功能。相關研究表明,轉化生長因子-β(TGF-β1)是一種多肽類調控蛋白,它調節細胞的增殖和分化主要是通過受體信號通路的傳遞,從而增加其細胞外基質的含量,加重腎小球硬化的進展[9]。TGF-β1可刺激腎臟細胞增殖與分化,并刺激腎臟多種細胞外基質成分的合成,同時也參與抑制細胞外基質的降解過程中[10]。在糖尿病腎病的發生發展過程中CTGF也是一種新的促進纖維化生長因子,廣泛存在于腎臟組織中,它通過增加細胞外基質導致基質沉積、調解細胞外基質的代謝周期、促進上皮細胞轉型等多種機制促進腎臟發生纖維化[11],它的表達在一定程度上受到TGF-β1的作用調解,CTGF也在糖尿病腎病的組織中表達量增加,參與致腎臟纖維化的作用中[12]。本研究結果顯示SGLT2抑制劑通過降低TGF-β1及其下游因子CTGF的表達水平,減輕腎臟纖維化,進一步達到腎臟保護作用。

綜上所述,SGLT2抑制劑通過降低TGF-β1及其下游因子CTGF的表達水平,發揮糖尿病腎病保護作用。本研究結果為糖尿病腎病的防治提供了新的靶點藥物,為SGLT2抑制劑的腎臟保護作用提供了更多理論依據。