紫芝菌株Gs-1液體培養產漆酶的培養基優化研究

楊創明,婁海偉,2*,李 陽,趙仁勇,2,牛永武,龔 穎,田雙起*

1.河南工業大學 糧油食品學院, 河南 鄭州 450001 2.河南工業大學 小麥和玉米深加工國家工程研究中心, 河南 鄭州 450001

白腐真菌紫芝(Ganodermasinense)是中國特有的藥食兩用真菌品種之一,分類學上隸屬于真菌界、擔子菌門、傘菌綱、多孔菌目、靈芝科、靈芝屬[1]。截至目前,在紫芝中發現了多種生物活性化合物,如三萜類、多糖、核苷酸、脂肪酸、活性肽等[2],故紫芝具有抗腫瘤、抗氧化、降血糖和降血脂等[3]生理功能。紫芝菌絲體在生長過程中會分泌漆酶(Laccase,Lac)、木質素過氧化酶(Lignin peroxidase,Lip)、錳過氧化物酶(Manganese peroxidase,Mnp)等胞外酶[4],這些酶能夠將環境中的木質素、纖維素、半纖維素等大分子降解為小分子化合物,以供菌絲體吸收和利用[5]。其中,漆酶由于具有較高的氧化還原電勢和良好的催化活性而受到學者們的廣泛關注[6]。

漆酶是一種含銅的酚類氧化酶[7],由于其底物廣泛,能催化氧化酚類、胺類及芳香類化合物,且能環境友好地將分子氧還原成水,被廣泛應用于食品工業、藥物合成、生物修復、生物傳感器、污水處理和造紙等領域[8]。漆酶來源廣泛,在植物、動物、細菌、真菌中均有發現,其中,白腐真菌是漆酶的主要生產者[9]。然而,白腐真菌在自然生長過程中所產漆酶的量和活力遠遠達不到工業化生產的需求[10],需要采用相應方式以提高漆酶活力。

目前提高漆酶活力的方式主要有兩種:一種是宏觀層面上,即對培養基優化[11]、培養條件優化[12]、向培養基中加入誘導物[13];另一種則是微觀層面,即通過基因工程手段將漆酶基因進行克隆和異源表達[14]。前者具有操作簡單且效果明顯等優點,但大多數具有良好誘導效果的誘導物是人工合成的,通常價格昂貴且具有潛在毒性[15],將其加入培養基中,不僅增加生產成本,還影響漆酶制品的安全性并限制其應用領域(如食品工業和飼料工業)。后者則操作相對煩瑣且不易找到合適的表達載體進行高效表達。因此,目前優化培養基或培養條件、篩選低成本且安全的誘導劑是提高菌株產漆酶的主要方式。

基于食品工業和飼料工業對綠色、安全、高活性漆酶的需求,作者以食用安全的紫芝菌株Gs-1為出發菌株,以無毒無害且成本較低的農副產品(如稻殼、大豆秸稈、玉米芯、麥麩、豆粕和花生殼等)作為誘導物,采用單因素試驗和響應面試驗設計優化紫芝Gs-1產漆酶的最適液體培養基(碳源、氮源、金屬離子以及農副產品誘導物等),低成本生產綠色、安全且高活性的紫芝漆酶,以滿足食品工業對漆酶的需求,同時為實現農副產品的高值化利用奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料

紫芝菌株Gs-1,保藏于河南工業大學糧油食品學院糧食資源轉化與利用實驗室。豆粕:山東香馳控股有限公司;稻殼、大豆秸稈、花生殼、木屑:連云港蘇銳秸稈加工廠;玉米芯、麥麩:聯豐農產品深加工廠。

1.1.2 試劑

葡萄糖、硫酸鎂:分析純,天津市科密歐化學試劑有限公司;蛋白胨:北京奧博星生物技術有限責任公司;酵母浸粉:安琪酵母股份有限公司;磷酸二氫鉀、氫氧化鈉:分析純,天津市恒興化學試劑制造有限公司;丁二酸:分析純,成都艾科達化學試劑有限公司;愈創木酚:分析純,上海麥克林生化科技有限公司。

1.1.3 培養基

馬鈴薯葡萄糖瓊脂(potato dextrose agar,PDA)培養基:馬鈴薯200.0 g、葡萄糖20.0 g、硫酸鎂1.5 g、磷酸二氫鉀3.0 g、瓊脂20.0 g,用蒸餾水定容至1 000 mL。

產酶培養基:馬鈴薯200.0 g、葡萄糖20.0 g、復合氮源(蛋白胨3.0 g、酵母粉3.0 g)、磷酸二氫鉀3.0 g、硫酸鎂1.5 g,用蒸餾水定容至1 000 mL。

1.2 儀器與設備

ZHJH-C1109C超凈工作臺:上海智城分析儀器制造有限公司;YXQ-LS立式壓力蒸汽滅菌鍋:上海博訊實業有限公司;5424高速離心機:德國Eppendorf公司;UV-2550紫外可見分光光度計:島津企業管理(中國)有限公司;ZQZY-C8恒溫振蕩培養箱:上海知楚儀器有限公司;HH-4數顯恒溫水浴鍋:上海華燕醫療器械有限公司;YS-08小型高速粉碎機:北京燕山正德機械設備有限公司。

1.3 方法

1.3.1 菌株活化

將紫芝菌株Gs-1接種于PDA培養基,于恒溫培養箱中避光培養(25 ℃、7～10 d),待菌絲長滿PDA平板后,用于后續試驗。

1.3.2 產酶曲線的測定

用打孔器取5塊8 mm×8 mm的菌絲塊,接種于裝有100 mL產酶培養基的250 mL錐形瓶中,25 ℃、180 r/min搖床避光培養11 d。48 h開始檢測發酵液漆酶活力,然后每24 h檢測一次,連續測量10 d,繪制產酶曲線。

1.3.3 生物量的測定

將發酵后的培養液倒入50 mL離心管中,離心(4 ℃、8 000 r/min、5 min)得到沉淀的菌絲體,將菌絲體用蒸餾水清洗5次,于70 ℃烘箱中烘至恒重,稱量獲得菌絲體干重(以g/L表示)。

1.3.4 單因素試驗

以漆酶活力為指標,以不同碳源、氮源、金屬離子、農副產品誘導物及其不同質量濃度為影響因子進行單因素試驗,影響因子的設置如下。

碳源:分別以果糖、半乳糖、蔗糖、乳糖、麥芽糖、可溶性淀粉、糊精作為碳源,替代產酶培養基中的葡萄糖,添加量為20 g/L,確定最適碳源,同時設置最適碳源質量濃度分別為0、10、20、30、40、50、60 g/L,研究碳源種類和最適碳源質量濃度對紫芝菌株Gs-1產漆酶的影響。

氮源:分別以蛋白胨、胰蛋白胨、牛肉膏、酵母浸粉、硝酸銨、尿素、硫酸銨、氯化銨作為氮源,替代產酶培養基中的復合氮源,添加量為6 g/L,確定最適氮源,同時設置最適氮源質量濃度分別為0、2、4、6、8、10 g/L,研究氮源種類和最適氮源質量濃度對紫芝菌株Gs-1產漆酶的影響。

金屬離子:分別以0.1、1.0、5.0 mmol/L的Fe3+、Fe2+、Cu2+、Mn2+、Zn2+、K+替代產酶培養基中的Mg2+,確定最適金屬離子,同時設置最適金屬離子濃度分別為0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mmol/L,研究不同種金屬離子和最適金屬離子濃度對紫芝菌株Gs-1產漆酶的影響。

農副產品誘導物:以無毒無害且成本較低的稻殼、大豆秸稈、木屑、玉米芯、麥麩、豆粕、花生殼等農副產品為誘導物,粒度為80～100目,添加量為20 g/L,確定最適農副產品誘導物,同時設置最適農副產品誘導物質量濃度分別為0、10、20、30、40、50、60 g/L,研究不同誘導物和最適誘導物質量濃度對紫芝菌株Gs-1產漆酶的影響。

1.3.5 響應面設計

在單因素試驗基礎上,選擇影響較大的3個因素,采用響應面試驗設計優化紫芝Gs-1產漆酶最適培養基條件。

1.3.6 粗酶液的制備

將發酵后的液體培養基倒入離心管中,離心(4 ℃、8 000 r/min、5 min)得到含漆酶的上清液,然后采用0.22 μm微孔濾膜過濾上清液,獲得的濾液用于漆酶活力測定。

1.3.7 漆酶活力的測定方法

采用愈創木酚法[16]測定粗酶液中漆酶的活力。反應體系為3 mL,含1 mmol/L愈創木酚的丁二酸-氫氧化鈉緩沖液2.4 mL,粗酶液0.6 mL。反應時間為30 min,反應溫度為30 ℃。待反應完成后,立即測定反應體系在465 nm處的吸光度(OD465)。漆酶活力的定義:在上述測定條件下,每分鐘水解1 μmol愈創木酚所需漆酶的量定義為一個酶活力單位(U)。酶活力計算公式如下:

式中:3為反應液總體積,mL;0.6為反應體系中酶的量,mL;12 000為摩爾消光系數;30為反應時間,min;1 000 000為μmol與mol的換算系數;n為酶液稀釋倍數。

1.4 數據分析

試驗設置3個重復,數據以平均值±標準差表示。用Origin 2018軟件作圖,采用Design-Expert 8.0.6.1進行響應面設計,采用IBM SPSS 26進行數據處理及顯著性分析。

2 結果與分析

2.1 產酶曲線的測定

紫芝菌株Gs-1分泌漆酶的曲線見圖1,漆酶活力和生物量隨發酵時間的延長而增大。在前3 d,漆酶活力和生物量均很低,從第4 天開始,漆酶活力和生物量逐漸增加,在第8 天漆酶活力達到最大值(256.50 U/L);當發酵時間超過8 d時,隨著時間的延長,漆酶活力逐漸降低,而生物量無顯著變化,這可能是因為隨著紫芝Gs-1的生長,菌絲球增加,其胞外漆酶活性也逐漸變大,在第8 天達到峰值,隨后由于菌絲球出現自融的情況,酶活力逐漸降低[17]。因此,選擇第8 天作為后續試驗的發酵產漆酶時間。

圖1 紫芝Gs-1產漆酶曲線Fig.1 Curves of laccase secreted by G. sinense Gs-1

2.2 單因素試驗

2.2.1 碳源對紫芝菌株Gs-1產漆酶的影響

由圖2(a)可知,在單糖(葡萄糖、果糖、半乳糖)中,葡萄糖對紫芝菌株Gs-1產漆酶的影響最大,其次是果糖和半乳糖。在二糖(蔗糖、乳糖、麥芽糖)中,對紫芝產漆酶影響最大的是麥芽糖,其次分別為乳糖和蔗糖。在多糖(可溶性淀粉、糊精)中,可溶性淀粉對紫芝產漆酶活力的影響大于糊精。總體而言,對紫芝菌株Gs-1產漆酶影響最大的是葡萄糖,可能原因是葡萄糖作為生物體主要供能物質,較易被紫芝Gs-1吸收利用,為紫芝菌絲體的生長和胞外漆酶的分泌提供碳骨架和能量[18]。劉曉雪等[19]在優化平菇產漆酶的培養基時,發現葡萄糖為最佳碳源,漆酶活力最高達到189.72 U/g,杜杰克等[20]優化TrametessanguineaWTFA5產漆酶培養基時,同樣發現葡萄糖為最佳碳源,漆酶活力最高達到755 U/L。因此,選擇葡萄糖作為紫芝菌株Gs-1產漆酶的最適碳源。

注:不同字母表示數據差異顯著(P<0.05)。圖3—圖5同。圖2 碳源和葡萄糖質量濃度對紫芝Gs-1產漆酶的影響Fig.2 Effects of carbon sources and glucose concentration on the secretion of laccase by G. sinense Gs-1

由圖2(b)可知,葡萄糖質量濃度對紫芝產漆酶有顯著影響,當葡萄糖質量濃度為20 g/L時,漆酶活力達到最大值238.72 U/L;當葡萄糖質量濃度小于20 g/L時,漆酶活力隨著葡萄糖質量濃度的增加而增加,這可能是因為葡萄糖作為速效碳源有利于紫芝Gs-1菌絲體的吸收利用,從而影響其次級代謝,使漆酶活力增加;當葡萄糖質量濃度大于20 g/L時,漆酶活力隨著葡萄糖質量濃度的增加而降低,這可能是因為培養基的滲透壓隨葡萄糖濃度的增大而變大,影響紫芝Gs-1的生長代謝,從而導致漆酶活力降低[21]。Othman等[22]研究不同濃度葡萄糖對TrichodermaharzianumS7113產漆酶活力的影響,發現T.harzianumS7113產漆酶的最佳葡萄糖質量濃度為15 g/L。Kang等[23]研究在不同溫度下,不同濃度葡萄糖對漆酶活力的影響,發現葡萄糖濃度為0.1 mol/L時,漆酶活性達到最大。因此,最佳葡萄糖質量濃度為20 g/L。

2.2.2 氮源對紫芝菌株Gs-1產漆酶的影響

由圖3(a)可知,有機氮源(蛋白胨、酵母粉、牛肉膏、胰蛋白胨、尿素)對紫芝產漆酶的影響由大到小依次為胰蛋白胨、牛肉膏、酵母浸粉、蛋白胨、復合氮源(蛋白胨+酵母浸粉)、尿素,無機氮源對紫芝產漆酶的影響由大到小依次為硝酸銨、氯化銨、硫酸銨。總體而言,除尿素外,有機氮源較無機氮源更有利于紫芝Gs-1分泌漆酶,可能的原因是:尿素和無機氮源(硫酸銨、硝酸銨、氯化銨)的成分較單一,而本研究所用有機氮源(尿素除外)均含有豐富的氨基酸等營養因子,相比于無機氮源,能更好地促進紫芝Gs-1分泌胞外漆酶;由于不同菌株的生長和次級代謝對氮源的需求不同,因此,在不同氮源種類條件下,紫芝分泌胞外漆酶的能力存在顯著差異[24]。因此,胰蛋白胨最有利于紫芝Gs-1分泌胞外漆酶,這與孫瑞雪等[25]的研究結果一致。

圖3 氮源和胰蛋白胨質量濃度對紫芝Gs-1產漆酶的影響Fig.3 Effects of nitrogen sources and tryptone concentration on the secretion of laccase by G. sinense Gs-1

由圖3(b)可知,隨著胰蛋白胨質量濃度的增加,發酵液中紫芝漆酶的活力先升高后降低,當胰蛋白胨質量濃度為4 g/L時,紫芝漆酶的活力達到最大值(514.39 U/L),但與胰蛋白胨濃度為2 g/L時的漆酶活力無顯著差異。胰蛋白胨質量濃度為0 g/L,漆酶活力能達到479.67 U/L,比胰蛋白胨添加量為6 g/L時的漆酶活力高,這表明胰蛋白胨的過量添加對紫芝Gs-1分泌漆酶有抑制作用。考慮生產成本因素,因此選取2 g/L的胰蛋白胨進行后續試驗。

2.2.3 金屬離子對紫芝菌株Gs-1產漆酶的影響

由圖4(a)可知,隨著金屬離子濃度的增加,漆酶活力均呈現先升高后降低的趨勢,且都在1.0 mmol/L時達到最大酶活力。當金屬離子濃度為0.1、1 mmol/L時,Cu2+對紫芝分泌漆酶影響均最大;當金屬離子濃度為5.0 mmol/L時,不同金屬離子對紫芝分泌漆酶的影響由大到小依次為Mg2+、Fe3+、Mn2+、Fe2+、K+、Cu2+、Zn2+。總體而言,Cu2+最有利于紫芝Gs-1分泌漆酶,因此選擇Cu2+作為最適金屬離子并進行濃度梯度試驗。

圖4 金屬離子和Cu2+濃度對紫芝Gs-1漆酶的影響Fig.4 Effects of metal ions and Cu2+ concentration on the secretion of laccase by G. sinense Gs-1

由圖4(b)可知,紫芝Gs-1胞外漆酶的活力隨著Cu2+濃度的增加而呈現先升高后降低的趨勢,在Cu2+濃度為1.0 mmol/L時,紫芝胞外漆酶的活力達到最大值1 540.86 U/L。當Cu2+濃度小于1.0 mmol/L時,紫芝漆酶活力隨著Cu2+濃度的增加而升高,這可能是因為漆酶屬于銅藍蛋白家族[26],其分子結構中包含銅原子,培養基中的Cu2+是紫芝合成漆酶所必需的元素,低濃度的Cu2+會促進紫芝合成并向胞外分泌漆酶,從而使發酵液中的漆酶活力增加[27];當Cu2+濃度大于1.0 mmol/L時,紫芝漆酶活力隨著Cu2+濃度的增加而降低,這可能是因為高濃度的Cu2+會對細胞產生毒性,不利于紫芝菌絲球的生長和胞外漆酶的分泌,從而使發酵液中的漆酶活力降低[28]。因此選取Cu2+濃度為1.0 mmol/L。

2.2.4 農副產品誘導物對紫芝菌株Gs-1產漆酶的影響

由圖5(a)可知,不同的農副產品誘導物均可顯著促進紫芝Gs-1分泌胞外漆酶,誘導物對紫芝產漆酶的影響由大到小依次為豆粕、大豆秸稈、花生殼、稻殼、麥麩、木屑、玉米芯。其中,在產酶培養基中添加豆粕,可使紫芝胞外漆酶的活力達到最大值3 065.06 U/L,較對照組的漆酶活力(249.56 U/L)提高了約11.28倍。在上述農副產品誘導物中,豆粕對紫芝Gs-1分泌胞外漆酶的誘導效果最佳,因此選擇豆粕作為最適誘導物進行后續試驗。

圖5 農副產品誘導物和豆粕質量濃度對紫芝Gs-1產漆酶的影響Fig.5 Effects of agricultural by-products as inducers and soybean meal concentration on the secretion of laccase by G. sinense Gs-1

由圖5(b)可知,豆粕質量濃度顯著影響發酵液中的紫芝漆酶活力。當豆粕質量濃度小于40 g/L時,漆酶活力隨著豆粕質量濃度的增加而增加,這可能是因為豆粕中含有豐富的氨基酸和酚類物質,且生產豆粕過程中的熱處理可使芳香族氨基酸轉化為具有酚類結構的化合物[29],酚類物質和具有酚類結構的化合物的增加,誘導了紫芝Gs-1胞外漆酶的分泌;當豆粕質量濃度為40 g/L時,漆酶活力達到最大值4 653.15 U/L;當豆粕質量濃度大于40 g/L時,漆酶活力隨著豆粕質量濃度的增加而降低,這可能是因為豆粕質量濃度過高,導致產酶培養基過于黏稠,影響搖瓶發酵過程中的傳質速率(包括營養成分的傳遞和氧氣的傳遞),進而影響紫芝Gs-1胞外漆酶的分泌。竇欣[30]研究不同豆粕質量濃度對菌株Ganodermasp. SYBC L48液體發酵產漆酶的影響,發現豆粕質量濃度為6 g/L時,菌株Ganodermasp. SYBC L48的漆酶活力達到最大。Colla等[31]以豆粕為氮源、蔗渣為碳源,采用固態發酵法研究不同碳氮比對菌株Lentinuscrinitus發酵過程中漆酶活力的影響,發現隨豆粕濃度的增加漆酶活力先增加后降低,在豆粕含量為15%、甘蔗渣含量為85%條件下,培養5 d時達到最大酶活力。由此可見,豆粕作為天然、綠色誘導劑可以誘導不同菌株高產漆酶,可替代高成本的人工合成誘導劑以降低生產成本,同時也為拓展豆粕的應用方向提供思路。因此選豆粕質量濃度為40 g/L。

2.3 響應面試驗

2.3.1 響應面試驗設計

在單因素試驗可知,葡萄糖質量濃度、Cu2+濃度、豆粕質量濃度對Gs-1產漆酶活力影響高于胰蛋白胨,因此選擇這3個因素為自變量,以漆酶活力為響應值,采用Box-Behnken試驗設計優化紫芝Gs-1產漆酶的最適培養基條件,具體設計見表1。

表1 Box-Behnken試驗設計Table 1 Experimental design of Box-Behnken

2.3.2 響應面試驗結果與回歸模型分析

響應面試驗設計與結果見表2。經回歸分析得到回歸方程為Y= 6 506.08-244.81X1+239.02X2-403.97X3+263.91X1X2-121.54X1X3+19.68X2X3-723.90X12-649.82X22-264.37X32。

表2 響應面試驗設計與結果Table 2 Design and results of response surface experiment

表3 回歸模型方差分析Table 3 Analysis of variance of regression model

2.3.3 交互作用結果分析

各因素之間的交互作用對紫芝漆酶活力的影響的響應面見圖6,漆酶活力隨著葡萄糖質量濃度、Cu2+濃度以及豆粕質量濃度的增加呈現先升高后降低的趨勢,說明此模型有極大值。從響應面陡峭程度來看,隨Cu2+濃度和葡萄糖質量濃度的增加,漆酶活力變化起伏較大;隨著豆粕質量濃度的增加,漆酶活力變化相對平緩。葡萄糖質量濃度與Cu2+濃度的交互作用>葡萄糖質量濃度與豆粕質量濃度的交互作用>Cu2+濃度與豆粕質量濃度的交互作用,此結果與表3方差分析結果一致。

圖6 各因素交互作用對紫芝Gs-1漆酶活力影響的響應面Fig.6 Response surface plots of the interaction of various factors on laccase activity of G. sinense Gs-1

2.3.4 驗證試驗

基于Box-Behnken設計的試驗結果,采用軟件Design-Expert 8.0.6.1優化紫芝菌株Gs-1產漆酶的最適液體培養基,優化的最適液體培養基條件:葡萄糖質量濃度19.21 g/L、Cu2+濃度1.08 mmol/L、豆粕質量濃度32.59 g/L。在此優化條件下,紫芝漆酶活力的預測值為6 683.91 U/L,在優化條件下進行驗證試驗,測得紫芝漆酶活力的實測值為6 787.58 U/L。紫芝漆酶活力的預測值和實測值之間的相對誤差僅為1.55%,無顯著差異,表明建立的模型具有較好的實用性。紫芝菌株Gs-1在未優化培養基中所產胞外漆酶活力為256.50 U/L,優化后的漆酶活力(6 787.58 U/L)是優化前漆酶活力的26.46倍,漆酶活力顯著提高。

3 結論

培養基是影響紫芝產漆酶的重要因素,本研究優化了紫芝菌株Gs-1產漆酶的最適液體培養基條件。采用單因素試驗研究碳源、氮源、金屬離子和農副產品誘導物對紫芝Gs-1產漆酶的影響,基于單因素試驗結果,采用Box-Behnken試驗設計優化并確定了紫芝Gs-1產漆酶的最適液體培養基為葡萄糖質量濃度19.21 g/L、胰蛋白胨質量濃度2.0 g/L、Cu2+濃度1.08 mmol/L、豆粕質量濃度32.59 g/L。在優化的液體培養基條件下,紫芝Gs-1發酵液中的漆酶活力達到了6 787.58 U/L,是未優化液體培養基中漆酶活力的26.46倍,效果極為顯著。本研究采用了食用安全且成本低廉的豆粕作為誘導物,顯著促進了紫芝分泌胞外漆酶,極大提高了液體培養基中漆酶的活力,顯著優越于成本較高且具潛在毒性的人工合成誘導物。本研究優化的液體培養基,未采用有毒、有害成分,因此生產的紫芝漆酶可應用于食品工業和飼料工業,應用前景廣闊。