熒光PCR探針熔解曲線法檢測(cè)MTBC對(duì)利福平、異煙肼耐藥性的價(jià)值分析

溫曉萍

【摘要】? 目的? ? 探討熒光PCR探針熔解曲線法檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌復(fù)合菌群（MTBC）對(duì)利福平、異煙肼耐藥性的價(jià)值。方法? ? 回顧性分析2018年6月—2021年4月惠州市職業(yè)病防治院收治的528例肺結(jié)核與耐多藥結(jié)核病患者的臨床資料。所有患者均進(jìn)行痰液標(biāo)本采集，采集后進(jìn)行送檢，之后進(jìn)行分離培養(yǎng)和藥敏試驗(yàn)，采用熒光PCR探針熔解曲線法對(duì)MTBC對(duì)利福平、異煙肼的耐藥性進(jìn)行測(cè)定分析，最終獲得211份陽(yáng)性菌株，再經(jīng)鑒定為MTBC 208份，3份為非結(jié)核分枝桿菌。對(duì)熒光PCR探針熔解曲線法檢測(cè)MTBC耐藥性的效能進(jìn)行分析。結(jié)果? ? 經(jīng)比例法進(jìn)行的藥敏試驗(yàn)結(jié)果顯示，208份MTBC菌種標(biāo)本中，120份對(duì)利福平具有耐藥性，146例對(duì)異煙肼具有耐藥性；經(jīng)熒光PCR探針熔解曲線法檢查后，135份對(duì)利福平耐藥，敏感73份，其中僅有114份確定對(duì)利福平具有耐藥性；經(jīng)熒光PCR探針熔解曲線法檢查后，134份對(duì)異煙肼耐藥，敏感74份，其中有131份確定對(duì)異煙肼具有耐藥性。熒光PCR探針熔解曲線法檢測(cè)MTBC對(duì)利福平、異煙肼耐藥性的特異度分別為76.14%，95.16%，對(duì)異煙肼耐藥性的檢測(cè)特異度高于利福平，差異具備統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；對(duì)異煙肼耐藥性的檢測(cè)靈敏度低于利福平，準(zhǔn)確度高于利福平，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。結(jié)論? ? 熒光PCR探針熔解曲線法檢測(cè)MTBC耐藥性的效能較高，可應(yīng)用于快速發(fā)現(xiàn)耐藥基因位點(diǎn)突變，篩查耐多藥肺結(jié)核，并在治療中進(jìn)行動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)，進(jìn)而可指導(dǎo)臨床調(diào)整治療方案。

【關(guān)鍵詞】? 結(jié)核分枝桿菌復(fù)合菌群； 熒光聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)； 探針熔解曲線法； 利福平； 異煙肼； 耐藥性

中圖分類號(hào)：R446? ? ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1672-1721（2023）16-0101-03

DOI：10.19435/j.1672-1721.2023.16.034

臨床中結(jié)核病屬于一種多發(fā)疾病，其主要是因?yàn)楦腥窘Y(jié)核分枝桿菌導(dǎo)致，為嚴(yán)重威脅人類健康的傳染性疾病。結(jié)核病的主要傳播途徑為飛沫傳染，在人口密集大、人口流動(dòng)大的公共場(chǎng)所中極易傳播，所以積防治結(jié)核病具有十分重要的意義。臨床呼吸內(nèi)科中，重癥結(jié)核病屬于一種常見(jiàn)疾病，具有較高的發(fā)生率和病死率，需及時(shí)采取有效的治療措施，從而降低患者的病死率。結(jié)核病主要經(jīng)呼吸道飛沫傳播所致，主要癥狀包括咳嗽、咳痰、咯血、胸痛、呼吸困難、長(zhǎng)期午后潮熱等，部分患者會(huì)有倦怠乏力、盜汗、食欲減退和體重減輕等癥狀[1]。結(jié)核分枝桿菌包括麻風(fēng)分枝桿菌、非結(jié)核分枝桿菌、結(jié)核分枝桿菌復(fù)合菌群（MTBC），其中MTBC又包含人型結(jié)核分枝桿菌、鼠型分枝桿菌、牛型分枝桿菌等，MTBC可侵犯整個(gè)身體的各個(gè)器官，以肺部最為多見(jiàn)[2]。由于目前我國(guó)的結(jié)核病感染者數(shù)量較多，且發(fā)病率、病死率及耐藥率均處于較高水平。因此，探究MTBC對(duì)各類結(jié)核病的常用藥，如利福平、異煙肼的耐藥性，對(duì)于結(jié)核病的防治具有深遠(yuǎn)意義[3]。熒光聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）探針熔解曲線法可快速檢測(cè)出MTBC的藥敏結(jié)果，具有較高的操作靈活性[4]。本研究旨在探討熒光PCR探針熔解曲線法檢測(cè)MTBC對(duì)利福平、異煙肼耐藥性的價(jià)值，報(bào)道如下。

1? ? 資料與方法

1.1? ? 一般資料? ? 回顧性分析2018年6月—2021年4月惠州市職業(yè)病防治院收治的528例肺結(jié)核與耐多藥結(jié)核病患者的臨床資料，男289例，女239例，年齡31～67歲，平均年齡（44.67±5.91）歲。診斷標(biāo)準(zhǔn)：以《臨床診療指南·結(jié)核病分冊(cè)》[5]中的相關(guān)診斷標(biāo)準(zhǔn)作為參照。納入標(biāo)準(zhǔn)：滿足上述診斷標(biāo)準(zhǔn)者；非精神疾病，可進(jìn)行正常溝通；無(wú)嚴(yán)重心、肝等功能異常等。排除標(biāo)準(zhǔn)：合并腦腫瘤者；依從性差者；存在免疫功能障礙者；存在造血系統(tǒng)功能異常者；對(duì)研究所用藥物過(guò)敏者等。

1.2? ? 方法? ? 所有患者均進(jìn)行痰液標(biāo)本采集，采集后進(jìn)行送檢，嚴(yán)格按照《全國(guó)臨床檢驗(yàn)操作規(guī)程》[6]進(jìn)行分離培養(yǎng)。使用至善全自動(dòng)細(xì)菌鑒定及藥敏分析儀進(jìn)行菌種鑒定及藥敏試驗(yàn)。使用比例法檢測(cè)MTBC對(duì)利福平、異煙肼的耐藥性，并按照2004年美國(guó)臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化委員會(huì)藥敏試驗(yàn)判斷標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行藥敏試驗(yàn)；參照抗微生物藥物敏感性試驗(yàn)執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)推薦的篩選試驗(yàn)和確證試驗(yàn)進(jìn)行超廣譜β-內(nèi)酰胺酶（ESBLs）檢測(cè)，所用質(zhì)控菌株均采購(gòu)自原衛(wèi)生部臨床檢驗(yàn)中心。之后采用熒光PCR探針溶解曲線法MTBC對(duì)利福平、異煙肼的耐藥性進(jìn)行測(cè)定分析，最終獲得211份陽(yáng)性菌株，再經(jīng)鑒定為MTBC 208份，3份為非結(jié)核分枝桿菌。

1.3? ? 觀察指標(biāo)? ? （1）熒光PCR探針熔解曲線法檢測(cè)MTBC對(duì)利福平、異煙肼的耐藥性結(jié)果。（2）熒光PCR探針熔解曲線法與金標(biāo)準(zhǔn)的檢出結(jié)果比較，其中金標(biāo)準(zhǔn)為比例法藥敏試驗(yàn)。（3）熒光PCR探針熔解曲線法檢測(cè)MTBC耐藥性的效能，包括特異度=真敏感例數(shù)/（假耐藥+真敏感）例數(shù)×100%，靈敏度=真耐藥例數(shù)/（真耐藥+假敏感）例數(shù)×100%，準(zhǔn)確度=（真耐藥+真敏感）例數(shù)/總例數(shù)×100%。

1.4? ? 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法? ? 使用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)數(shù)資料以百分比表示，采用χ²檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2? ? 結(jié)果

2.1? ? 熒光PCR探針熔解曲線法檢測(cè)MTBC對(duì)利福平、異煙肼的耐藥性結(jié)果? ? 經(jīng)比例法進(jìn)行的藥敏試驗(yàn)結(jié)果顯示，208份MTBC菌種標(biāo)本中，120份對(duì)利福平具有耐藥性，146份對(duì)異煙肼具有耐藥性。經(jīng)熒光PCR探針熔解曲線法檢查后，135份對(duì)利福平耐藥，敏感73份，其中僅有114份確定對(duì)利福平具有耐藥性；經(jīng)熒光PCR探針熔解曲線法檢查后，134份對(duì)異煙肼耐藥，敏感74份，其中有131份確定對(duì)異煙肼具有耐藥性，見(jiàn)表1。

2.2? ? 熒光PCR探針熔解曲線法檢測(cè)MTBC耐藥性的效能? ? 熒光PCR探針熔解曲線法檢測(cè)MTBC對(duì)利福平、異煙肼耐藥性的特異度分別為76.14%，95.16%，對(duì)異煙肼耐藥性的檢測(cè)特異度高于利福平，差異具備統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；對(duì)異煙肼耐藥性的檢測(cè)靈敏度低于利福平，準(zhǔn)確度高于利福平，但差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），見(jiàn)表2。

3? ? 討論

結(jié)核病是由于結(jié)核桿菌感染人體所導(dǎo)致，根據(jù)感染部位的不同，可分為肺結(jié)核、淋巴結(jié)核、骨骼結(jié)核，且腎臟等其他部位也有可能感染結(jié)核[7]。具體而言，結(jié)核桿菌會(huì)入侵人體多個(gè)臟器官，其中肺部為主要累及部位，所以通常將其稱之為肺結(jié)核。肺結(jié)核以青年人為主要高發(fā)人群，具有慢性和緩發(fā)傳染病的特點(diǎn)，四季均可能發(fā)病，潛伏期在4～8周之間，除了感染肺部外，還可能感染骨骼、皮膚、腸、腹膜、腦膜以及頸淋巴等[7]。人和人之間的傳播方式主要為呼吸道傳染，傳染源是接觸到已經(jīng)被感染的肺結(jié)核患者。近幾年來(lái)，隨著環(huán)境污染問(wèn)題的日益嚴(yán)重和艾滋病傳播率上升等多種因素的影響，結(jié)核病的發(fā)生率呈現(xiàn)出逐年上升趨勢(shì)。結(jié)核病的臨床表現(xiàn)以呼吸系統(tǒng)癥狀為主，如咳嗽、咯血等，同時(shí)伴隨全身癥狀，如乏力、低熱等?？菇Y(jié)核藥物包括異煙肼、利福平、吡嗪酰胺及乙胺丁醇等[8-9]，但隨著抗結(jié)核藥物的使用，有耐藥性的結(jié)核病患者數(shù)量逐漸增加。當(dāng)患者同時(shí)至少對(duì)兩種一線抗結(jié)核藥物——利福平和異煙肼均出現(xiàn)耐藥性，即被稱為耐多藥結(jié)核病[10]。傳統(tǒng)MTBC耐藥性的檢測(cè)方法為絕對(duì)濃度法，不僅操作繁瑣、耗時(shí)較長(zhǎng)，同時(shí)對(duì)菌株分離培養(yǎng)的速度慢，進(jìn)而影響對(duì)MTBC耐藥性的診斷結(jié)果[11]。

熒光PCR探針熔解曲線法是目前廣泛應(yīng)用于食源性致病菌檢測(cè)的方法，是一種體外核酸擴(kuò)增技術(shù)，以DNA為模板，在體外合適條件下和耐熱DNA聚合酶作用下，對(duì)人工合成的寡核苷酸為引物進(jìn)行特異性擴(kuò)增目的DNA片段。傳統(tǒng)方法檢測(cè)致病菌檢出限僅為104 cfu/mL，而大多數(shù)PCR體系的檢出限可達(dá)到10～104 cfu/mL，具有較高的靈敏度[12]。本研究結(jié)果顯示，經(jīng)比例法進(jìn)行的藥敏試驗(yàn)結(jié)果顯示，208份MTBC菌種標(biāo)本中，120份對(duì)利福平具有耐藥性，146例對(duì)異煙肼具有耐藥性。經(jīng)熒光PCR探針熔解曲線法檢查后，135份對(duì)利福平耐藥，敏感73份，其中有114份確定對(duì)利福平具有耐藥性；經(jīng)熒光PCR探針熔解曲線法檢查后，134份對(duì)異煙肼耐藥，敏感74份，其中有131份確定對(duì)異煙肼具有耐藥性。熒光PCR探針熔解曲線法檢測(cè)MTBC對(duì)利福平、異煙肼耐藥性的特異度分別為76.14%，95.16%，對(duì)異煙肼耐藥性的檢測(cè)特異度高于利福平，差異具備統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；對(duì)異煙肼耐藥性的檢測(cè)靈敏度低于利福平，準(zhǔn)確度高于利福平，但差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。分析原因可能為：在MTBC對(duì)異煙肼的耐藥性檢測(cè)中，可覆蓋接近90%的異煙肼耐藥性菌株，要多于利福平，與郭紅革等[13]研究結(jié)論相符。

綜上所述，經(jīng)熒光PCR探針熔解曲線法檢測(cè)MTBC耐藥性的效能較高，可應(yīng)用于快速發(fā)現(xiàn)耐藥基因位點(diǎn)突變，篩查耐多藥肺結(jié)核，并在治療中進(jìn)行動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)，進(jìn)而可指導(dǎo)臨床調(diào)整治療方案。但本研究未對(duì)敏感結(jié)核分枝桿菌菌株進(jìn)行檢測(cè)，且未明確有無(wú)外源性再感染情況發(fā)生，還需進(jìn)行多中心的深入研究。

參考文獻(xiàn)

[1]? ? 劉宇，吳利先.Xpert MTB/RIF在結(jié)核病診斷中的研究進(jìn)展[J].中國(guó)病原生物學(xué)雜志，2017，12（8）：800-802.

[2]? ? 李君蓮.RNA恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)快速檢測(cè)痰標(biāo)本中結(jié)核分枝桿菌的研究[J].檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)與臨床，2017，14（1）：68-70.

[3]? ? 賈慶軍，謝立，吳亦斐，等.杭州市結(jié)核病患者耐藥檢測(cè)結(jié)果分析[J].預(yù)防醫(yī)學(xué)，2019，31（3）：289-292.

[4]? ? CHEN DANNI，HAN YINGYING，LI JIE，et al.Rapid detection of Salmonella in human and animal feces using real-time fluorescent quantitative polymerase chain reaction[J].Disease Surveillance，2020，35（2）：64-68.

[5]? ? 中華醫(yī)學(xué)會(huì).臨床診療指南·結(jié)核病分冊(cè)[M].北京：人民衛(wèi)生出版社，2005：66.

[6]? ? 尚紅，王毓三，申子瑜.全國(guó)臨床檢驗(yàn)操作規(guī)程[S].北京：人民衛(wèi)生出版社，2015： 125-128.

[7]? ? ZHENG ZHEN，HUANG HAI，ZOU YI，et al.Application of anti-tuberculosis antibody and tuberculosis infection T cell spot test in the diagnosis of tuberculosis[J].Chinese Journal of Nosocomiology，2016，26（10）：2232-2234.

[8]? ? 林礪，李海波，夏凡，等.血漿外泌體來(lái)源的miRNA-323a-3p作為結(jié)核病潛在生物標(biāo)志物的評(píng)估[J].上海交通大學(xué)學(xué)報(bào)（醫(yī)學(xué)版），2020，40（2）：34-42.

[9]? ? 周云泵，陳嬋，林珍.結(jié)核病患者發(fā)生耐藥性危險(xiǎn)因素分析及對(duì)策研究[J].實(shí)用預(yù)防醫(yī)學(xué)，2016，23（5）：601-602.

[10]? ? 呂德良，楊應(yīng)周，譚衛(wèi)國(guó)，等.深圳市耐多藥結(jié)核病治療轉(zhuǎn)歸分析[J].中國(guó)熱帶醫(yī)學(xué)，2016，16（7）：649-652.

[11]? ? LIU YINPING，WANG JIE，ZHANG JUNXIAN，et al.Detection of clinical isolates of Mycobacterium tuberculosis resistant to isoniazid and propylthioamide and study on related gene mutations[J].Chinese Journal of Tuberculosis，2016，10（9）：718-721.

[12]? ? WU HUINA，SUN FUSHENG，LIU QINGWEN，et al.The value of fluorescence PCR probe melting curve method in detecting the resistance of Mycobacterium tuberculosis complex to rifampicin and isoniazid[J].Chinese Journal of Tuberculosis，2019，41（1）：74-79.

[13]? ? 郭紅革，李佩珠.熒光PCR探針熔解曲線法評(píng)價(jià)結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群對(duì)利福平和異煙肼耐藥性的價(jià)值[J].深圳中西醫(yī)結(jié)合雜志，2021，31（10）：46-48.

（收稿日期：2023-03-11）