冷凍面團中酵母菌抗凍機制研究進展

李海峰,呂玉蘭,吳子君,李冰冰,賈 峰,周 佳,王喜鳳

河南工業大學 生物工程學院,河南 鄭州 450001

我國傳統發酵面制品主要有包子、饅頭、花卷等,通常就地加工或者由加工中心批量生產后配送至經營門店售賣。現場制作的加工方式難以保證品質,加工中心批量生產的方式雖然保證了加工質量的穩定性,但在儲存、配送的過程中會使產品的新鮮度、風味和口感等出現不同程度的下降[1]。因此,冷凍面團技術應運而生,冷凍面團是一種通過冷凍加工而成的半成品,可長期儲存,解凍后即可得到成品[2],同時可以盡可能保持面團的食用品質。

冷凍面團技術最先應用于西方的面包制作中,包括牛角包、吐司、法棍等,與歐美國家相比,我國的發酵主食以饅頭為主,但因其水分含量高,淀粉易老化,貨架期短,因此市場上多出售冷凍成品饅頭[3]。冷凍面團技術為制作新鮮面包提供了一種更簡便的方法,并逐漸取代了傳統的面包制作工藝[4]。因其有效地解決了食品易老化、貨架期短的問題,是食品工業中最具發展前景的技術之一[5]。

然而,冷凍面團行業仍然面臨著一些重大的挑戰,如酵母菌活性的降低,以及面團面筋-淀粉網絡結構的破壞[6]。酵母菌活性的降低是由酵母菌細胞膜發生變化引起的[7]。細胞膜的柔韌性在細胞的生存中起著重要作用,低溫容易使細胞膜壓縮,流動性降低,特別是當不飽和脂肪酸含量較低時,膜破裂的可能性大大增加[8];海藻糖是一種由兩個葡萄糖單體連接而成的雙糖,可以通過抑制冰晶的形成、保持細胞膜的完整性和蛋白質的固有構象來保護酵母菌[9];甘油作為一種常見的低溫保護劑,通過抑制冰晶不再成核生長來維持細胞形態以抵御環境壓力[10];脯氨酸是一種多功能氨基酸,不僅可以為酵母菌提供氮源,還可以作為活性氧清除劑保護細胞減少環境壓力以維持細胞穩態[11];谷胱甘肽(glutathione,GSH)作為一種強大的抗氧化劑,在氧化還原平衡反應中起著關鍵作用,保護細胞減少氧化脅迫[12];水通道蛋白在冷應激條件下使酵母菌在高滲環境下快速排出胞內水分,減少冰晶的形成[13]。

在凍融脅迫下,酵母菌細胞膜和蛋白質會直接或間接地被損害,并導致胞內活性氧的產生,這些脅迫在一定程度上能夠誘導酵母菌內部的生物代謝網絡發生一系列動態變化[14]。因此作者擬從海藻糖積累、甘油合成與轉運、脯氨酸增加、GSH合成、細胞膜流動性改變以及水通道蛋白基因的表達等方面闡述酵母菌的耐冷凍機制,以期為酵母菌株抗凍能力提升與冷凍面團的品質改良等研究提供參考。

1 冷凍面團中的酵母菌組成

酸面團是由面粉、水以及多種微生物組成的傳統面食發酵劑[15]。由酸面團制作的冷凍面團比商業活性干酵母制作的冷凍面團具有更好的口感。酸面團中菌種種類豐富,其中已鑒定的酵母菌種類超過30種[16],主要包括釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)、假絲酵母(Candidahumilis)、少孢酵母(Saccharomycesexiguus)、異常畢赤酵母(Pichiaanomala)和漢遜德巴利酵母(Debaryomyceshansenii)等[17]。

優良耐凍酵母菌株的獲得是冷凍面團生產中至關重要的前提。路雪純等[18]從低溫貯藏的老面中篩選出一株耐冷凍酵母菌AY005,該菌株在-18 ℃冷凍貯存60 d后仍有較好的發酵力,存活率為62.5%;郭薇丹等[19]通過凍融法從面肥、蘋果、葡萄等食品中分離出了8株耐冷凍異常威克漢姆酵母(Wickerhamomycesanomalus),這幾株酵母在4 ℃下,24 h內就開始產氣,而普通S.cerevisiae在4 ℃下基本不生長產氣;薛美翠等[20]采用模擬面團預發酵法篩選出了D.hansenii,該菌株冷凍7 d后存活率仍高達86%。除了對耐冷凍酵母菌株進行篩選外,也可以通過誘變等方法來提高酵母菌的耐冷凍性。陳君等[21]采用低溫等離子體誘變結合定向馴化和篩選的方法,開發了一株耐凍酵母菌株AFY-1,該菌株在-20 ℃和-80 ℃凍藏120 d后,細胞存活率保持在83.2%和82.0%,顯著高于原始酵母菌的35.6%和29.7%;也有研究旨在通過鑒定耐凍酵母菌株的凍融耐受性相關基因,如破壞S.cerevisiae中的YCP4基因[22]、去除PDR3位點上的等位基因(A148T/A229V/H336R/L541P)[23]來解釋S.cerevisiae的耐冷凍機制,提高酵母菌的耐凍性能。

2 冷凍面團中酵母菌的耐冷凍機制

2.1 海藻糖的積累

普遍認為,冷凍面團中酵母菌的抗凍性與胞內海藻糖含量有關,海藻糖又稱酵母糖、漏蘆糖、蕈糖等,是一種由兩分子葡萄糖通過α-1,1-糖苷鍵連接而成的非還原性二糖,是處于高溫、冷凍、輻射、干燥、高滲透壓等條件下合成的應激代謝物[24]。關于海藻糖對冷凍面團中酵母菌的抗凍保護機理尚未達成一致說法,但目前普遍比較認可的是“水替代”假說和“玻璃態”假說,其中,“水替代”假說是指細胞在冷凍脅迫條件下脫水,使得胞內大分子物質脂質和蛋白質等表面的水保護膜喪失,而海藻糖使水分子形成的氫鍵被失水部位的羥基和分子形成的氫鍵所取代,從而保護生物膜,維持生物大分子的活性;“玻璃態”假說是指細胞受到低溫脅迫后,海藻糖把相鄰的分子緊緊包住,形成一種糖玻璃體,降低分子玻璃基質中的分子運動和化學反應速率,維持生物分子特定的空間結構[25]。海藻糖可以抑制谷胱甘肽還原酶的作用,從而提高冷凍面團中酵母菌的存活率,當冷凍面團中海藻糖含量低于5%時,酵母菌抗凍性下降,海藻糖含量大于12%時,酵母菌抗凍性與海藻糖含量沒有直接的相關性[26]。

冷凍面團的冷凍和解凍會導致S.cerevisiae的細胞氧化和凋亡,此時,酵母菌通過提高海藻糖合成酶或降低水解酶含量提高海藻糖含量,從而提高酵母菌的抗凍性[27]。冷凍面團中酵母菌胞內海藻糖的積累主要包括尿苷二磷酸葡萄糖(UDPG)依賴的海藻糖合成途徑和腺苷二磷酸葡萄糖(ADPG)依賴的海藻糖合成途徑[28]。UDPG途徑是將葡萄糖轉化為葡萄糖6-磷酸(G6P),與UDPG共同促進海藻糖合成的一條代謝途徑;MAL62(麥芽酶編碼基因)參與ADPG依賴性海藻糖合成途徑,MAL62的表達誘導海藻糖的積累,與TPS1(海藻糖合成酶編碼基因)過表達相比,MAL62過表達對細胞內海藻糖積累的增強作用較小,但可促進發酵前海藻糖的合成,增強麥芽糖代謝,從而促進酵母菌中海藻糖的積累,此外,在NTH1(海藻糖水解酶基因)缺失下過表達MAL62和TPS1,冷凍面團中的酵母菌表現出更高的抗凍性[29]。然而,與MAL62基因相關的海藻糖合成和傳統UDPG依賴性海藻糖合成途徑之間的差異尚不清楚,仍需繼續深入探究。

2.2 甘油的合成與轉運

甘油是一種類似海藻糖的冷凍保護劑,有研究表明,酵母菌內甘油的積累和外源添加甘油均能夠提高冷凍面團中酵母菌的存活率和發酵力[30]。外源甘油通過增加胞內甘油含量提高酵母菌的耐冷凍性,Izawa等[31]在甘油培養基中培養的S.cerevisiae胞內富集甘油,對冷凍脅迫具有較高的耐受性,同樣,此S.cerevisiae在冷凍面團中也保持了較高的發酵力。甘油不斷積累的過程也是S.cerevisiae細胞耐冷凍性能增強的標志。在冷凍面團中,S.cerevisiae的變異株通過積累甘油,不斷提升發酵力,有研究表明,編碼甘油通道蛋白FPS1基因缺失的突變體可以在細胞內積累甘油,冷凍面團冷凍7 d后仍保持較高的發酵力,FPS1突變體是一個開發優質冷凍面團的優勢菌株,具有商業優勢[32]。

在冷凍面團技術的研究中,利用甘油的代謝途徑研發了許多新的耐冷凍性更強的S.cerevisiae菌種。甘油由甘油3-磷酸脫氫酶(GPD)和甘油3-磷酸酶(GPP)催化磷酸二羥丙酮(DHAP)合成,甘油降解是通過甘油激酶完成的,面團在冷凍過程中,甘油激酶活性降低,甘油積累增加,S.cerevisiae抗凍性增加[33]。另外,低溫環境激活了冷凍面團中S.cerevisiae高滲甘油(HOG)途徑,誘導GPD、GPP基因的轉錄和表達,促進甘油的合成[34]。HOG途徑還能調節糖轉運蛋白STL1的表達,激活FPS1的表達,FPS1在兩個甘油通道調節蛋白RGC1和RGC2的協助下,迅速封閉甘油轉運通路,將甘油截留在細胞中,維持胞內外滲透壓平衡[35]。此外,酵母菌還可以通過轉運蛋白GUP1和GUP2從胞外吸收甘油抵御凍害[36]。

2.3 脯氨酸的積累

脯氨酸由特定的代謝途徑產生,是一種自由基清除劑,可以調節細胞質滲透平衡,提高胞內酶和細胞膜的穩定性,還可以抑制脫水和冰成核、降低DNA溶解溫度以及清除活性氧[37]。冷凍面團中酵母菌胞內的脯氨酸含量是影響其抗凍性的關鍵因素,脯氨酸積累賦予酵母菌更高的抗凍融性,并使其在冷凍后保持更高的發酵能力[38]。

在S.cerevisiae細胞中,脯氨酸轉化為谷氨酸需要脯氨酸氧化酶和脫氫酶的參與,這兩個酶分別由PUT1和PUT2基因編碼,如果將PUT1基因破壞,細胞內會積累更高水平的脯氨酸,從而增強細胞對冷凍脅迫的抵抗力;如果將PUT2基因破壞,細胞活力則顯著下降,這表明脯氨酸分解代謝的中間產物Δ′-吡咯啉-5-羧酸脫氫酶對酵母菌有明顯的毒性作用,另外酵母菌在液泡中積累了脯氨酸,這表明有一個系統可以將多余的脯氨酸運輸到液泡中,這種液泡積累可能對酵母菌的抗凍性起重要作用[39]。谷氨酸合成脯氨酸需要γ-谷氨酰激酶(GK),GK的活性受脯氨酸含量的調節,PRO1基因編碼GK,當PRO1基因發生突變時,脯氨酸積累量增多,突變體酵母菌株在-20 ℃冷凍后,細胞會積累更多的脯氨酸,對凍融脅迫的耐受性明顯增加[40]。

2.4 GSH的合成

對冷凍面團的凍藏處理會在一定程度上誘導酵母菌產生應激反應,合成多種具有自我修復功能的物質以抵御環境變化,GSH是一種三肽化合物,由L-半胱氨酸、L-谷氨酸和甘氨酸脫水縮合而形成,它可以參與三羧酸循環和糖代謝[41],有解毒[42]、抗氧化[43]的作用。酵母菌在冷凍面團中處于高滲狀態,胞內活性氧水平增加,GSH含量升高[44],GSH在氧化應激反應中起關鍵作用,能夠通過谷胱甘肽過氧化物酶作用將二硫鍵還原成巰基(—SH),巰基能有效地清除酵母菌中的氧自由基,減緩對細胞膜、DNA和膜蛋白的過氧化作用,減少GSH向氧化型谷胱甘肽(GSSH)的轉化[45]。

酵母菌胞內GSH的合成由ATP依賴性的兩步酶促反應過程組成,第一步是由谷氨酸和半胱氨酸在限速酶(GSH1)催化下生成γ-谷氨酸半胱氨酸,第二步是γ-谷氨酸半胱氨酸在谷胱甘肽合成酶(GSH2)的作用與甘氨酸結合形成γ-谷氨酰半胱氨酸甘氨酸,即GSH[46]。GSH1的缺失導致酵母菌不能生長,GSH在酵母菌中是必不可少的物質。王立梅等[47]用轉錄組學的手段分析S.cerevisiae受到氧化脅迫后,GSH合成限速酶活性增強,與抗氧化酶產生協同效應,提高了還原型輔酶Ⅱ(NADPH)含量,為合成GSH提供了充分的還原能力。

2.5 水通道蛋白基因的過表達

在提高冷凍面團中S.cerevisiae抗凍性的實驗中,通過對水通道蛋白活性分析,并對質膜水運輸蛋白的基因表達進行記錄可以發現其活性與S.cerevisiae的冷凍敏感性直接相關[48]。S.cerevisiae的水通道蛋白是膜蛋白的一種,主要包括AQY1和AQY2,它的作用是運輸水和中性小分子溶質比如甘油等物質,它對水分子的主動轉運功能是維持細胞內外滲透壓平衡的關鍵因素[49]。

當酵母菌缺乏營養時,AQY1基因就會高表達,而AQY2基因則會在指數增長的正常細胞中表達,刪除這些基因中的任何一個都能使它們對凍融脅迫更加敏感,而它們的過表達可以提高酵母菌的凍融耐受力[50]。當引入外源表達hAQY1基因時,S.cerevisiae細胞會在滲透作用下快速排出水分,從而減少細胞內冰晶的形成和破壞,增加酵母菌的抗凍性[51]。同樣,在凍融脅迫下,質膜中內源性水通道蛋白的表達水平越高,水的外排速度越快[52]。這些發現都支持了質膜水運輸蛋白活性在測定酵母菌凍融耐受性方面的作用[53],并且為改善工業酵母菌株在冷凍面團中的生存能力,開發應用于冷凍面團的抗凍酵母菌株打開了新的前景。

2.6 細胞膜流動性的改變

酵母菌的細胞膜主要由蛋白質和磷脂組成,作為隔離細胞器與外界環境的一道屏障,細胞膜的功能與細胞的生存能力密切相關[54]。冷凍面團中酵母菌能夠通過改變膜的流動性和相變以及激活細胞對膜化學成分的控制來感知和適應環境脅迫,而過強的氧化脅迫會引發細胞膜脂質層組成的變化,導致脂質過氧化,進而引發膜解體和細胞死亡[55]。一般認為,具有高不飽和、低鏈長脂肪酸組成的細胞膜具有較高的流動性[56]。

面團在冷凍過程中,酵母菌自身可以通過自我調節來保持細胞膜的正常流動,最常見的變化是降低脂肪酸的飽和度、減少脂肪酸鏈的平均鏈長和增加生物膜內膽固醇含量來抵消膜流動性的下降[57]。另外,甾醇是影響酵母菌膜流動性的基本結構和調節脂類,在脂肪酸鏈中插入甾醇,能夠穩定和加強膜脂雙分子層,盡管甾醇組成通常不隨溫度變化,但在較低溫度下,甾醇/磷脂相對比例的降低是增加酵母菌膜流動性的一個重要特征[58]。近年來,許多學者利用代謝工程技術對S.cerevisiae進行了改造,雖然已完成了多不飽和脂肪酸合成途徑的構建,但所產生的脂肪酸含量相對較少,因此需要對其進行更深入的研究。

3 總結與展望

冷凍面團具有很大的市場潛力,耐冷凍酵母菌的篩選和能力提升研究一直是國內外學者的研究熱點。在冷凍條件下,酵母菌經受著高滲、低溫和氧化脅迫,如圖1所示,細胞膜作為細胞的保護屏障,通過降低脂肪酸的飽和度、減少脂肪酸鏈的平均鏈長和增加生物膜內膽固醇含量來抵消膜流動性的下降,另外甾醇/磷脂相對比例的降低是增加真核微生物膜流動性的一個重要特征;MAL62基因參與ADPG途徑增加海藻糖含量,與TPS1基因的過表達相比,MAL62基因過表達對細胞內海藻糖積累的增強作用較小,但可促進發酵前海藻糖的合成,增強麥芽糖代謝,促進海藻糖的合成。此外,在NTH1基因缺失下過表達MAL62和TPS1基因可進一步增強酵母菌株的抗凍性;Hog1途徑調控GPD1、GPP1基因的轉錄和表達從而促進甘油的合成,此外,Hog1還可以調節STL1的表達,激活酵母菌對甘油的攝取,并激活FPS1的表達,FPS1在Hog1、RGC1和RGC2的協助下,迅速封閉甘油轉運通路,將甘油截留在細胞中,酵母菌還可以通過GUP1和GUP2從胞外吸收甘油抵御凍害;谷氨酸合成脯氨酸需要PRO1基因編碼GK,當PRO1基因發生突變時,脯氨酸積累量增多,脯氨酸轉化為谷氨酸需要脯氨酸氧化酶和脫氫酶,這兩種酶分別由PUT1和PUT2基因編碼,如果將PUT1基因破壞,細胞內積累了更高水平的脯氨酸,增強了細胞對冷凍脅迫的抵抗力,如果將PUT2基因破壞,細胞活力顯著下降,這表明脯氨酸分解代謝中間產物Δ′-吡咯啉-5-羧酸脫氫酶對酵母菌有明顯的毒性作用;GSH的合成首先是由谷氨酸和半胱氨酸在GSH1催化下生成γ-谷氨酸半胱氨酸,然后γ-谷氨酸半胱氨酸在GSH2的作用與甘氨酸結合形成GSH,冷凍過程中,GSH合成限速酶活性增強,GSH合成增多;AQY1和AQY2基因過表達使酵母菌在高滲環境下加快胞內水分的外排,從而抑制胞內冰晶的形成,提高細胞的抗凍性。面團在冷凍過程中,酵母菌為適應低溫發生的一系列動態變化,為酵母菌的抗凍能力提升與冷凍面團的品質改良等研究提供了參考。

圖1 冷凍面團中酵母菌的耐冷凍機制Fig.1 Antifreeze mechanism of yeast in frozen dough

冷凍面團技術自引入我國之后得到飛速發展,但相對國外來說,我國對其工藝體系的研究還不成熟,最終的產品質量仍不及新鮮產品,酵母菌作為影響其品質的重要因素,目前國內外對其耐冷凍機制的研究還不夠廣泛和深入。據報道,深入甘油合成和轉運基因的挖掘能夠加深人們對冷凍面團中酵母菌冷凍脅迫應答機制的理解。海藻糖是一種重要的蛋白質穩定劑,關于海藻糖與蛋白質的相互作用,目前仍是一個懸而未決的問題,另外,與MAL62基因相關的海藻糖合成和UDPG途徑之間的差異也尚不清楚,還需要進一步研究。同樣地,盡管人們對甘油在較高溫度下穩定蛋白質的機理進行了廣泛的研究,但是對其低溫條件下穩定蛋白質的機理研究卻很少,蛋白質冷變性的起源目前還不完全清楚,此外,人們利用代謝工程手段改造S.cerevisiae合成的多不飽和脂肪酸含量普遍較低,這些都需要在今后的研究中進一步探索。