脂多糖對綿羊輸卵管上皮Claudin-1和Occludin表達的影響

曾建林 呂建樹 段宏偉 楊 帥 張 榕 張 勇 胡俊杰

（甘肅農業大學動物醫學院/甘肅省動物生殖生理及繁殖調控重點實驗室，甘肅 蘭州 730070）

輸卵管是女性生殖系統的一部分，是連接卵巢和子宮的管道，為精卵結合提供適宜的環境，是輸送卵母細胞以及合子初步發育的重要場所。輸卵管內環境紊亂可能影響輸卵管功能，導致雌性動物生產性能下降［1］。輸卵管上皮細胞之間通過緊密連接（tight junction，TJ）蛋白相連。緊密連接蛋白廣泛存在于輸卵管上皮，參與上皮細胞間的緊密連接及細胞粘附，調節細胞間物質轉運、防止細菌、內毒素等侵染，構成了一種上皮特有的初級防御屏障［2］。封閉蛋白-1（Claudin-1）和閉合蛋白（Occludin）是緊密連接蛋白家族中兩個重要的跨膜蛋白，參與調節細胞旁通透性、介導離子選擇性擴散及細胞遷移［3-4］。輸卵管上皮緊密連接蛋白構成的上皮屏障是維持輸卵管正常生理功能和管內環境穩態不可或缺的。

脂多糖（lipopolysaccharides，LPS）是革蘭氏陰性菌釋放的內毒素。當機體受脂多糖刺激會產生一系列免疫防御機制，誘機體發炎癥反應［5-6］。反芻動物異常代謝和炎癥性疾病是外周循環LPS的主要來源。研究表明，亞急性瘤胃酸中毒期間產生的大量LPS會造成瘤胃上皮炎癥反應，破壞上皮屏障，導致LPS易位至外周循環，誘發乳腺、子宮等部位炎癥反應［6-8］。如患有子宮內膜炎的奶牛血清中的LPS濃度上升，卵泡液中的LPS濃度比正常時期高出2 900倍［9-11］；腸道菌群紊亂造成腸道炎癥和腸上皮損傷，導致LPS或病原菌通過血液從腸道遷移到子宮造成子宮炎［11-12］；家兔耳緣靜脈注射LPS可誘發輸卵管炎癥反應［13］。上述研究均表明，外周循環中的LPS是造成輸卵管炎癥反應的潛在誘因，但在反芻動物飼養管理過程中，亞急性瘤胃酸中毒等疾病造成的大量LPS 易位易被忽視，從而可能增加誘發輸卵管炎癥的風險。

然而，Claudin-1、Occludin 在綿羊輸卵管中的表達特性，以及LPS是否會通過影響Claudin-1、Occludin 的表達，進而造成輸卵管上皮細胞間信號傳導及屏障功能障礙，最終造成綿羊生殖性能下降，均鮮見文獻報道。因此，本研究首先明確Claudin-1、Occludin在綿羊輸卵管中的表達特性，其次通過LPS 誘導的綿羊輸卵管炎癥模型闡明LPS 對輸卵管上皮Claudin-1、Occludin 表達的影響，試圖闡明LPS 對綿羊輸卵管屏障損傷的機制，以期為反芻動物飼養管里的科學發展及提高綿羊生殖機能的相關研究提供基礎資料。

1 材料與方法

1.1 試驗材料與試劑

蘇木精（D10393，Bioss，北京）、伊紅（S0159，Bioss，北京）、TRIzol 裂解液（R1100，Solarbio，北京）、RIPA裂 解 液（radio immunoprecipitation assay lysis buffer）（R0010，Solarbio，北京）、胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）（Hycione，美國）、DMEM/F12細胞培養基（Hycione，美國）、反轉錄試劑盒（Promega，北京）、脂多糖（Cat.No.L2880，Sigma，美國）、角蛋白18（18708-1-AP，Proteintech Group，武漢）、Claudin-1（28674-1-AP，Proteintech Group，武漢）、Occludin（66378-1-Ig，Proteintech Group，武漢）、β-actin（bs-0061R，Bioss，北京）、熒光二抗（ab150077、ab150115）（Abcam，美國）、免疫印跡二抗（bs-0295GHRP、bs-40296G-HRP，Bioss，北京）、反轉錄試劑盒（TaKaRa Bio， 大連）。

1.2 樣品采集

于甘肅省蘭州市當地屠宰場采集健康成年綿羊的輸卵管組織。部分置于37 ℃、含青鏈霉素的磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer saline，PBS）中，迅速運回實驗室用于細胞培養（n=10）；部分用4%多聚甲醛固定輸卵管組織（n=5）用于石蠟包埋；其余樣品（n=10）在液氮中保存備用。

1.3 綿羊輸卵管組織的蘇木精-伊紅染色

將4%多聚甲醛固定的輸卵管組織，按照傘部、壺腹部、峽部分割，石蠟包埋后制作成5 μm石蠟切片，在60 ℃條件下烘片2 h，二甲苯、梯度酒精脫蠟，蘇木精染色2 min，流水沖洗，后利用1%（v/v）的鹽酸酒精分化液分化3 s后取出，伊紅染色1 min。梯度酒精浸泡脫水，后通過二甲苯浸泡透明，封片。使用Olympus-dp73 光學顯微鏡（Olympus，日本）觀察拍照。

1.4 組織免疫熒光

將4%多聚甲醛固定的輸卵管組織，按照傘部、壺腹部、峽部分割，石蠟包埋，制作成5 μm 石蠟切片，60 ℃烘片2 h，二甲苯、梯度酒精脫蠟，0.01 mol·L-1的檸檬酸鈉溶液98 ℃抗原修復15 min，自然冷卻至室溫，PBS洗滌，3% H2O2室溫孵育15 min，PBS洗滌，5%的山羊血清37 ℃封閉30 min，4 ℃一抗孵育過夜（1∶250）。PBS 洗滌，熒光二抗37 ℃避光孵育1 h，PBS 洗滌，1 μg·mL-1的4′，6-二脒基-2-苯基吲哚（diamidino-2-phenylindole，DAPI）染核后，使用Revolve Omega 熒光顯微鏡（Apex Bio， 美國）拍照。

1.5 蛋白免疫印跡（western blot, WB）

將輸卵管組織按照傘部、壺腹部、峽部混合（n=10），液氮研磨并各自稱取相同重量樣本。分別在組織及細胞樣本中加入等量RIPA 裂解液及苯甲磺酰氟（phenylmethanesulfonyl fluoride， PMSF）進行充分裂解。4 ℃、12 000 r·min-1條件下離心15 min 提取上清液，加入4×蛋白上樣緩沖液混勻后，在98 ℃、15 min條件下處理獲得變性蛋白。十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE），目的蛋白轉移至聚偏二氟乙烯膜（polyvinylidene fluoride，PVDE），Tris-HCl緩沖鹽溶液+Tween（Tris buffered saline with Tween， TBST）洗滌，5%脫脂奶粉室溫孵育30 min，一抗4 ℃孵育過夜（1：500），β-actin（1：3 000）作為內參。TBST 洗滌，二抗37 ℃孵育1 h（1：3 000），TBST 洗滌。通過增強化學發光溶液檢測免疫復合物，并用Image-J 軟件分析目的蛋白灰度值，參照β-actin 計算灰度值，即為目的蛋白相對表達量。

1.6 原代輸卵管上皮細胞培養

用37 ℃含有青鏈霉素的PBS 和75%酒精依次清洗輸卵管，重復3 次，將輸卵管壺腹部兩端用無菌棉線結扎，管腔內注入0.2% IV 型膠原酶37 ℃孵育10 min，收集管腔內容物并用培養液沖洗，1 200 r·min-1離心5 min 后棄去上清。在含有100 IU·mL-1青霉素、100 IU·mL-1鏈霉素及10%胎牛血清的DMEM/F12 完全培養基中重懸，轉移至細胞培養瓶置于37 ℃、95% O2和5% CO2培養箱中培養。每2 d 換一次培養基，細胞密度達到70%～80%時用0.25%胰蛋白酶-乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid， EDTA）重懸，1 200 r·min-1離心棄去上清，重懸轉移至每孔含2 mL完全培養基的6 孔板中進行培養。處理前DMEM/F12 原培處理12 h，換液后以終濃度為0、10、50和100 ng·mL-1的LPS 處理12 h，棄上清，用4 ℃預冷的PBS 洗滌3 遍后，在-80 ℃條件下保存備用。

1.7 細胞免疫熒光

6 孔板中細胞密度至70%～80%時棄去培養液，在預冷至4 ℃的PBS 中洗滌，4%多聚甲醛固定30 min，PBS洗滌，后用0.1%的曲拉通室溫處理15 min，PBS洗滌，5%山羊血清37 ℃孵育30 min，一抗孵育過夜（1∶250）。PBS 洗滌，熒光二抗37 ℃避光孵育1 h，PBS 洗滌，1 μg·mL-1的DAPI 染核后用Revolve Omega 熒光顯微鏡拍照。

1.8 實時熒光定量PCR（quantitative real-time PCR,qRT-PCR）

TRIzol處理細胞樣品，提取總RNA，微量核算測定儀（Pultton，美國）測定OD260/OD280值在1.8～2.0之間，調整濃度后使用反轉錄試劑盒步驟進行cDNA鏈的合成，引物參考NCBI（www.ncbi.nlm.nih.gov）上已經公布的綿羊TLR4、NFκB、TNF-α和β-actin基因序列（表1）。反轉錄后使用LightCycler 480 Real-time Detection System（Roche， 瑞士）檢測目的基因相對表達量，反應體系20 μL：cDNA 1 μL、正反向引物各0.4 μL、2×TransStart Tip Green qPCR SuperMix 10 μL、ddH2O 8.2 μL。將樣品充分混勻，每個樣品重復3 次，反應程序：95 ℃預變性300 s；95 ℃變性5 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸20 s，45 個循環。采用2-ΔΔct法計算相對表達量。

表1 引物序列Table 1 Primer sequences

1.9 數據分析

使用SPSS 21.0（IBM）進行統計分析。對所有數據進行正態性和同方差檢驗、單因素方差分析和鄧肯多重檢驗。P＜0.05水平表示數據差異顯著。

2 結果與分析

2.1 綿羊輸卵管峽部、壺腹部、傘部的結構及免疫熒光檢測

利用蘇木精-伊紅染色法對綿羊輸卵管組織切片進行染色觀察。峽部和壺腹部從內而外由粘膜層、肌層及外膜組成，黏膜層包含上皮層和固有層并向內突出褶皺，黏膜上皮緊貼管壁基底部呈單層柱狀纖維上皮、頂部為假復層柱狀纖毛上皮。傘部為膜結構由外側假復層柱狀纖毛上皮和內側疏松的結締組織構成，箭頭標記為上皮細胞（圖1）。免疫熒光檢測Claudin-1、Occludin發現兩種蛋白主要存在于黏膜上皮的柱狀上皮中（圖2、3）。

圖1 綿羊輸卵管峽部、壺腹部、傘部的HE染色（100×）Fig.1 HE staining （100×） photoes of sheep oviduct isthmic portion， ampulla and fimbriae

圖3 綿羊輸卵管峽部、壺腹部、傘部的Occludin免疫熒光染色分析（×100）Fig.3 immunofluorescence staining analysis of Occludin in the isthmic portion， ampulla and fimbriae of sheep oviduct （100×）

2.2 Claudin-1、Occludin 在峽部、壺腹部、傘部的表達差異

通過WB 檢測綿羊輸卵管峽部、壺腹部、傘部中Claudin-1、Occludin 的相對表達。結果顯示，Claudin-1、Occludin 在傘部的表達顯著高于峽部和壺腹部（P＜0.05）（圖4）。

圖4 Claudin-1、Occludin在峽部、壺腹部、傘部的表達差異Fig.4 Claudin-1 and Occludin in isthmic portion， ampulla and fimbriae expressi on differences

2.3 體外培養原代輸卵管上皮細胞的鑒定

如圖5 所示，通過免疫熒光染色檢測細胞角蛋白18（cytokeratin18，CK18），在細胞質中可見綠色熒光激發。

圖5 體外培養綿羊輸卵管壺腹部上皮細胞角蛋白18的免疫熒光染色（200×）Fig.5 Immunofluorescence staining of cytokeratin18 in sheep ampulla epithelial cells cultured in vitro （200×）

2.4 脂多糖誘導輸卵管上皮炎癥模型的鑒定

利用終濃度為0、10、50和100 ng·mL-1的LPS分別處理原代輸卵管上皮細胞，qRT-PCR 檢測TLR4、NFκB及TNFα的mRNA表達，結果如圖6所示。與0 ng·mL-1處理組相比，10、50 和100 ng·mL-1的LPS 均可顯著促進TLR4、NFκB及TNFα的mRNA表達水平（P＜0.05）。

圖6 LPS誘導輸卵管上皮細胞TLR4、NFκB及TNFα 的mRNA相對表達水平Fig.6 Relative mRNA expression levels of LPS induced epithelial cells TLR4， NFκB and TNFα

2.5 脂多糖對輸卵管上皮Claudin-1、Occludin 表達的影響

WB 檢測LPS 處理原代細胞Claudin-1、Occludin的相對蛋白表達水平，結果如圖7 所示。10、50 和100 ng·mL-1濃度的LPS 不同程度地促進了Claudin-1表達，但抑制了Occludin 表達，并與0 ng·mL-1處理組表達量均差異顯著（P＜0.05）。

圖7 LPS誘導輸卵管上皮細胞Claudin-1、Occludin的蛋白相對表達水平Fig.7 Relative protein expression levels of LPS induced epithelial cells Claudin-1、Occludin

3 討論

輸卵管傘部為漏斗狀，呈不規則褶皺，由外側假復層柱狀纖毛上皮和內側疏松的結締組織構成（圖1），主要功能是將卵巢排出的卵子運輸至輸卵管內；壺腹部是輸卵管中長度最長、管腔最粗的一段（圖1），壺腹部上皮具有分泌功能維持輸卵管內微環境穩態。輸卵管峽部是連接壺腹部與子宮的一段較短直、且細的部位，主要發揮運輸功能［14-16］。構成輸卵管上皮TJ 的關鍵蛋白Claudin-1、Occludin表達于峽部、壺腹部及傘部上皮（圖2、3），且Claudin-1、Occludin 在傘部的蛋白表達水平顯著高于壺腹部及峽部（圖4）。由此推測，Claudin-1、Occludin 在輸卵管維持上皮屏障完整性及維持內環境穩態中發揮著重要的作用。

TLR4可識別LPS刺激激活TLR4-NFκB炎癥通路，導致機體炎癥反應發生［5-6］。前人用LPS處理大鼠腸黏膜微血管內皮細胞，發現不同處理時間的TLR4的mRNA 表達均上升，無時間依賴性；而不同濃度LPS 處理9 h后，TLR4表達呈劑量依賴性升高［17］。奶牛乳腺上皮細胞的相關研究發現，不同濃度LPS處理不同時間后NFκB的表達水平均升高，但是未出現時間和濃度依賴性［18］。本研究通過不同濃度LPS處理輸卵管上皮細胞12 h，發現LPS可刺激輸卵管上皮TLR4、NFκB、TNFα的mRNA 表達水平上升，無劑量依賴性，這可能與LPS 處理的濃度、時間以及細胞種類有關（圖6）。結合上述前人研究結果表明，LPS 可刺激綿羊輸卵管上皮激活TLR4-NFκB炎癥通路，從而發生炎癥反應。TNFα是一種多效應炎癥因子，參與炎癥反應，抑制精子及卵子在輸卵管中的進一步發育、阻礙精卵結合、誘發輸卵管黏連和阻塞、阻礙胰島素信號傳導造成多囊卵巢綜合征，誘發其他盆腔器官炎癥反應［19-20］。結合本研究結果表明，低濃度LPS 刺激輸卵管上皮細胞短時間內就可引發輸卵管上皮細胞的炎性反應，造成輸卵管損傷。

前人在LPS誘導的犬子宮內膜炎中發現子宮內膜中的Occludin 蛋白表達水平［21］，大腸桿菌處理的小鼠子宮內膜Occludin 蛋白和mRNA 的表達水平均顯著降低［22］。TNFα 可過度活化子宮內膜上皮中性粒細胞造成其損傷［23］，TNFα 可誘導Alport 小鼠及馬的腎小管TJs中Claudin-1表達升高［24-25］。本研究結果顯示，LPS刺激輸卵管上皮細胞的炎癥反應導致上皮細胞Claudin-1 蛋白表達水平上升，Occludin 蛋白表達降低（圖7）。表明LPS可通過影響Claudin-1、Occludin的表達破壞輸卵管上皮屏障。子宮頸鱗狀上皮和喉鱗癌病程發展過程中Claudin-1 表達都呈現出較高的水平［26-27］，Claudin-1 缺失會導致皮膚等多個部位上皮細胞收緊［28-29］。Occludin 參與調節跨上皮中性粒細胞遷移，Occludin 缺失導致組織上皮分化缺陷［30-31］，其表達水平與細胞旁通透性成反比［32］。表明Claudin-1、Occludin 表達的改變和上皮細胞增殖、旁通透性、細胞間信號傳導、物質運輸及胞間連接等密切相關。推測LPS 刺激輸卵管炎癥反應造成上皮緊密連接蛋白表達紊亂，可能造成輸卵管上皮細胞增殖、上皮通透性增大及信號轉導紊亂導致輸卵管堵塞、充血、黏連等，影響輸卵管生理功能，從而影響綿羊經濟價值。

4 結論

本研究結果表明，Claudin-1、Occludin 表達于綿羊輸卵管上皮并參與維持輸卵管上皮微環境穩態。低濃度的LPS 在短時間內便可誘發輸卵管上皮炎癥反應，造成輸卵管上皮Claudin-1、Occludin表達紊亂，破壞輸卵管上皮緊密連接，造成輸卵管上皮損傷，進而導致輸卵管生理機能下降。