蘋果甘油二酯激酶基因MpDGK7過表達對擬南芥植株抗旱性的影響

譚延肖 韓梅梅 張 超 常培培 徐文勝

（德州市農業科學研究院，山東 德州 253015）

在自然界中，干旱、高鹽、極端溫度以及病蟲害等生物和非生物脅迫常常會對植物的生長發育造成嚴重的不良影響［1］。為了在各種不利的生存環境下維持生命并進行持續的生長發育，植物進化出一系列復雜的調控機制以應對外部環境刺激并保護自身免受脅迫傷害，其中包括磷脂酸（phosphatidic acid，PA）信號調控網絡［1-2］。

PA 是植物中一種重要的信號分子［2］，可以被各種生物及非生物逆境脅迫觸發，包括干旱［1］、病原菌侵染［3］、脫落酸［4］、高鹽［5］、冷害［6］和物理傷害［7］等。PA的合成有利于提高植物對不利環境的適應性。在植物細胞中，PA 可以通過兩種不同的代謝途徑產生：1）通過磷脂酶D（phospholipase D，PLD）的不同亞型作為結構磷脂的水解產物；2）通過磷脂酶C（phospholipase C，PLC）和甘油二酯激酶（diacylglycerol kinase，DGK）的聯合活性［8］。其中，DGK 可以通過磷酸化甘油二酯（diglycerylester， DAG）催化合成PA。

DGK 在高等植物中以不同亞型存在，其活性已在不同物種中得到證實，包括擬南芥（Arabidopsisthaliana）［9］、水 稻（Oryza sativa）［10］、番 茄（Solanum lycopersicum）［11］、玉 米（Zea mays）［12］、小 麥（Triticum aestivum）［13］等。植物DGK 具有保守的催化結構域和激酶活性所必需的ATP 結合位點（GXGXXG/A），同時DGK 的活性受到嚴格調節，以協調DAG 和PA 的水平，使細胞能夠正常執行其生理功能［14］。大量研究表明，DGK 在植物生長、發育以及響應生物和非生物脅迫過程中起著至關重要的作用。在擬南芥中，除莖外，AtDGK2基因表達在整個植株中均有發現，并且受低溫（4 ℃）脅迫誘導，表明AtDGK2可能參與了冷信號轉導［14］；而AtDGK7基因轉錄本主要存在于莖、葉和花中，其活性受pH 值、去污劑和R59022 抑制劑的影響［9］。另外，在水稻中發現的OsBIDK1基因轉化煙草增強了轉基因植物的抗病性［15］，而通過抑制DGK的活性則大大降低了植物的生長和根系的伸長［16］。但目前仍鮮見DGK家族基因在木本植物中的功能研究。

本研究前期通過對蘋果DGK 家族成員進行全基因組鑒定和分析，從蘋果屬楸子（Malus prunifolia）中成功克隆到出4 個DGK基因（GenBank 登錄號分別為KM099880，KM099881，KM099882 和KM099883），其中MpDGK7（KM099883）基因表達受高鹽、干旱以及外源脫落酸（abscisic acid， ABA）處理調控［1］。本研究通過農桿菌介導法將MpDGK7基因在擬南芥Columbia中進行過量表達，鑒定過表達株系材料的抗旱性，探索MpDGK7基因在干旱脅迫響應過程中的功能，以期為進一步揭示該基因的生物學功能奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

本試驗用擬南芥為Columbia 生態型，克隆載體pMD18T-simple 購于日本TaKaRa，植物表達載體pBI121 為德州市農業科學研究院實驗室保存。大腸桿 菌（Escherichia coli）Top10 感受態細胞、農桿菌（Agrobacterium tumefaciens）EHA105 購于北京天根生化科技有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1MpDGK7過表達擬南芥植株的獲得 采用Weigel 等［17］的方法對擬南芥種子進行消毒，然后置于1/2 MS 固體培養基中，4 ℃暗箱條件下孵育3 d。轉移到人工氣候箱發芽7～10 d 后，成苗移栽到土壤中。人工氣候箱培養條件：溫度22 ℃，空氣相對濕度70%，光強度100 μmol·m-2·s-1，光周期16 h光/8 h暗。

首先將MpDGK7編碼區克隆到pBI121 載體CaMV 35S啟動子下游［15］，所用引物見表1。然后將重組將質粒轉化農桿菌EHA105 菌株感受態細胞，用花浸漬法轉化擬南芥［18］。最后將收獲的轉化T1 代種子進行表面消毒后，播種在含有50 mg·L-1卡那霉素的MS 篩選培養基上，篩選至T3代。

擬南芥DNA提取方法參考植物DNA提取試劑盒說明書（北京天根生化科技有限公司）進行，分別以野生型和轉基因T3代擬南芥葉片DNA為模板，進行目的基因PCR 檢測。對PCR 檢測呈陽性的轉化株系，采用改良CTAB法［19］提取葉片RNA，并利用半定量RT-PCR（semiquantitative real-time PCR）和實時熒光定量PCR（quantitative real-time PCR， qRT-PCR）［1］（所用引物見表1）檢測MpDGK7在轉基因株系中的表達水平。

1.2.2MpDGK7過表達擬南芥植株抗旱性鑒定 采用土壤控水的方式對生長3 周的擬南芥野生型和轉基因株系進行逐漸干旱處理7 d［1］，對照為正常供水。處理3 d時，采樣觀察葉片氣孔特性。處理7 d時，測定對照和處理植株的葉片鮮重、相對電導率及葉綠素含量，采樣液氮速凍，-80 ℃條件下保存。

1.2.3 葉片相對電導率及葉綠素含量測定 參考Dionisio-Sese 等［20］的方法，使用DSS-307 電導率儀（上海虹益儀器儀表有限公司）測定葉片相對電導率。蒸餾水空白電導率為C0；將10 個葉圓片投入10 mL 蒸餾水中，30 ℃水浴2 h 時，測定值記錄為初始電導率C1；沸水條件下10 min，冷卻，測定最終電導率C2。葉片相對電導率（electrical conductivity，EC）計算公式如下：

取1 g 葉片，加入10 mL 80%丙酮浸提24 h，使用UV-2550 分光光度計（日本島津）測定663、645 和470 nm 波長下的吸光值，計算葉綠素含量，計算方法參考文獻［21］。

1.2.4 葉片氣孔特征觀察 在JSM-6360LV 掃描電鏡（日本JEOL）下觀測葉片氣孔特征。樣品制備參考馬小衛［22］的方法。使用Image J 1.8.0 軟件統計氣孔密度和氣孔開張度。

1.2.5 過氧化氫（H2O2）和丙二醛（MDA）含量測定H2O2提取和測定方法參考文獻［23］。使用UV-2550分光光度計在410 nm波長下測量吸光值，根據標準曲線計算H2O2的濃度，計算方法參考文獻［23］。

MDA含量測定：取1 g葉片，加入2 mL預冷的0.1%（w/v）三氯醋酸（trichloroacetic acid， TCA）溶液充分研磨，4 ℃下12 000×g離心20 min；取1 mL 上清，加入1 mL 0.65%硫代巴比妥酸（thiobarbituric acid，TBA），沸水浴30 min，移至冰中終止反應，4 ℃條件下5 000×g離心10 min。用UV-2550分光光度計測定532和600 nm波長下的吸光值，計算MDA 含量，計算方法參考文獻［24］。

1.2.6 抗氧化系統相關酶活性測定 取1 g葉片，加入2 mL 50 mmol·L-1磷酸二氫鉀緩沖液（pH 值7.8，含1 mmol·L-1EDTA-Na2和11% Triton X-100）和2%（w/v）聚乙烯吡咯烷酮研磨至勻漿。4 ℃下12 000×g離心20 min，取上清測定過氧化氫酶（catalase，CAT）、過氧化物酶（peroxidase，POD）和抗壞血酸過氧化物酶（ascorbate peroxidase，APX）活性，測定方法參考文獻［25］。

1.3 數據分析

試驗處理重復3 次，數據統計進行3 次生物學重復。采用Excel 2010 和SPSS 13.0 軟件進行數據處理，使用Sigma Plot 軟件作圖，并應用獨立樣本的t檢驗對變量進行顯著性差異分析。

2 結果與分析

2.1 MpDGK7 轉基因擬南芥植株的獲得及分子水平檢測

為研究MpDGK7的生物學功能，將MpDGK7基因的開放閱讀框（open reading frame， ORF）插入CaMV 35S啟動子下游，利用農桿菌介導法轉化擬南芥Columbia野生型。經目的基因PCR 鑒定，共獲得6 個轉基因株系（圖1-A），隨后利用半定量RT-PCR 和qRT-PCR 檢測MpDGK7基因表達量，發現MpDGK7基因在所有轉化株系中均有表達，選取其中表達量較高的兩個株系（#3和#4）用于后續試驗（圖1-B、C）。

圖1 MpDGK7轉基因擬南芥分子檢測Fig.1 Molecular characterizations of MpDGK7 transgenic Arabidopsis plants

2.2 MpDGK7轉基因擬南芥抗旱性鑒定

前期研究發現，干旱脅迫可以誘導MpDGK7基因上調表達［1］。為進一步明確MpDGK7基因在干旱脅迫響應過程中的生物學功能，本試驗對野生型和轉基因擬南芥株系進行了自然干旱處理。從圖2-A 可以看出，干旱處理前野生型和轉基因株系均生長良好且沒有明顯差異，經過7 d 控水處理后，轉基因株系明顯比野生型長勢更強。在處理7 d 時，與野生型相比，轉基因株系保持了較高的葉片鮮重（圖2-B）、較低的葉片相對電導率（圖2-C）和較高的葉綠素含量（圖2-D）。由此可以看出，MpDGK7基因過量表達有利于提高擬南芥植株的抗旱性。

圖2 MpDGK7轉基因擬南芥抗旱性鑒定Fig.2 Drought tolerance test of MpDGK7 transgenic Arabidopsis

2.3 干旱脅迫下MpDGK7 轉基因擬南芥葉片氣孔特性的變化

干旱條件下，氣孔運動是影響植物葉片水分散失的重要因素。因此，在自然干旱3 d 后，對轉基因株系和野生型葉片氣孔特性進行觀察，如圖3-A 所示。正常供水和干旱處理后，轉基因株系與野生型葉片氣孔密度均無顯著差異（圖3-B），而在干旱脅迫下轉基因株系氣孔張開度更低（圖3-C）。這些結果表明，MpDGK7基因過量表達能夠促進干旱下擬南芥葉片氣孔的迅速關閉。

圖3 干旱脅迫下MpDGK7轉基因擬南芥的氣孔特征Fig.3 Stomatal characteristic of MpDGK7 transgenic Arabidopsis under drought stress

2.4 干旱脅迫下MpDGK7轉基因擬南芥葉片H2O2水平和MDA含量的變化

H2O2的產生是植物遭受不利環境的特征和受到傷害的癥狀指標［26］。本研究中，正常供水下，葉片生長狀態良好，轉基因株系和野生型植株體內H2O2的積累量都保持在較低的水平，而干旱脅迫導致H2O2大量積累，但轉基因植株積累的H2O2含量顯著低于野生型植株（P＜0.001）（圖4-A）。

圖4 干旱脅迫下MpDGK7轉基因擬南芥H2O2和MDA含量Fig.4 H2O2 content and MDA accumulation of MpDGK7 transgenic Arabidopsis under drought stress

同時，植物體積累的活性氧（reactive oxygen， ROS）可以直接與氨基酸、蛋白質和核酸發生反應，導致脂質過氧化產物MDA 含量增加。本試驗中，干旱脅迫下轉基因株系和野生型葉片中MDA 含量均有所升高，但轉基因株系中MDA 的積累量顯著低于野生型植株（圖4-B）。這表明MpDGK7過量表達可以緩解干旱脅迫誘導的膜脂過氧化損傷。

2.5 干旱脅迫下MpDGK7 轉基因擬南芥葉片抗氧化系統酶活性的變化

CAT、POD 和APX 可以促進H2O2的降解［26-28］，在ROS清除過程中發揮重要作用。通過對轉基因株系和野生型葉片中幾種關鍵抗氧化酶活性進行檢測，發現在干旱脅迫下，CAT、POD和APX的活性都出現了明顯變化，然而在轉基因植株體內這些抗氧化酶的活性顯著高于野生型（P＜0.01 或P＜0.001）（圖5-A～C）。表明MpDGK7可能通過影響抗氧化酶活性調控植株體內H2O2的平衡進而影響對干旱脅迫的抗性。

圖5 干旱脅迫下MpDGK7轉基因擬南芥的抗氧化酶活性Fig.5 Antioxidant enzyme activities of MpDGK7 transgenic Arabidopsis under drought stress

3 討論

真核細胞中，由PLD 或PLC/DGK 偶聯途徑合成PA是重要的信號轉導過程［8］。在植物中，DGK、DAG和PA 參與植株的生長、發育和對環境脅迫的響應過程［16，29-30］。本試驗對蘋果MpDGK7基因在干旱脅迫下的生物學功能進行了相關研究，結果表明，當遭受干旱脅迫時，MpDGK7基因的過量表達提高了擬南芥植株的抗旱性，使轉基因植株的細胞活力得以更好地維持，包括電導率、葉綠素濃度和脂質過氧化水平（即MDA含量）。

氣孔的開放和關閉受外部環境變化和內部調節因子的調控，進而維持細胞水平衡和完成復雜的信號轉導過程［31-32］。通過調節氣孔，植物可以對干旱、低溫和鹽堿化等環境脅迫做出快速響應，以減少水分流失，維持正常生長發育［33］。本研究發現，MpDGK7轉基因株系和野生型植物在氣孔密度上無顯著差異，而在干旱處理下轉基因植物的氣孔關閉比野生型植物更敏感。這說明MpDGK7可能會影響環境刺激誘導的葉片氣孔關閉過程，從而最大程度地減少干旱環境下通過蒸騰作用造成的水分散失，進而調控植株的抗旱性。

不利的生存環境也會導致植物體ROS 的產生，ROS 與蛋白質、氨基酸、核酸等直接反應，發生脂質過氧化，最終導致細胞損傷甚至死亡［26］。ROS 積累通常是干旱脅迫造成植株細胞損傷的一個主要原因。本研究結果表明，干旱脅迫下轉基因植物葉片中H2O2積累明顯低于野生型。與野生型植株相比，CAT、POD 和APX 作為主要的H2O2清除酶，在轉基因株系中始終保持較高活性。因此，MpDGK7可能在調節H2O2穩態和抗氧化酶活性中發揮重要作用，從而有效減輕逆境脅迫誘導的氧化損傷，提高植物對不利環境的適應性。

綜上，某些DGK基因在調控植物應對不利環境的響應中發揮關鍵作用，但DGKs應答逆境脅迫的分子調控機制仍不明晰，在進一步研究中需要明確其調控的靶蛋白，以及逆境環境下如何影響PA合成及其信號轉導過程。

4 結論

本研究結果表明，MpDGK7在植物體對干旱脅迫的響應過程中發揮積極作用，能夠通過影響氣孔運動，調節H2O2穩態，從而增強植株對不利環境的適應性。