研磨對大豆分離蛋白的物理改性研究

劉 悅,代養勇*,曹 健,侯漢學,王文濤,張 慧,丁秀臻,李 誠

1.山東農業大學 食品科學與工程學院, 山東 泰安 271018 2.山東省糧食加工技術工程技術研究中心, 山東 泰安 271018 3.河南工業大學 生物工程學院, 河南 鄭州 450001

大豆分離蛋白(soybean protein isolate, SPI)作為一種優質廉價的植物蛋白質,可以提供人體生長和修復所需的必需氨基酸。SPI作為多種蛋白的混合體,主要含有2S、7S、11S、15S 4類蛋白質。其中,7S(β-伴大豆球蛋白)和11S(大豆球蛋白)占70%以上,其緊密的球狀結構不利于蛋白溶解性、起泡性和成膜性等功能優勢的發揮,限制了SPI的應用范圍[1]。

目前,食品行業主要通過物理改性[2]、化學改性[3]、酶法改性[4]及其他新方法(主要是基因工程)來改變蛋白結構進而達到改善功能品質的目的。物理改性是在不改變蛋白質氨基酸序列的情況下,通過人為控制條件改變蛋白質分子的高級結構和分子間的聚集狀態來改善它的功能特性[5],具有蛋白質營養損失少、操作過程簡單、改性成本低、耗時短、無毒副作用等優勢[6]。與物理改性相比,化學改性的蛋白含有較多的副產物,產品存在一定的安全隱患;酶法改性成本較高;而其他新方法改性的蛋白在短時間內難以確保食品安全性問題。Bi等[7]通過高剪切均質處理SPI分散體后發現分散體的粒徑顯著減小,蛋白的多分散性能和凝膠性能得到改善。Sharafodin等[8]通過介電阻擋放電(DBD)等離子體技術處理SPI后,發現SPI的乳化性能、溶解性、持水性和發泡性能均得到增強,且在18 kV等離子體處理15 min時效果最好。

干法研磨作為一種安全且環保的高效物理改性技術,通過反復高能的沖擊和摩擦致使材料變性,不僅能夠增強表面性質,而且能夠改善食品的某些加工性能[9-10]。而關于干法研磨對蛋白物理改性方面的研究相對較少。基于此,作者以商品型SPI為原料,利用干法研磨技術對其進行物理改性處理,研究不同研磨時間對SPI結構、起泡性能和成膜性能的影響,以期尋求一種拓寬SPI在食品中的應用范圍的物理改性新方法。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

大豆分離蛋白:山東禹王生態食品有限公司;大豆油:中國益海嘉里金龍魚糧油食品股份有限公司;所用化學試劑均為分析級。

1.2 儀器與設備

ST-Q200型球磨機:北京旭鑫儀器設備有限公司;Lumina型熒光-磷光分光光度計、Nicolet iS5型傅里葉變換紅外光譜儀:美國Thermo Fisher Scientific公司;JC2000C1型接觸角測量儀:上海中辰數字技術有限公司;T18 digital Ultra-T型高速分散均質器:德國IKA公司;HWS-60型恒溫恒濕試驗箱:上海精宏實驗設備有限公司;CR-400型色度計:日本Konica Minolta公司;W3/030型水蒸氣透過率測試儀、XLW(CP)型拉伸測試儀:濟南蘭光機電技術有限公司;Quanta FEG250型掃描電子顯微鏡:美國FEI公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 大豆分離蛋白的改性

將160 g SPI與800 g研磨球放入研磨罐內,設定球磨機轉速為400 r/min,在25 ℃進行不同時間(0、3、6、9、12、15 min)的研磨處理。為防止較長時間的研磨使SPI的溫度升高,每研磨3 min暫停2 h以保證研磨罐冷卻至室溫條件。研磨結束后將蛋白粉末放入自封袋內,4 ℃保存,備用。

1.3.2 三級結構的測定

根據Jiang等[11]使用的測定方法并稍做修改。使用0.01 mol/L pH 7.0的磷酸鹽緩沖溶液配制1 mg/mL蛋白溶液。在25 ℃下,以5 nm的狹縫寬度,295 nm的激發波長,10 nm/s的掃描速度測定300～450 nm處的熒光光譜。

1.3.3 親水性、親油性的測定

將2.00 g蛋白粉末壓成光滑的薄片,分別以去離子水、大豆油做潤濕試驗樣品。采用懸滴法測定液滴與SPI薄片表面的接觸角。

1.3.4 起泡性能的測定

將3%的SPI溶液用高速分散均質器在10 000 r/min下均質3 min后迅速倒入量筒內,并于均質結束0 min、10 min時測定量筒內泡沫的體積。起泡能力(foaming capacity, FC)和泡沫穩定性(foam stability, FS)的計算公式如下。

FC=V0/V×100%,FS=V1/V×100%,

式中:FC為起泡能力,%;FS為泡沫穩定性,%;V0為均質結束0 min時泡沫的體積,mL;V1為均質結束10 min時泡沫的體積,mL;V為均質前溶液的體積,mL。

1.3.5 成膜性能的測定

1.3.5.1 大豆分離蛋白膜的制備

根據Cheng等[12]使用的制備方法并稍做修改。在磁力攪拌2 h的5% SPI懸浮液中加入4 g甘油(40% SPI)制備SPI的成膜液。攪拌脫氣1 h,向培養皿(直徑150 mm)中澆注40 g成膜液。在25 ℃、55%的恒溫恒濕條件下干燥24 h,剝離薄膜并放于自封袋中保存備用。膜性能測定前,需將薄膜放在25 ℃、55%的恒溫恒濕條件下調節72 h。

1.3.5.2 膜的結構性表征

使用帶衰減全反射采樣附件(iD5 ATR)的傅里葉變換紅外光譜儀,以4 cm-1的光譜分辨率在400～4 000 cm-1的范圍內掃描32次。每掃描一個樣品前都需要收集一次背景[13]。

1.3.5.3 膜的顏色參數及透明度

以白色標準板為參照物,通過色度計在薄膜的任意5點進行測定,獲取顏色參數L*(明暗)、a*(紅綠)和b*(藍黃)和總色差(ΔE)[13]。薄膜的透明度則以600 nm處的吸光度與薄膜厚度的比值表示。

1.3.5.4 膜的水分含量、總可溶性物質和水蒸氣滲透性

薄膜的水分含量(moisture content, MC)和總可溶性物質(total soluble matter, TSM)根據Muoz等[14]使用的測定方法進行測定。薄膜的水蒸氣滲透性(water vapor permeability, WVP)根據Zhai等[15]使用的測定方法通過水蒸氣透過率測試儀進行測量。在38 ℃、相對濕度90%條件下,在12 h內,每隔2 h將直徑80 mm的無磨損、無褶皺的圓形薄膜樣品稱重一次。

1.3.5.5 膜的拉伸強度和斷裂伸長率

膜的拉伸強度(tensile strength, TS)和斷裂伸長率(elongation at break, EAB)根據Zhai等[15]使用的測定方法(稍做修改后)通過XLW(CP)拉伸測試儀進行測量。測試過程中,兩個夾具之間的原始標距設置為50 mm,并以100 mm/min的速度拉伸,直至破裂。

1.3.5.6 膜的微觀形貌

用雙面透明膠帶將SPI薄膜固定在支架上,并通過離子濺射儀為其表面鍍一層鉑金膜。通過調節電鏡選取最佳拍攝視野后觀察并拍攝照片。

1.3.6 數據處理及分析

采用Origin 8.0軟件繪制圖表,采用SPSS 22.0軟件進行單因素方差分析(ANOVA,P<0.05),數據由平均值±標準偏差(n=3)表示。

2 結果與分析

2.1 研磨時間對SPI結構的影響

當SPI的分子構象發生改變時,其芳香族氨基酸與周圍基團的相互作用也會發生改變,導致熒光強度和最大發射波長(λm)發生改變[16]。通常,擁有較高熒光強度和較短λm的SPI處于折疊狀態,而擁有較低熒光強度和較長λm的SPI處于部分或者完全未折疊狀態[17]。由圖1可知,研磨處理后,SPI的熒光強度降低,且λm發生了紅移。表明研磨處理改變了SPI的三級結構,使處于折疊狀態的SPI發生了去折疊,同時SPI內部的發色團(主要是疏水發色團色氨酸(Trp)殘基和酪氨酸(Tyr)殘基,其次還有苯丙氨酸(Phe)殘基)更多地轉移至分子外部并暴露于溶劑中[18]。當研磨處理15 min時,熒光強度最低,λm紅移程度最大。然而,研磨6 min的SPI的熒光強度要高于3 min的,且λm發生了藍移。這是因為SPI發生了聚集,導致發色基團被重新掩埋。當蛋白去折疊后,疏水基團暴露程度增大,蛋白質的親油性能得到一定程度的改善,這可能影響SPI的起泡特性、乳化特性、薄膜表面的疏水性能[19]。

圖1 不同研磨時間下的SPI的熒光光譜Fig.1 Fluorescence spectroscopy of SPI with different grinding time

2.2 研磨時間對SPI親水性、親油性的影響

SPI表面潤濕性(親/疏水性)可以通過接觸角來評估,它對蛋白質的應用特性具有重要的參考意義[20]。由圖2可知,隨著研磨時間的延長,SPI的親水性能先增強后減弱。在研磨處理6 min時,SPI的親水性能達到最強(71.55°)。這是因為短時間的研磨處理使蛋白質分子適度舒展,蛋白質內部的部分極性基團暴露,使親水性能增加。但經過長時間(9～15 min)的研磨處理后,蛋白分子的舒展程度過大導致大量的疏水基團暴露,反而使其親水性能降低[21]。由圖3可知,隨著研磨時間的延長,SPI的親油性能較未經處理的有所提升。這是因為研磨處理后,蛋白質緊密的球狀結構被打開,蛋白質內部的疏水基團充分暴露。但是,當研磨6 min時,蛋白質中出現的聚集導致疏水基團被部分掩埋,使SPI的親油性能略有下降。

注:A—F分別為研磨0、3、6、9、12、15 min。圖3、圖6同。圖2 SPI表面的水接觸角光學照片Fig.2 Water contact angle of the surface of SPI with different grinding time

圖3 SPI表面的油接觸角光學照片Fig.3 Oil contact angle of the surface of SPI with different grinding time

2.3 研磨時間對SPI起泡性能的影響

起泡能力和泡沫穩定性是衡量物質是否適用于充氣食品的關鍵評估指標[22]。由圖4可知,研磨處理后,SPI的FC和FS有所提升。當研磨15 min時,SPI的FC增加至156.21%,FS增加至82.33%。這是因為研磨處理后,蛋白質緊密的球狀結構被打開,具有了較為靈活的結構,有利于提升蛋白質的界面吸附能力。但是,當研磨6 min時,蛋白質中出現的聚集阻止了蛋白分子的展開,這并不利于界面蛋白質的吸附,使SPI的FC(131.24%)和FS(62.71%)略有下降。

圖4 不同研磨時間下的SPI的起泡性及泡沫穩定性Fig.4 Foaming capacity and stability of SPI with different grinding time

2.4 研磨時間對SPI成膜性能的影響

2.4.1 薄膜的結構

所有SPI薄膜的紅外光譜都顯示出了與SPI骨架結構相對應的特征譜帶。在3 274 cm-1附近主要與O—H和N—H的拉伸振動(酰胺A峰)有關[23],在1 537 cm-1附近主要與C—N拉伸振動和N—H彎曲振動(酰胺Ⅱ峰)有關。由圖5可知,隨著研磨時間的延長,SPI膜的酰胺A峰和酰胺Ⅱ峰轉移到低波數方向。當研磨15 min時,這兩個峰的位置分別轉移至3 271 cm-1和1 531 cm-1。這說明研磨處理后的SPI在制備薄膜的過程中,會形成更多的氫鍵,有助于制備具有更均勻表面、更好機械性能、更具凝聚力的SPI薄膜[24]。當研磨6 min時,酰胺A峰和酰胺Ⅱ峰略微轉移到高波數方向。這說明蛋白質中出現的聚集會阻止蛋白分子的展開,并不利于薄膜中氫鍵的形成。

圖5 不同研磨時間下的SPI制備的薄膜的FT-IR光譜Fig.5 FT-IR spectroscopy of the films prepared by SPI with different grinding time

2.4.2 薄膜的光學特性

薄膜的顏色參數(L*、a*、b*和ΔE)是影響消費者接受度的重要因素。由表1可知,研磨處理使L*增加,a*和b*減小。說明與未經處理的SPI制備的薄膜相比,研磨處理能夠使薄膜具有更強的白色和減弱的黑色、綠色和黃色。在研磨15 min時,ΔE達到了2.74。Saricaoglu等[23]研究發現高壓均質處理使蛋白粒徑降低,薄膜顏色發生了相同改變。這表明研磨處理可以達到和高壓均質處理相同的效果。

表1 不同研磨時間下的SPI制備的薄膜的光學特性Table 1 Optical properties of films prepared by SPI with different grinding time

透明度數值越高,薄膜越不透明或渾濁[25]。由表1可知,未經研磨處理的SPI膜的透明度為0.88,研磨處理后薄膜的透明度顯著降低。當研磨15 min時透明度下降至0.52。這是因為研磨處理后,SPI能夠更加均勻地分散在成膜液中,膜具有更加均勻、致密的微觀結構。研磨處理6 min時,薄膜的透明度略增。這是因為蛋白質中出現的聚集導致成膜液的均勻性較差,使制備的膜輕微變暗,并使光線難以穿過基質,膜較不透明[26]。

2.4.3 薄膜的物理化學性質

由表2可知,研磨使SPI薄膜的MC顯著降低。當研磨15 min時,MC顯著降低至21.62%。這是因為研磨處理使SPI的結構展開,有助于創造更多的蛋白質空間,使增塑劑(甘油)能夠更多地滲透到蛋白質網絡中,增強了甘油和SPI的羥基和酰胺基之間的氫鍵,從而降低了SPI和水分子之間的相互作用,因而在干燥過程中會損失更多的水分。由表2可知,研磨處理后,SPI薄膜的TSM與未處理的TSM沒有顯著性差異。這與高強度超聲制備豌豆分離蛋白膜中TSM結果相同[26]。出現上述現象的原因可能是在SPI薄膜的制備過程中,表面疏水性的增加對薄膜TSM的影響與溶解度的增加對TSM的影響可能相互抵消,從而導致薄膜的TSM沒有出現顯著性差異。

表2 不同研磨時間下的SPI制備的薄膜的物理化學性質和機械性能Table 2 Physicochemical properties and mechanical properties of films prepared by SPI with different grinding time

同時,研磨處理后,SPI薄膜的WVP顯著下降,這是因為研磨處理后,由于蛋白質結構的改變,內部的疏水基團大量暴露,降低了水分子通過薄膜網絡結構時的吸附和擴散速率[27]。同時因為研磨后的SPI薄膜更均勻致密,孔隙或裂縫更少,所以WVP也會下降。

2.4.4 薄膜的機械性能

薄膜的實用性在很大程度上受到TS和EAB的影響。由表2可知,當研磨15 min時,SPI薄膜的TS和EAB均增大(2.24 MPa、178.70%),這是因為研磨處理后,SPI的結構發生了改變,增加了蛋白質與蛋白質、蛋白質與甘油之間的相互作用,這有助于薄膜三維網絡的形成。在薄膜干燥階段,分子間會形成更多的二硫鍵、疏水鍵和氫鍵,使薄膜的機械性能得到改善[28]。在研磨處理6 min時,SPI薄膜的TS和EAB略微減小,這是因為蛋白質發生的輕微團聚并不利于蛋白質與蛋白質、蛋白質與甘油之間的相互作用。在薄膜干燥階段,形成的二硫鍵、疏水鍵和氫鍵較少,從而影響了薄膜的機械性能。

2.4.5 薄膜的微觀結構

掃描電子顯微鏡可以用來觀察SPI薄膜的微觀結構。由圖6可知,未經研磨處理的薄膜表面較為平坦,但呈現出了較多的非連續裂紋,這會降低薄膜的機械性能(表2)。當研磨處理3～6 min時,薄膜表面較為粗糙,表面出現凸起,但薄膜表面的裂紋變少,結構變得更加致密、均勻。其中,研磨處理6 min時的薄膜表面會有較多的未溶解顆粒沉積,可見,此時蛋白質確實發生了輕微團聚。隨著研磨時間的延長(9～15 min),薄膜表面未見明顯裂紋,結構更加致密、均勻,同時機械性能顯著提高(表2)。可見,研磨處理能夠改善薄膜的微觀結構,使薄膜結構更加致密、均勻。

圖6 不同研磨時間下的SPI制備的薄膜的掃描電鏡圖Fig.6 SEM characterization of the films prepared by SPI with different grinding time

3 結論

通過對SPI進行研磨處理,得到不同處理時間的蛋白樣品,并對蛋白的結構、性質和成膜性能進行研究。結果表明,研磨處理后,SPI緊密的球狀結構發生了去折疊,蛋白內部的疏水基團充分暴露,蛋白質具有了更高的疏水性能。由于蛋白結構的改變,提升了蛋白質的界面吸附能力,SPI的起泡性能得到改善。通過對薄膜相關性能進行測定后發現,研磨處理能夠顯著改善SPI薄膜的成膜性,薄膜表面的裂紋變少,結構變得更加致密、均勻,薄膜的光學性能、物理化學性能和機械性能得到提升。作者制備了一種高起泡和較強成膜性能的大豆分離蛋白,可為今后研究植物蛋白綠色改性技術奠定理論基礎。此外,由于功能性質之間存在關聯性,研磨處理對大豆分離蛋白其他功能性質(乳化特性、凝膠特性等)的影響及其作用機理尚不明確,有待于進一步研究。