LncRNA OIP5-AS1 對膀胱癌細胞增殖、遷移及侵襲的影響*

丁上書，高文勝，趙華才

710068 西安，陜西省人民醫院 泌尿外科（丁上書、趙華才）；710021 西安，西安醫學院 研究生處（高文勝）

膀胱癌（bladder cancer，BCa）是泌尿系統中最常見的惡性腫瘤，可分為非肌肉浸潤性BCa 和肌肉浸潤性BCa，肌肉浸潤性BCa 更具侵略性［1-2］。大于3 cm 的腫瘤是其復發和進展的危險因素［3］。盡管BCa 的早期檢測取得了較大進展，但BCa 患者的死亡率并沒有明顯改變［4］。因此，有必要研究參與BCa 進展的分子機制，以尋找潛在的診斷標志物及治療靶標。長鏈非編碼RNAs（long non-coding RNAs，lncRNAs）是含有200 個核苷酸的功能性RNA 分子，可在不同層面發揮重要功能，包括X 染色體失活、染色質重塑和轉錄抑制［5-6］。OIP5-AS1 是多種癌癥的癌基因，如肺癌［7］、胃癌［8］和宮頸癌［9］。在BCa 中，OIP5-AS1 可以調節細胞的增殖和凋亡，并與不良預后相關［10］。然而，對OIP5-AS1 調控機制的研究仍然有限。本課題組前期體外實驗研究發現 lncRNA OIP5-AS1 可以作為預測BCa 臨床疾病進展和預后不良的有效生物標志物［11］。因此，本研究擬利用BCa細胞樣本，確定lncRNA OIP5-AS1 對BCa 細胞行為的影響，以期為BCa 的治療提供治療靶點。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及儀器

DMEM 培養基（貨號：PM150710）購自武漢Procell；胰酶（+EDTA，貨號：BL512A）購自廣州Biosharp；胎牛血清（貨號：C04001）購自上海Vica Cell；LipofectamineTM2000（貨號：11668019）購自美國Invitrogen 公司；CCK-8（貨號：BS350A）購自廣州Biosharp；結晶紫（貨號：JC3913）購自合肥BOMEI；Matrigel（基底膠，貨號：356234）、Transwell 小室（貨號：3422）購自上海CORNING；PrimeScrip ?RT 試劑盒（貨號RE-03014）購自上海銳博；Vimentin 兔克隆抗體（貨號：A19607）、E-cadherin 兔克隆抗體（貨號：A20798）、β-actin 兔克隆抗體（貨號：AC026）購自武漢abclonal；生物素化山羊抗兔IgG（H+L）（貨號：S0001）購自武漢affinity；倒置生物顯微鏡（型號DMI1）購自LEICA；酶標儀（型號spectra max PLUS 384）購自Molecular Devices；實時熒光定量（RT-PCR）儀（型號QuantStudio TM3）由美國ThermoFisher 儀器有限公司生產；電泳儀（型號JY200C）購自北京君意東方電泳設備有限公司。

1.2 細胞培養

人類正常膀胱細胞系（SV-HUC-1，貨號：iCell-h208）和BCa 細胞系（EJ、T24、BIU87，貨號：iCell-h208-001b）購自賽百慷（上海）生物技術股份有限公司，細胞在含有1%青霉素-鏈霉素溶液和10%胎牛血清的DMEM 培養基中，于37℃、5% CO2濕化培養箱中培養。

1.3 細胞轉染

接種T24 細胞至6 孔板，細胞匯合度達到70%時，使用LipofectamineTM2000 分別將siRNA-NC（陰性對照）、siRNA-OIP5-AS1（敲低）、Vector（空載體）、OIP5-AS1（過表達）轉染OIP5-AS1 表達最高的膀胱癌細胞，記為siRNA-NC 組、siRNA-OIP5-AS1 組、Vector 組、OIP5-AS1 組，control 組只轉染LipofectamineTM2000 試劑，轉染后48 h Real-time PCR 評價轉染效率。序列如下：siRNA-NC：UACCGACUGGCAAU UCAUG；siRNA-OIP5-AS1：GGCAGUAGAAUCACUUAAA；OIP5-AS1 過表達質粒、空載體由上海吉瑪生物科技有限公司合成。

1.4 CCK-8 檢測細胞增殖

按1.3 項下分組，細胞轉染48 h 后，吸棄上清，無血清培養基1∶10 稀釋CCK-8 試劑，加入已稀釋CCK-8 工作液10 μL/孔，并輕輕晃動培養板數次，37℃、5% CO2恒溫繼續培養2 h。使用酶標儀在450 nm 波長處測定各孔的吸光值，每組4 次重復。

1.5 劃痕實驗檢測細胞遷移

記號筆在6 孔板背后，用直尺均勻的劃橫線，按1.3 項下分組，細胞轉染48 h 后，吸除上清液，200 μL 移液槍槍頭比著直尺，垂直于背后橫線劃痕，PBS 輕輕洗滌2 次，放入37℃ 、5% CO2培養箱培養。按0、24 h 時間點取樣，50 倍鏡下在各水平直線標記處跟蹤拍攝各孔細胞劃痕狀態。劃痕愈合距離△d =0h 劃痕寬度- 24 h 劃痕寬度。

1.6 Transwell 實驗檢測細胞侵襲

預鋪Matrigel 膠至Transwell 上室，放置于培養箱中孵育4 h 使其干成膠狀，取出孔板，在上室加入100 μL 預溫的無血清培養基，室溫下靜置20 min，使基質膠再水化，吸去剩余培養液。在Transwell 小室中加入200 μL 的細胞懸液，放于孵箱中繼續培養48 h，0.5%的結晶紫溶液染色，顯微鏡下觀察并計數進入膜下的細胞數。

1.7 Real-time PCR 檢測細胞lncRNA OIP5-AS1的表達

使用TRIzol?試劑從細胞中提取總RNA，并使用PrimeScripTMRT 試劑盒反轉錄，采用SYBR?Pre-Mix Ex TaqTM 分析lncRNA OIP5-AS1 的基因表達，以U6 表達水平作為內參。引物序列：LncRNA OIP5-AS1：F：TGCGAAGATGGCGGAGTAAG（5’-3’），R：TAGTTCCTCTCCTCTGGCCG（5’-3’）；U6：F：CTCGCTTCGGCAGCACA（5’-3’），R：AACGCTTCACGAATTTGCGT（5’-3’）。根據RT-qPCR 反應條件反應40 個循環，記錄CT 值，采用2-ΔΔCT定量lncRNA OIP5-AS1 的表達。

1.8 Western blot檢測細胞Vimentin、E-Cadherin蛋白表達

細胞用預冷的PBS 緩沖液洗滌兩次，后在4℃下3 000 r/min 離心5 min，用全細胞裂解緩沖液在冰上裂解30 min，然后將裂解液在4℃下3 500 r/min離心20 min，收集上清液，BCA 法檢測蛋白濃度，用10% SDS-PAGE 分離蛋白質樣品，并將其電泳轉移到聚偏氟乙烯膜，用5%脫脂牛奶室溫封閉2 h。然后將膜與下列一級抗體在4℃下孵育過夜：抗Vimentin（1∶2 000）、E-cadherin（1∶1 000）、抗β-actin（1∶10 000）。然后加入生物素化山羊抗兔IgG，室溫下孵育1.5 h，洗滌，ECL 顯色。采用Image Pro Plus軟件分析各蛋白條帶的灰度值，計算蛋白相對表達量。

1.9 統計學方法

采用SPSS 22.0 軟件進行數據統計分析，數據以均數±標準差（±s）表示，兩組間比較采用配對t檢驗分析，多組間比較采用單因素方差分析，P＜ 0.05 表示差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 LncRNA OIP5-AS1 在Bca 細胞中的表達

與SV-HUC-1 細胞株相比，Bca 細胞系（EJ、T24、BIU87）lncRNA OIP5-AS1 的表達明顯升高（P＜ 0.05），其中，T24 細胞中lncRNA OIP5-AS1 的表達較高（表1），后續實驗采用T24 細胞進行。

表1 細胞LncRNA OIP5-AS1 的表達Table 1．Expression of LncRNA OIP5-AS1 in Cells

2.2 LncRNA OIP5-AS1 敲低或過表達對癌細胞生物學行為的影響

qPCR 結果顯示，與control 組相比，siRNA-OIP5-AS1 組lncRNA OIP5-AS1 的表達明顯降低，OIP5-AS1組lncRNA OIP5-AS1 的表達明顯升高（P＜ 0.05；圖1C）。CCK-8 檢測結果顯示，與control 組相比，siRNA-OIP5-AS1 組細胞增殖明顯降低，OIP5-AS1 組細胞增殖明顯升高（P＜ 0.01；圖1D）。劃痕實驗結果表明，與control 組相比，siRNA-OIP5-AS1 組細胞遷移能力明顯降低，OIP5-AS1 組細胞遷移能力明顯升高（P＜ 0.01；圖1A、E）。Transwell 小室實驗結果顯示，與control 組相比，siRNA-OIP5-AS1 組細胞穿膜數明顯降低，OIP5-AS1 組細胞穿膜數明顯升高（P＜ 0.01；圖1B、F）。

圖1 各組細胞生物學行為變化Figure 1. Changes in Biological Behaviors of Cells in Each Group

2.3 LncRNA OIP5-AS1 敲低或過表達對癌細胞上皮間質轉化的影響

與control 組相比，siRNA-OIP5-AS1 組Vimentin蛋白表達明顯降低，E-Cadherin 蛋白表達明顯升高（P＜ 0.05），OIP5-AS1 組Vimentin 蛋白表達明顯升高，E-Cadherin 蛋白表達明顯降低（P＜ 0.05；圖2）。

圖2 各組細胞Vimentin、E-Cadherin 的蛋白表達Figure 2．Expression of Vimentin and E-Cadherin Proteins in Each Group

3 討 論

BCa 的發病率位于全球惡性腫瘤的第9 位，同時也是發病率位居男性泌尿系腫瘤首位的腫瘤［12］。近年來，隨著分子生物學技術的發展，靶向治療已成為BCa 的重要輔助治療手段［13］。尋找有效的BCa分子治療靶點對改善患者的預后有重要的臨床意義。研究表明，lncRNA 在腫瘤組織中有明顯的異常表達，并廣泛參與調節腫瘤細胞的分化、增殖、侵襲、凋亡，與臨床分期和患者的預后相關［14］。與lncRNA 在BCa 診斷中的應用相比，目前對lncRNA在BCa 中的研究還不夠充分，因此，需要進一步評估lncRNA 在BCa 中作用。

LncRNAs 在BCa 的發生發展中起重要作用，其影響細胞增殖、凋亡、侵襲、遷移及腫瘤抗性，這為BCa 的臨床診治和預后提供新的途徑［15］。OIP5-AS1 位于15q15.1 染色體上，在多種癌癥中起致癌作用［16］。如在肺腺癌中，OIP5-AS1 調節miR-448/Bcl-2 軸，促進其進展［17］。另外，OIP5-AS1 通過抑制miR-223 上調CDK14，加速骨肉瘤的發生［18］。本研究結果表明人BCa 細胞中OIP5-AS1 的表達顯著上調，提示其可能影響BCa 的進展。抑制腫瘤細胞增殖是腫瘤治療的主要方式之一，研究顯示OIP5-AS1 敲除通過miR-217/MTDH 軸抑制人BCa 細胞的增殖［10］。在本研究中，OIP5-AS1 過表達促進了T24 細胞增殖，OIP5-AS1 沉默則顯著抑制T24 細胞增殖，與上述研究結果一致。此外，腫瘤的發展往往伴隨著腫瘤的轉移，這會導致治療失敗、腫瘤復發甚至死亡［19］。OIP5-AS1 可通過調節miR-410/Wnt-7b影響膠質瘤細胞的侵襲和遷移［20］。在本研究中，過表達OIP5-AS1 促進了T24 細胞遷移和侵襲，OIP5-AS1 低表達則顯著抑制T24 細胞的遷移和侵襲，表明OIP5-AS1 低表達可能發揮抑制BCa 進展的作用。

研究證實上皮源性的腫瘤細胞在發生侵襲遷移的過程中常發生上皮間質轉化（epithlial-mesenchymal transition，EMT）現象，即上皮來源的腫瘤細胞通過EMT 過程丟失上皮表型，獲得間質細胞的表型，在此過程中獲得了高侵襲轉移能力［21］。研究表明EMT在多種腫瘤（前列腺癌、結腸癌、乳腺癌和肺癌等）的惡性轉化中發揮著關鍵作用［22］。Liang 等［23］指出lncRNA H19 通過作為競爭性的內源性RNA 來調控參與EMT 的多個基因的表達。下調OIP5-AS1 的表達能抑制卵巢癌細胞的EMT、遷移和侵襲［24］。因此，我們研究了OIP5-AS1 對BCa 細胞EMT 的影響，結果發現沉默OIP5-AS1 顯著降低了EMT 標記物Vimentin、E-Cadherin 的表達，提示OIP5-AS1 低表達可能通過BCa 細胞EMT 特征發揮抑癌功能。

綜上所述，lncRNA OIP5-AS1 在BCa 細胞系中高表達，沉默OIP5-AS1 可抑制BCa 細胞增殖、遷移和侵襲，并抑制細胞EMT 能力。LncRNA OIP5-AS1有望成為一種BCa 治療靶點。

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