基于紙基熒光生物傳感器快速檢測食品中的赭曲霉毒素A

索志光,王琪璇,呂澤平,衛 敏

河南工業大學 糧油食品學院, 河南 鄭州 450001

赭曲霉毒素是由赭曲霉、純綠青霉以及疣孢青霉等產生的真菌毒素[1-2],其中赭曲霉毒素A(ochratoxin A,OTA)的污染范圍最廣、毒性最強。赭曲霉毒素A不僅可以污染小麥、高粱、玉米等多種糧食[3-4],還可以污染肉類、葡萄酒、啤酒等工業化的食品[5-6]。此外,赭曲霉毒素A具有較強的腎毒性、肝毒性、免疫毒性和致畸作用[7],被國際癌癥研究機構列為2B類潛在致癌物[8],對人類和動物的健康存在嚴重威脅。

目前,用于檢測OTA的傳統方法,多需要復雜的大型設備和專業的檢測人員,只適用于實驗室分析,不便于現場檢測。然而,在糧食和食品實際生產和儲存過程中的不同階段,可能都需要對其中的污染物進行檢測。因此,需要開發更加簡單、便捷的方法來滿足實際需求。便攜式快速檢測裝置被認為是解決這一問題的有效方法,它可以滿足就地實時檢測的要求,降低分析成本,具有較大的應用潛力。紙張價格低廉、易于購買、易于保存、還具有良好的生物相容性和生物降解性,是便攜式傳感設備的最佳傳感基質[9-11]。采用紙張作為基底的紙基分析方法,是一種很有前景的檢測方法。

核酸適配體是基于指數富集的配體系統進化技術(SELEX)從隨機寡核苷酸文庫中篩選獲得的對靶物質具有高特異性和高親和力的寡核苷酸序列[12]。核酸適配體具有合成方便、重復性好、易于儲存等優點[13],而且它的靶標廣泛,包括蛋白質、RNA、毒素、農藥等多種物質[14-15]。目前,可以特異性選擇OTA的適配體已經被發現[16],研究人員開發了多種基于OTA適配體的生物傳感器。在各種傳感器中,熒光適配體傳感器因其響應速度快、成本低、操作簡單、靈敏度高、選擇性好而備受關注[17]。因此,將紙基分析方法與熒光檢測技術結合,在實際應用方面具有較大的潛力。

基于上述研究,本試驗以紙張作為傳感器的基底,使用可以特異性識別OTA的核酸適配體,以及羧基熒光素(FAM)與黑洞猝滅基團(BHQ1)之間的FRET作用,構建了簡單、低成本的紙基熒光生物傳感器,實現對食品中OTA的現場檢測。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

核酸序列(表1):生工生物工程(上海)股份有限公司;赭曲霉毒素A:Sigma-Aldrich公司;Whatman 1級色譜紙:通用電氣英國醫療保健有限公司;米粉、綠豆餅:當地超市;三(羥甲基)氨基甲烷(Tirs):上海麥克林生化科技有限公司;氯化鈉(NaCl)和鹽酸(HCl):天津市科密歐化學試劑有限公司;乙二胺四乙酸(EDTA):洛陽化學試劑廠;鏈霉親和素(SA):Solarbio公司。本試驗所用試劑均為分析純。

表1 DNA序列Table 1 DNA sequences

1.2 儀器與設備

Agilent Cary Eclipse EL06053220型熒光光譜儀:美國瓦里安公司;HC-2066型高速離心機:安徽中科中佳科學儀器有限公司;MX-S型渦旋振蕩器:北京大龍興創實驗儀器有限公司;ULUP-Ⅱ-10T超純水機:西安優普儀器設備有限公司。NUPACK軟件(http://www.nupack.org/partition/new)。

1.3 試驗方法

參考He等[18]的方法,對紙基傳感器的制備進行了改進,具體制備過程如下。

1.3.1 檢測孔的制備

使用打孔器在Whatman 1級色譜紙上打出直徑為6 mm的圓形檢測孔,該檢測孔帶有長1.5 cm、寬2 mm的莖。莖與檢測孔連接處使用馬克筆將其雙面涂黑,放置于陰涼干燥處,等待油墨完全干透后,檢測孔制備完成。

1.3.2 紙基生物傳感器的制備

將5 μL 1 mg/mL的SA溶液滴入檢測孔,孵育30 min,使SA在紙基表面均勻包被。使用Tris-HCl(pH 7.4)緩沖液洗滌后,將4 μL 10 μmol/L帶有生物素標記的Apt-FAM滴加在檢測孔中,孵育30 min,Apt-FAM被固定在檢測孔上。用Tris-HCl(pH 7.4)緩沖液洗滌后,傳感器制備完成。上述過程均在黑暗環境下進行。

1.3.3 OTA的檢測

2.1 術后病理結果 手術病理結果顯示，176例甲狀腺結節中，惡性結節48例，其中：甲狀腺乳頭狀癌43例，髓樣癌2例，未分化癌1例，甲狀腺濾泡狀腺癌2例。良性結節128例，其中：結節性甲狀腺腫83例，甲狀腺腺瘤41例，甲狀腺炎4例。

在已制備的傳感器上滴加2 μL不同濃度的OTA標準液,并孵育30 min,然后將4 μL 6 μmol/L的cDNA-BHQ1滴在檢測孔上,繼續孵育30 min,孵育完成后,用Tris-HCl(pH 7.4)緩沖液沖洗。上述過程均在黑暗環境下進行。通過熒光分光光度計測定傳感器的熒光光譜,設置激發光波長為480 nm,使用特制檢測裝置,測試傳感器的熒光強度。檢測孔用帶有中空圓形檢測位置的長方形卡片固定,將檢測孔粘貼在中空部分,之后將卡片沿對角線插入熒光池中。當激發光射入時,與檢測孔表面成45°夾角,激發光與發射光的夾角為90°,熒光分光光度計可以成功檢測到傳感器的熒光光譜。

1.3.4 實際樣品處理

對加標米粉和加標綠豆餅進行檢測。兩種樣品的處理:將購買的市售米粉樣品和綠豆餅樣品研磨成粉,各取0.5 g,分別加入0.5 mL不同濃度的OTA標準液,室溫干燥后,加入5 mL的萃取溶劑(甲醇-水,體積比7∶3),振蕩30 min后,以12 000 r/min離心10 min,用0.45 μm有機濾膜過濾獲得上清液。之后,使用Tris-HCl緩沖液(pH 7.4)將濾液稀釋。根據上述方法,分別制備出含有0、10、100、1 000 ng/mL的加標米粉樣品和加標綠豆餅樣品。

1.4 數據處理

本試驗使用OriginPro 2021軟件處理數據,使用Adobe Illustrator 2022軟件繪制原理圖。

2 結果與分析

2.1 試驗原理

圖1為檢測過程示意圖,圖2為紙基生物傳感器的檢測原理圖。由圖2可知,標記有生物素的Apt-FAM,通過生物素和SA的強相互作用接在檢測孔表面。當OTA存在時,OTA先與其適配體鏈Apt-FAM結合,形成特殊的OTA-G-四鏈體單鏈結構的復合物(OTA-induced G quadruplex),該復合物具有較高的穩定性。再加入cDNA-BHQ1,結合有OTA的Apt-FAM無法與cDNA-BHQ1結合。因此,cDNA-BHQ1不能連接到紙基表面,FAM的熒光信號不會被猝滅。當OTA不存在時,將cDNA-BHQ1加入檢測孔中,cDNA-BHQ1與Apt-FAM通過堿基互補配對結合形成DNA雙鏈結構,并成功連接到紙基上。此時,猝滅基團BHQ1靠近熒光基團FAM,通過FRET作用猝滅FAM,FAM的熒光信號減弱。通過測定兩種不同情況的熒光差值,OTA可以成功被檢測到。

圖1 熒光分光光度計檢測紙基生物傳感器的示意圖Fig.1 Schematic diagram of detecting paper-based biosensor by fluorescence spectrophotometer

圖2 紙基生物傳感器檢測OTA的原理圖Fig.2 Schematic diagram of paper-based biosensor for OTA detection

2.2 紙基生物傳感器用于OTA檢測

使用紙基生物傳感器對500 ng/mL的OTA進行檢測,結果如圖3所示。當OTA不存在時,測得的熒光信號較弱(曲線a),為468.50,這說明DNA雙鏈結構形成,FAM的熒光信號成功被BHQ1猝滅。當OTA存在時,測得的熒光信號較強(曲線b),為637.59。這表明OTA-適配體復合物可以有效阻止cDNA-BHQ1與適配體結合,避免FAM的熒光被BHQ1猝滅。以上結果表明,OTA是引起熒光信號變化的關鍵因素,該紙基生物傳感器被成功制備。

圖3 紙基生物傳感器的熒光光譜圖Fig.3 Fluorescence spectra of paper-based biosensor

2.3 核酸適配體互補DNA序列的優化

為了使紙基生物傳感器達到最佳的檢測性能,對互補鏈cDNA-BHQ1與Apt-FAM互補的堿基序列進行了選擇。依據NUPACK軟件模擬結果(圖4),分別選取了3條不同長度的互補序列cDNA12-BHQ1、cDNA18-BHQ1、cDNA24-BHQ1。試驗結果如圖5所示,F0為傳感器與空白溶液孵育后的熒光強度,F為加入500 ng/mL OTA時傳感器的熒光強度,F-F0表示為相對熒光強度(ΔF)。可以看出,當cDNA-BHQ1與適配體互補18個堿基時,有無目標物存在時的ΔF最大。這說明cDNA-BHQ1與適配體互補的堿基序列過多或過少時,都會影響傳感器的檢測性能,不利于傳感器的構造。因此,選擇cDNA18-BHQ1進行后續試驗。

圖4 Apt與不同cDNA的形成的二級結構圖Fig.4 Diagram of secondary structure formed by Apt and different cDNA

圖5 不同cDNA對傳感器熒光強度的影響Fig.5 Effect of different cDNA on the fluorescence intensity of the sensor

2.4 紙基生物傳感器的檢測性能分析

表2 用于檢測OTA的紙基傳感器的比較Table 2 Comparison of paper-based sensors for OTA detection

2.5 紙基生物傳感器的特異性分析

為了驗證本試驗所制備的紙基生物傳感器對OTA的選擇性,在相同的試驗條件下對其他毒素(伏馬菌素B1(FB1)、T-2毒素、嘔吐毒素(DON)、玉米赤霉烯酮(ZEN)、黃曲霉毒素B1(AFB1))進行了測試。由圖7可知,當加入其他毒素孵育后,傳感器的熒光信號沒有明顯增強;其他毒素與OTA混合孵育后,仍能實現對OTA的檢測,表明所制備的紙基生物傳感器具有良好的特異性。

注:所用OTA的質量濃度為500 ng/mL,其他干擾毒素的質量濃度均為10 000 ng/mL,Mix為6種物質的混合物。圖7 不同毒素對傳感器特異性的影響Fig.7 Effects of different toxins on sensor specificity

2.6 紙基生物傳感器的重現性和穩定性分析

在相同檢測條件下,測定6個獨立相同的傳感器對500 ng/mL OTA的熒光響應值,來評估傳感器的重現性。如圖8 (A)所示,檢測結果的RSD較低,為4.1%,表明該紙基生物傳感器具有良好的重現性。傳感器在適當的條件下進行儲存,其檢測能力的穩定性也是影響傳感器性能的重要因素。因此,對紙基生物傳感器的儲存穩定性進行了測試。如圖8 (B)所示,將傳感器在4 ℃條件下儲存7 d后,傳感器的熒光強度保持在90%以上;在4 ℃條件下儲存28 d后,傳感器的熒光強度仍保持在60%以上。以上結果表明,該紙基生物傳感器具有良好的穩定性。

注:(A)紙基生物傳感器的重現性; (B)紙基生物傳感器的穩定性(OTA的質量濃度為500 ng/mL)。圖8 傳感器的重現性與穩定性Fig.8 Reproducibility and stability of different sensors

2.7 實際樣品檢測

為了驗證本試驗所制備的傳感器在實際樣品中的檢測效果,對米粉、綠豆餅樣品進行了加標檢測,結果如表3所示。米粉樣品和綠豆餅樣品的平均回收率分別為89.2%～111.0%和89.0%～103.0%,RSD均低于10%,表明該傳感器能夠成功應用于實際樣品的檢測,且檢測結果準確性較高。然后,通過檢測經高效液相色譜法(HPLC)測定的玉米粉樣品,進一步驗證了該傳感器的適用性,結果如表4所示。采用t檢驗進行分析,測定玉米粉中OTA的t均小于4.303,即均小于t(0.95 ,n=3),說明本試驗制備的傳感器與國標HPLC法無顯著性差異。可以看出,所制備的紙基生物傳感器具有一定的準確性,置信度為95%。表明該傳感器具有實際應用的潛力。

表3 米粉和綠豆餅中OTA的加標檢測 (n=3)Table 3 OTA spiked detection in rice flour and mung bean cake (n=3)

表4 玉米粉對照樣品中OTA的檢測 (n=3)Table 4 Detection of OTA in control samples of corn flour (n=3)

3 結論

本研究采用簡單、低成本的紙基分析方法和快速響應的熒光分析方法,成功構建了基于FRET作用的紙基熒光生物傳感器,用于食品中OTA的快速檢測。該傳感器采用適配體特異性識別OTA,具有良好的選擇性,可以在多種真菌毒素存在的情況下進行檢測。此外,該傳感器還具有良好的重現性和穩定性,并成功應用于實際樣品的檢測,為實現現場快速檢測真菌毒素提供了技術支持。