環化酶阻斷劑對三孢布拉氏霉菌發酵生產番茄紅素的影響

丁長河,白璐佳,尹 萌

河南工業大學 糧油食品學院, 河南省天然色素制備重點實驗室, 河南 鄭州 450001

番茄紅素是一種脂溶性的四萜碳氫化合物[1],由于其多烯烴的結構而具有良好的抗氧化活性[2]。此外,在清除自由基、抑制癌細胞增殖、誘導癌細胞凋亡、抗炎和預防心血管疾病等方面都表現出良好的功效[3-5]。但它不能在人體內合成,只能通過飲食攝入含有類胡蘿卜素的食物得到補充[6-7],多存在顏色偏紅的水果中,如西瓜、葡萄柚[8]、紅肉臍橙[9]、櫻桃、木鱉果、紅果仔[10]等,但含量較低。當前人們對于番茄紅素的需求量越來越高,因此,需要生產出更多的番茄紅素來滿足實際需要。在工業化生產中,自然提取法和化學合成法都存在一定的缺點,微生物發酵法因不受限制且產量高,所以成為優選[11]。

在利用微生物發酵生產番茄紅素的眾多菌種(如酵母、細菌、藻類、絲狀真菌等)中,三孢布拉氏霉菌(Blakesleatrispora)利用正負菌混合發酵,具有生長迅速、菌體生物量大、色素產量高的特點,是目前唯一實現工業化生產類胡蘿卜素的菌株,而類胡蘿卜素的“原型”就是番茄紅素,番茄紅素可通過環化、氧化或還原等形成其他的類胡蘿卜素[12]。對B.trispora合成番茄紅素代謝過程進行調控,阻斷番茄紅素向β-胡蘿卜素轉化。目前的研究發現多種吡啶和咪唑及其衍生物被用作番茄紅素環化酶阻斷劑[13-14]。在Vereshchagina 等[15]的研究中,向B.trispora發酵過程中添加2-氨基-6-甲基吡啶可顯著增加番茄紅素含量,并在類胡蘿卜素總量中占比90%～95%;在王婧等[16]的研究中,添加2,6 -二甲基吡啶有效阻斷番茄紅素向β-胡蘿卜素轉化;在Pegklidou等[13]的研究中,2-甲基咪唑的安全使用范圍為200～800 mg/L,在此范圍內可使番茄紅素占總類胡蘿卜素的90%以上;在Wang等[17]的研究中,2-異丙基咪唑通過增加番茄紅素合成途徑中關鍵酶的表達水平,增強番茄紅素的代謝流動,在添加量為0.3 g/L時幾乎完全抑制番茄紅素環化酶活性,用量較少,且容易從番茄紅素中去除,減少食物毒性。綜上,加入環化酶阻斷劑可使發酵過程停留在番茄紅素積累階段,進而提高番茄紅素的積累量。

利用B.trispora發酵生產番茄紅素,可采用加入各類環化酶阻斷劑、溶氧載體、表面活性劑和抗氧化酶等[18]。本研究在選用環化酶阻斷劑參與調控代謝時,主要選擇含氮雜環胺類化合物,其安全性更可靠,但劑量問題仍是一個潛在的危險,未來是否有更安全的阻斷劑獲得高產番茄紅素仍有待研究[19-20]。

作者研究多種環化酶阻斷劑對B.trispora發酵生產番茄紅素的影響,選擇兩類(吡啶類和咪唑類)4種環化酶阻斷劑進行比較,篩選出發酵效果最好的阻斷劑,在此基礎上進行單因素試驗和正交試驗,以此獲得產番茄紅素的最優條件,為工業化生產番茄紅素提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

三孢布拉氏霉正菌(CCTCC AF 97006)、負菌(CCTCC AF 96002):中國典型培養物保藏中心。2-氨基-6-甲基吡啶(BR)、2,6-二甲基吡啶(BR)、2-甲基咪唑(BR):上海麥克林生化科技有限公司;2-異丙基咪唑(BR):上海阿拉丁生化科技股份有限公司;番茄紅素標準品(EP):Sigma-Aldrich公司;石油醚(HPLC)、乙腈(HPLC)、甲醇(HPLC)、二氯甲烷(HPLC)等試劑均為國產產品。

活化培養基 (PDA):馬鈴薯去皮后稱取200 g煮沸30 min,紗布過濾后定容至1 000 mL,加入葡萄糖40 g,瓊脂30 g,煮沸溶解后,121 ℃滅菌20 min。

種子培養基:玉米粉44 g/L,黃豆粉19 g/L,磷酸二氫鉀0.5 g/L,VB10.004 g/L,調至pH 6.5,121 ℃滅菌20 min。

發酵培養基:玉米粉20 g/L,黃豆粉45 g/L,大豆油16 g/L,磷酸二氫鉀 1.5 g/L,硫酸鎂 0.6 g/L,VB10.004 g/L,調至pH 6.5,121 ℃滅菌20 min。

1.2 儀器與設備

LRH-250生化培養箱:上海一恒科學儀器有限公司;Sigma 1-14非冷凍微型離心機:德國Sigma-Aldrich公司;UV-6000PC紫外可見分光光度計:上海元析儀器有限公司;Agilent 1260高效液相色譜儀:美國安捷倫科技有限公司;101電熱鼓風干燥箱:北京市永光明醫療儀器有限公司;ZKXF-2電熱真空干燥箱:上海樹立儀器儀表有限公司;SW-CJ-1F無菌操作臺:蘇州安泰空氣科技有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 菌種活化

挑取B.trispora斜面劃線于PDA培養基上,置于生化培養箱中26 ℃培養5 d。

1.3.2 種子培養

250 mL錐形瓶中裝入50 mL種子培養基和0.85%生理鹽水,121 ℃高壓蒸汽滅菌20 min。滅菌后將種子培養基和生理鹽水放在無菌操作臺上冷卻。在無菌條件下吸取5 mL生理鹽水分別反復抽吸沖洗B.trispora正菌和負菌斜面培養基,將正菌和負菌孢子懸浮液振蕩混勻后,吸取1 mL接入種子培養基中,26 ℃、180 r/min振蕩培養48 h。

1.3.3 發酵培養

250 mL錐形瓶中裝入50 mL發酵培養基,滅菌后放置在無菌操作臺上冷卻。將B.trispora正菌和負菌種子培養基以體積比1∶5進行混合,混合均勻后按照10%的接種量接入發酵培養基中,26 ℃、180 r/min振蕩培養120 h。

1.3.4 番茄紅素的提取

取10 mL發酵液,3 500 r/min離心處理10 min,水洗3次后,菌泥放至已烘干稱重的玻璃平板上,置于45 ℃真空干燥箱中干燥。干燥后的菌絲經研磨后轉移到棕色具塞錐形瓶中,加入20 mL石油醚置于振蕩器中,室溫下180 r/min振蕩提取1 h。研磨至振蕩的過程中盡量避光。

1.3.5 菌體生物量的測定

菌體在45 ℃真空干燥箱中干燥至恒重。

生物量(g/L)=W/V×1 000 ,

式中:W為菌體干重,g;V為發酵液體積,mL。

1.3.6 番茄紅素的測定

參考Sevgili等[21]的方法,并加以修改。使用高效液相色譜儀對番茄紅素產量進行測定,色譜柱為C18(5 μm,250 mm×4.6 mm)。色譜條件:流動相為A,5%娃哈哈水;B為12%甲醇;C為60%乙腈;D為23%二氯甲烷;流速1 mL/min;進樣量10 μL;檢測波長469 nm,柱溫28 ℃。

1.3.7 番茄紅素純度的測定

純度=S1/S2×100%,

式中:S1、S2為番茄紅素峰面積、總峰面積,mAU。

1.4 三孢布拉氏霉菌發酵生產番茄紅素的環化酶阻斷劑優化設計

1.4.1 單因素試驗設計

使用基礎發酵培養基發酵生產番茄紅素,選擇不同添加量(2-氨基-6-甲基吡啶:0.2、0.5、0.8、1.1 g/L;2,6-二甲基吡啶:0.2、0.8、1.4 、2.0 g/L;2-甲基咪唑:0.2、0.5、0.8、1.1 g/L;2-異丙基咪唑:0.2、0.4、0.6、0.8 g/L)的4種環化酶為阻斷劑,以番茄紅素產量作為篩選指標。在此基礎上觀察該環化酶阻斷劑以不同添加量(0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8 g/L)、不同添加時的發酵時間(以下簡稱“添加時間”)(30、36、42、48、54、60 h)以及不同發酵時間(84、96、108、120、132、144 h)對菌體生物量和番茄紅素產量的影響,根據番茄紅素的產量篩選影響顯著的因素和最佳水平。

1.4.2 正交試驗設計

在單因素試驗的基礎上,以菌體生物量和番茄紅素產量為指標,進行正交試驗設計。

1.5 數據統計與分析

所有試驗均重復3次,數據用平均值±標準差表示。采用Excel 2010統計數據,采用Origin 2022作圖,采用SPSS 24.0軟件分析顯著性,采用正交設計助手設計正交試驗。

2 結果與分析

2.1 番茄紅素高效液相色譜分析

將番茄紅素標準品進行高效液相色譜分析,結果如圖1(a)所示,出峰時間在12.321 min左右;發酵產物色譜圖如圖1(b)所示,出峰時間在12.318 min左右,與番茄紅素標準品出峰時間相一致,但還有其他雜峰存在,應該是菌株發酵液中還存在其他成分,需做進一步研究。

注:(a)為標準品色譜圖;(b)為發酵產物色譜圖。圖1 番茄紅素高效液相色譜Fig.1 High performance liquid chromatogram of lycopene

2.2 不同環化酶阻斷劑對B. trispora產番茄紅素的影響

根據番茄紅素的代謝途徑,環化酶阻斷劑加入的時間對菌體生長尤為重要。因此,本試驗初步選擇在發酵48 h時分別加入不同添加量的阻斷劑,以不加任何阻斷劑的作為空白對照。結果表明,選用的4種阻斷劑均可積累大量的番茄紅素,可知阻斷劑抑制了番茄紅素的環化。

從表1可知,當2-氨基-6-甲基吡啶作為阻斷劑時,添加量為0.5 g/L時番茄紅素產量最高;當2,6-二甲基吡啶作為阻斷劑時,添加量為1.4 g/L時番茄紅素產量最高;添加0.5 g/L的2-甲基咪唑作為阻斷劑時,番茄紅素產量最高;添加0.4 g/L的2-異丙基咪唑作為阻斷劑時,番茄紅素產量最高。與空白組相比,隨著4種阻斷劑添加量的增加,菌體生物量呈降低趨勢,這是由于阻斷劑本身具有一定的毒性,對菌體生長產生抑制作用;番茄紅素產量均呈先增再減的趨勢;番茄紅素純度持續增加。綜上,以番茄紅素產量作為篩選阻斷劑的標準,當2-氨基-6-甲基吡啶作為阻斷劑時,番茄紅素產量最高為(402.37±24.61) mg/L,所以選擇2-氨基-6-甲基吡啶作為阻斷劑進行后續試驗。

表1 不同阻斷劑對B. trispora產番茄紅素的影響Table 1 Effects of different blocking agents on lycopene production by B. trispora

2.3 環化酶阻斷劑2-氨基-6-甲基吡啶添加量對B. trispora產番茄紅素的影響

在Tereshina 等[22]的研究中添加0.01 g/L 2-氨基-6-甲基吡啶實現了抑制β-胡蘿卜素的合成,推測添加微量阻斷劑就能對發酵過程產生影響。由圖2可知,隨著阻斷劑的添加,番茄紅素產量先增后減,說明環化酶阻斷劑有效地抑制了番茄紅素的環化,番茄紅素不斷積累,實現產量增加,相應地β-胡蘿卜素積累減少,番茄紅素純度增加;而阻斷劑添加越來越多,相應的安全風險也會增加,對菌體的生長造成損害,番茄紅素產量下降,但純度仍在增加。綜上,添加0.4 g/L 2-氨基-6-甲基吡啶時番茄紅素產量最高,為(434.31±13.86) mg/L,故選擇2-氨基-6-甲基吡啶的添加量為0.4 g/L。

注:曲線中不同字母表示差異顯著(P<0.05)。圖3和圖4同。圖2 環化酶阻斷劑2-氨基-6-甲基吡啶添加量對B. trispora產番茄紅素的影響Fig.2 Effect of cyclase blocker 2-amino-6-methylpyridine addition on lycopene production by B.trispora

2.4 環化酶阻斷劑2-氨基-6-甲基吡啶添加時間對B. trispora產番茄紅素的影響

由圖3可知,隨著阻斷劑添加時間的延長,番茄紅素產量和菌體生物量均呈現出先增后減的趨勢,在42 h時產量和菌體生物量達到最高,而番茄紅素純度在42 h后不斷增加,但差異性不顯著。在王常玲[23]的研究中,發酵40 h時添加咪唑阻斷劑的產量最大,推測過早添加阻斷劑會對菌體造成損害,導致番茄紅素產量不高。在裴敏[24]的研究中B.trispora發酵會產生三孢酸,可顯著促進類胡蘿卜素的合成。阻斷劑過早加入,造成三孢酸合成不足,番茄紅素產量不高,過晚加入會使番茄紅素環化生成類胡蘿卜素,導致番茄紅素產量降低。在發酵42 h時添加0.4 g/L 2-氨基-6-甲基吡啶的番茄紅素產量最高,為(254.83±41.00) mg/L。故選擇添加時間為42 h。

圖3 環化酶阻斷劑2-氨基-6-甲基吡啶添加時間對B. trispora產番茄紅素的影響Fig.3 Effect of the timing of addition of the cyclase blocker 2-amino-6-methylpyridine on lycopene production by B. trispora

2.5 發酵時間對B. trispora產番茄紅素的影響

在添加時間42 h,添加量0.4 g/L的基礎上,對B.trispora的發酵時間進一步研究。由圖4可知,隨發酵時間延長,番茄紅素產量持續增加而后再減少,在132 h時達到最高,同時菌體生物量也達到了最大值,而純度在108 h后趨于穩定。原因是B.trispora在連續的發酵過程中,時間越長產生代謝物質越多,培養基中營養成分也不斷被消耗,造成菌體生物量達到最大值后再減少,番茄紅素產量也下降,但對純度影響不大。綜上,選擇番茄紅素產量最高的發酵時間132 h作為最佳發酵時間。

圖4 發酵時間對B. trispora產番茄紅素的影響Fig.4 Effect of fermentation time on lycopene production by B. trispora

2.6 正交試驗優化工藝

根據單因素試驗結果,選用2-氨基-6-甲基吡啶作為環化酶阻斷劑,采用L9(34),以2-氨基-6-甲基吡啶添加時間(A)、添加量(B)和發酵時間(C)為三因素,正交試驗因素與水平如表2所示。

表2 正交試驗因素與水平Table 2 Factors and levels for orthogonal tests

由表3可知,菌體生物量最優組合為A2B3C3,即阻斷劑添加時間42 h、添加量0.5 g/L、發酵時間144 h,因素主次順序依次是添加時間>發酵時間>添加量;產量的最優組合為A2B2C3,即阻斷劑添加時間42 h、添加量0.4 g/L、發酵時間144 h,因素主次順序為發酵時間>添加時間>添加量。對比菌體生物量和番茄紅素產量發現,添加量之間存在差異,但其影響最小,同時考慮實際應用,選擇B2即添加量0.4 g/L。

表3 正交試驗結果Table 3 Results of the orthogonal test

方差分析如表4所示,3個因素中,阻斷劑添加時間和發酵時間對番茄紅素產量、生物量均有顯著的影響(P<0.05),方差分析結果與極差分析一致。

表4 正交試驗方差分析Table 4 Analysis of variance for orthogonal test

驗證試驗結果顯示最優組合A2B2C3實現菌體生物量38.85 g/L,番茄紅素產量498.59 mg/L,番茄紅素純度90.11%。

3 結論

本試驗通過對比4種環化酶阻斷劑(2-氨基-6-甲基吡啶、2,6 -二甲基吡啶、2-甲基咪唑、2-異丙基咪唑)對番茄紅素產量的影響,篩選出2-氨基-6-甲基吡啶作為阻斷劑,在此基礎上對2-氨基-6-甲基吡啶的添加量、添加時間和發酵時間進行單因素試驗和正交試驗,得到最優組合:添加量0.4 g/L,添加時間42 h,發酵時間144 h。方差分析得出環化酶阻斷劑添加時間和發酵時間對菌體生物量和番茄紅素產量有顯著影響(P<0.05)。驗證試驗實現菌體生物量38.85 g/L,番茄紅素產量498.59 mg/L。

利用微生物發酵法提高番茄紅素的產量和選用合適的環化酶阻斷劑仍是B.trispora工業化生產的關鍵問題,在工藝優化和生產成本控制等方面依然有提升的空間和研究的必要。因此,希望本研究為工業化生產番茄紅素提供技術支撐。