布氏桿菌和羊口瘡血清抗體的檢測與分析

魏 敏,龍宥茨，張煜杭，姬格金，梁 倩，鮮思美

貴州大學動物科學學院預防獸醫實驗室，貴州貴陽 550025

羊布氏桿菌病（羊布?。?，是一種由布氏桿菌感染引起的具有較強傳染性的慢性傳染病，危害性強且流行范圍廣。病菌通過呼吸道、生殖系統、消化道進行傳播。人和家畜接觸或是食用了羊肉、羊奶，甚至是吸入帶病菌的灰土都會被傳染。此病對妊娠期間的母畜危險性較大，可導致母畜流產，易發生子宮內膜炎，影響后期受孕。公羊感染會發生睪丸炎、睪丸萎縮，導致公羊行走不暢，繁衍能力消失。羊口瘡，又稱傳染性膿皰，是由羊口瘡病毒引起綿羊、山羊的急性、接觸傳染性、嗜上皮性的人獸共患病。OrfV 可通過損傷的皮膚或黏膜感染動物，在口、唇、舌、鼻、乳房等部位的皮膚和黏膜會形成丘疹、水皰、膿皰、潰瘍，最后結成疣狀厚痂。綿羊和山羊為主要的感染動物，尤其是3 ～6月齡的羔羊最為敏感，群體感染性高，致死率高。布魯氏桿菌病和羊口瘡均是人獸共患傳染病，疫病的發生不僅給羊產業帶來巨大的經濟損失，而且威脅人類健康，存在社會公共衛生安全隱患。因此開展羊血清中布病和羊口瘡抗體的檢測具有重要意義。本試驗采用虎紅平板凝集試驗和間接ELISA 方法對臨床上采集的423 份羊血清樣本進行了布氏桿菌和羊口瘡抗體的檢測，現將結果報告如下。

1 材料與方法

1.1 主要材料

1.1.1 血清樣本

423 份羊血清樣本（布魯氏桿菌疫苗未免疫羊血清樣本423 份，羊口瘡疫苗免疫羊血清樣本243份、未免疫羊血清樣本180 份）均由貴州大學動物疫病研究室保存。

1.1.2 主要試劑

布氏桿菌病標準陽性血清及陰性血清、布氏桿菌病虎紅平板凝集抗原購自青島易邦生物工程有限公司；羊口瘡病毒B2L-F1L 截短融合蛋白由貴州大學動物疫病研究室制備保存；BCA 蛋白濃度測定試劑盒購自碧云天生物技術有限公司；TMB 顯色液、酶標條購自Solarbio 科技有限公司；HRP 標記兔抗山羊IgG 購自重慶奧怡生物技術有限公司。

1.2 方法

1.2.1 虎紅平板凝集試驗檢測羊布氏桿菌

在虎紅平板反應紙卡上，取被檢血清30 μL 與布魯桿菌凝集抗原30 μL 相混合，同時以布氏桿菌標準陰性、陽性血清作為對照，在5 min內觀察結果。液體混合物出現卷邊、肉眼可見的凝集物，判定為陽性；液體混合物均勻渾濁、無凝集物形成，判定為陰性。

1.2.2 B2L-F1L 截短融合蛋白濃度測定

采用BCA 蛋白濃度測定試劑盒對純化后保存的rB2L-F1L 融合蛋白進行濃度測定。

1.2.3 基于羊口瘡病毒B2L-F1L 截短融合蛋白的間接ELISA 方法檢測血清抗體

采用本實驗室前期研究建立的基于羊口瘡病毒B2L-F1L 截短融合蛋白的間接ELISA 方法檢測血清樣本。間接ELISA 的最佳反應條件：rB2L-F1L 蛋白抗原最佳包被量為0.25 μg/mL，5%脫脂奶粉封閉1 h，血清最佳稀釋倍數1:200，一抗及酶標二抗最佳孵育時間為1 h，酶標二抗的最佳工作濃度為1:8 000，TMB 最佳顯色時間為15 min，OD450nm值≥0.358 判為陽性，反之則判為陰性。具體操作如下。

①包被：取純化的rB2L-F1L 融合蛋白，將蛋白用包被液稀釋濃度為0.25 μg/mL，4 ℃過夜包被于96 孔板中，每孔100 μL。

② 洗滌：棄去包被液，用PBST 洗板3 次，每次3 min，并在吸水紙上拍干。

③ 封閉：每孔加入5 %的脫脂奶粉200 μL 于37 ℃封閉1 h。

④ 洗板：棄去多余的液體，用PBST 洗板3 次，每次3 min，并在吸水紙上拍干。

⑤ 一抗孵育：將待檢血清分別加入96 孔板中，每孔100 μL，37 ℃孵育1 h。

⑥ 步驟同4。

⑦ 二抗孵育：每孔加入100 μL 辣根過氧化物酶（HRP）標記的兔抗山羊IgG(1:8 000)，37 ℃孵育1 h。

⑧ 步驟同4。

⑨ TMB 顯色：每孔加入100 μL 的TMB 顯色液，37 ℃避光顯色15 min；加入50 μL 的終止液終止顯色，酶標儀讀取OD450nm 值。

2 結果

2.1 虎紅平板凝集試驗檢測羊布氏桿菌病結果

采用虎紅平板凝集試驗對臨床上采集的羊血清樣本進行檢測，布氏桿菌標準陽性血清樣本出現凝集物，陽性對照成立；423 份羊血清樣本與標準陰性血清對照結果相同，即液體均勻渾濁、未見凝集物，即判定為羊布病抗體陰性。

2.2 基于羊口瘡病毒B2L-F1L 截短融合蛋白間接ELISA 檢測羊口瘡抗體結果

2.2.1 B2L-F1L 截短融合蛋白濃度測定結果

采用BCA 蛋白濃度測定試劑盒對純化后保存的B2L-F1L 蛋白進行濃度測定，B2L-F1L 蛋白濃度為135 μg/mL，將蛋白進行1:540 倍稀釋為ELISA 方法蛋白包被的使用濃度0.25 μg/mL。

2.2.2 間接ELISA 檢測羊口瘡血清抗體結果

采用間接ELISA 方法檢測423 份臨床采集的羊血清樣本，羊口瘡陰性血清和陽性血清對照各2 孔。陰性血清對照孔的OD450nm 分別為0.163 和0.142，OD450nm 值＜0.358；陽性血清對照孔的OD450nm 分別為0.574 和0.652，OD450nm 值＞0.358；表明本試驗的陰、陽性對照成立。檢測出羊口瘡疫苗免疫羊血清樣本陽性率為62.55%（152/243），未免疫羊血清樣本陽性率為14.44%（26/180）。

3 討論

布魯氏菌病為我國二類動物疫病，傳播速度快、范圍廣，目前全國羊群布病感染率呈上升趨勢，羊群布病防控形勢較嚴峻。血清學試驗如試管凝集試驗、虎紅平板凝集試驗（RBT）、補體結合試驗和間接酶聯免疫吸附試驗（ELISA）等是診斷和檢測布病的常用方法。其中RBT 具有易攜帶、操作簡便、成本低、檢測速度快、結果易觀察等優點而被廣泛應用于基層的大面積布病篩查，然而該方法存在著“前帶現象”、假陽性高且判斷結果存在主觀影響等缺點。

OrfV 通常可感染所有年齡段的綿羊和山羊，其它各種反芻動物和哺乳動物，如駱駝、犬以及人等均有OrfV 感染的報告。目前，有許多方法可以對羊口瘡病毒感染進行檢測，如病原學檢測方面有病毒分離鑒定以及常規和實時熒光定量PCR 等；血清學檢測方面有血清中和試驗和ELISA 等。間接ELISA 方法是檢測OrfV 抗體的重要手段，Bora 等使用全病毒為包被抗原建立了檢測羊血清中OrfV抗體的間接ELISA 方法[1]，劉麗佳、張靜等將OrfV B2L 基因進行截短以表達優勢抗原表位區建立了間接ELISA 方法。本試驗以純化的rB2L-F1L 蛋白作為包被抗原建立間接ELISA 方法（該技術已獲得發明專利授權，ZL202110360839.6）對臨床血清樣本進行檢測。由于目前OrfV 尚無商品化的ELISA 試劑盒，故本試驗未能進行臨床樣品符合率的比對研究。

我國陜西、西藏、四川、新疆、甘肅、云南、貴州等地區均有羊布氏桿菌病和羊口瘡的疫情暴發，目前針對兩種疾病均無特效藥治療，主要采取疫苗免疫進行防控。根據國家發布的布氏桿菌病相關政策，貴州省是我國布病防控二類地區,原則上不實施免疫。但貴州省羊群布氏桿菌病感染率較高，因此先要對羊群進行布氏桿菌病篩查,以防從業人員感染布病。目前羊口瘡病未列入國家免疫強制計劃，且暫無特效藥，主要使用弱毒疫苗和滅活疫苗進行預防免疫，但弱毒疫苗會存在毒力返強、活病毒免疫逃避、免疫后抗體水平不高等缺點。滅活苗僅限于已發生過羊口瘡的羊場使用。為了解采樣羊群布氏桿菌病和羊口瘡抗體水平，本試驗采用虎紅平板凝集試驗和純化的rB2L-F1L 蛋白作為包被抗原建立間接ELISA 方法對臨床上采集的423 份羊血清樣本（布魯氏桿菌疫苗未免疫羊血清樣本423 份；羊口瘡疫苗免疫羊血清樣本243 份，未免疫羊血清樣本180 份）進行布氏桿菌和羊口瘡的抗體水平檢測。結果顯示，羊布氏桿菌病抗體陰性，羊口瘡疫苗未免疫羊血清樣本陽性率為14.44%（26/180），再結合流行病學調查情況和臨床癥狀，表明羊群不存在布氏桿菌感染，但存在羊口瘡病毒感染。