思膚安營養修護仿生膏對痤瘡大鼠皮損及IGF-1/PI3K/Akt信號通路的影響

張旭冉,梁 嬪,蔣 思,鄭楷平,劉 琴

(武漢大學中南醫院,湖北 武漢 430071)

痤瘡是一種常見的累及毛囊皮脂腺的慢性炎癥性疾病,表現為粉刺、丘疹、膿皰、結節、囊腫等多形性炎癥性皮損,預后可遺留萎縮或增生性瘢痕,對患者情緒、社交、工作等影響巨大。近年來多項研究表明皮脂的定量和定性變化是所有痤瘡發病特征的初始改變,皮脂的成分及比例變化與痤瘡發病密切相關[1-5]。思膚安營養修護仿生膏為自主研發的一款仿生護理膏,它模擬了人類健康皮脂組分,由20%亞麻酸、60%亞油酸和2%卵磷脂組成。臨床實踐中發現使用思膚安營養修護仿生膏可以緩解痤瘡患者面部炎癥及非炎癥皮損,且患者耐受性良好[6],但其調節脂質及治療痤瘡的機制仍需進一步研究。本實驗觀察了思膚安營養修護仿生膏對痤瘡大鼠皮損的影響,并基于胰島素樣生長因子1(IGF-1)/磷脂酰肌醇-3-激酶(PI3K)/蛋白激酶B(Akt)信號通路探討了其可能的治療機制。

1 實驗材料與方法

1.1實驗動物 18只SPF級雄性SD大鼠,鼠齡28 d,體重(130±20)g,購自湖北貝恩特生物科技有限公司,動物使用合格證號:SCXK(鄂)2021-0027。大鼠飼養于武漢大學中南醫院SPF級動物實驗中心,在統一飼養標準下喂養,飲用水、飼料、籠盒及墊料均經過高溫高壓滅菌處理,飼料、墊料等物品均由武漢大學中南醫院實驗動物中心提供。實驗經武漢大學中南醫院動物倫理委員會同意(倫理批準編號:ZN2022043)。

1.2實驗耗材與儀器 痤瘡丙酸桿菌菌液(編號:330605)、哥倫比亞血平板(北納公司),思膚安營養修護仿生膏(武漢市陽邏經濟開發區陽邏港華中國際),阿達帕林凝膠(黑龍江福和制藥集團股份有限公司),SDS-PAGE凝膠制備試劑盒、RIPA總蛋白裂解液、BCA蛋白質濃度測定試劑盒、ECL化學發光檢測試劑盒、100xPMSF、磷酸化蛋白酶抑制劑、5x蛋白上樣緩沖液、麗春紅染液、TBS(粉劑)、電泳液(粉劑)、轉膜液(粉劑)、IGF-1抗體(ABclonal,A0303)、PI3K抗體(三鷹,60225-1-Ig)、Akt抗體(三鷹,10176-2-AP)、SREBP-1抗體(SC-13551)、抗體洗脫液、顯影定影液、Tween-20、脫脂奶粉均購自武漢佰仟度生物科技有限公司,Protease Inhibitor Cocktail(ROCHE)、蛋白Marker(Thermo)、0.45 μm PVDF膜(Millipore)、柯達醫用X射線膠片、免疫組化染色超敏試劑盒、DAB顯色試劑、PBS緩沖液購于Affinity Biosciences,正置熒光顯微鏡(日本奧林巴斯,型號:BX53),全自動數字玻片掃描與分析系統(德國徠卡,型號:Aperio VERSA 8),暗匣(廣東粵華醫療器械廠有限公司),掃描儀L4158(EPSON),臺式離心機(上海安亭科學儀器廠),冷凍離心機(湖南湘儀實驗室儀器開發有限公司),制冰機(常熟市雪科電器有限公司),脫色搖床(北京市六一儀器廠)。

1.3實驗方法 分別在大鼠背部左上、左下、右上、右下選取4處1.5 cm×1.5 cm大小正方形區域,每個區域皮內點狀均勻注射100 μL痤瘡丙酸桿菌懸液(8×107CFU/mL),連續7 d,建立痤瘡模型。造模成功后,用水性筆在尾巴根部標記上1～18的數字,按隨機數字法將其分為對照組、阿達帕林組及思膚安組,每組6只。對照組、阿達帕林組及思膚安組每日17:00分別于皮損處涂抹生理鹽水、阿達帕林凝膠、思膚安營養修護仿生膏1次,連續干預4周。

1.4檢測指標及方法 分別于干預2周及4周后觀察皮損情況,取大鼠皮損組織行相關檢測。

1.4.1皮損組織病理形態 切取大鼠背部皮損處組織,每塊長約0.5 cm×0.5 cm,進行固定脫水,制作石蠟包塊,切片后進行HE染色,20倍視野顯微鏡下觀察皮損組織病理形態。

1.4.2皮損組織尼羅河紅熒光染色及皮損脂質百分比 冰凍切片,固定液固定10 min,蒸餾水洗3次,每次3 min,加入尼羅河紅染色液染色5～10 min,洗滌。用365 nm波長激發,細胞核為藍色,脂滴為紅色。50倍顯微鏡下取5個不重疊的視野,使用Image J軟件計數5個單位視野內脂滴數量,計數取平均值。

1.4.3皮損組織中IGF-1、PI3K、Akt、SREBP-1表達情況 分別采用Western blot法檢測和免疫組化法觀察。

1.4.3.1Western blot檢測方法 取皮損組織塊,用預冷的PBS緩沖液漂洗2～3次,去除血污,剪成小塊置于高速低溫研磨儀專用離心管中,加入10倍于組織體積的組織蛋白提取試劑(使用前數分鐘內加入蛋白酶抑制劑),高速研磨。將勻漿液轉移至離心管中,振蕩,冰浴裂解30 min,期間用移液器反復吹打,確保勻漿液完全裂解。4 ℃下13 000×g離心5 min,收集上清,即為總蛋白溶液,BCA法檢測蛋白濃度。按濃縮膠50 V、分離膠120 V進行恒壓電泳,至溴酚藍到達膠板下沿。按100 V恒壓轉膜,轉膜時間根據目的蛋白分子量大小調整。將轉好的膜加入封閉液室溫封閉1 h,除去封閉液,加入已稀釋好的一抗4 ℃過夜?；厥找严♂尩囊豢?用TBST洗3次,每次5 min。加入稀釋好的二抗,室溫孵育30 min,用TBST在室溫下搖床上洗4次,每次5 min。根據不同的光強度調整曝光條件,顯影、定影。將膠片掃描存檔,IPWIN60軟件處理系統分析目標帶的光密度值。

1.4.3.2免疫組化染色觀察方法 取大鼠皮損組織并制備石蠟切片,脫蠟,水化,3%過氧化氫浸泡5 min,PBS緩沖液浸泡2 min。使用IGF-1、PI3K、SREBP-1、Akt抗體,根據一抗說明書選擇合適的修復方式進行抗原修復,一抗孵育,復溫,二抗孵育,顯色,復染,脫水,透明,封片。40倍顯微鏡下采集5個視野的圖片。

1.5統計學方法 使用EXCEL整理記錄實驗數據,應用SPSS 25.0統計分析軟件對結果進行統計分析。計量資料組間比較采用單因素方差分析,如果組間差異有統計學意義,進一步采用LSD方法進行兩兩比較,P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1各組大鼠背部皮損大體情況 造模第7天,各組大鼠造模部位皮損基本一致,造模部位均有大量丘疹、膿皰、粉刺、破潰、結痂等皮損,皮損基底皮膚呈暗紅色,無明顯滲液。干預2周后,各組大鼠背部皮損處紅腫、丘疹、結節較前均有好轉,思膚安組、阿達帕林組背部皮損處結節、紅腫較對照組輕。干預4周后,對照組仍可見片狀紅斑、丘疹,思膚安組及阿達帕林組丘疹、結節基本消退,其中思膚安組皮損處皮膚更光滑、凹陷性瘢痕更少,毛發更多。見圖1。

圖1 各組痤瘡大鼠背部皮損大體情況

2.2各組大鼠皮損組織HE染色病理學形態 造模第7天,對照組痤瘡皮損處毛囊漏斗部擴張,大量角質物堆積其中,毛囊壁及周圍組織內伴大量以中性粒細胞為主的炎細胞浸潤。干預2周后,思膚安組及阿達帕林組毛漏斗內角質物、毛囊壁及周圍組織炎細胞浸潤均較對照組減少。干預4周后,思膚安組、阿達帕林組表皮各層結構組織基本正常,分界清晰,炎性細胞浸潤更少。見圖2。

圖2 各組痤瘡大鼠背部皮損組織HE染色病理形態 (×20)

2.3各組大鼠皮損組織尼羅河紅熒光染色及脂質百分比 對照組干預2周及4周后脂質百分比均明顯低于造模第7天(P均<0.05),但干預2周后與干預4周后比較差異無統計學意義(P>0.05)。與對照組干預2周后相比,阿達帕林組脂質百分比明顯降低(P<0.05),思膚安組脂質百分比明顯升高(P<0.05)。與對照組干預4周后相比,阿達帕林組及思膚安組脂質百分比均明顯降低(P均<0.05),且阿達帕林組明顯低于思膚安組(P<0.05);思膚安組皮損脂質百分比呈現先上升后下降的趨勢,干預4周后脂質百分比與阿達帕林組干預2周后相當(P>0.05)。見圖3及圖4。

圖3 各組痤瘡大鼠背部皮損組織尼羅河染色表現(×50)

圖4 各組痤瘡大鼠背部皮損組織尼羅河染色脂質百分比

2.4各組大鼠皮損組織中IGF-1、PI3K、Akt、SREBP-1蛋白表達情況 Western blot法檢測,干預2周、4周后阿達帕林組和思膚安組皮損組織中IGF-1、PI3K、Akt、SREBP-1蛋白相對表達量均明顯低于對照組(P均<0.05),且思膚安組均明顯低于阿達帕林組(P均<0.05),見圖5。免疫組化觀察,干預2周、4周后思膚安組和阿達帕林組皮損組織中IGF-1、PI3K、Akt、SREBP-1蛋白表達均較對照組明顯減少,見圖6。

圖6 免疫組化檢測各組痤瘡大鼠皮損組織中IGF-1、PI3K、Akt、SREBP-1蛋白表達情況(×40)

3 討 論

越來越多的研究認為痤瘡是一種皮脂腺代謝性疾病,脂質代謝的紊亂貫穿了痤瘡發生發展的各個環節[7]。皮脂腺細胞可在有或無內外誘因下產生促炎介質和中性粒細胞趨化因子,而其分泌的皮脂所含有的部分游離脂肪酸又具有廣泛的抗菌活性,因此皮脂定量和定性的不同可表現出不同的促炎或抗炎特性。研究表明,皮脂成分的改變較皮脂分泌總量的升高在痤瘡的發生發展中具有更重要的作用[8]。痤瘡患者皮脂中角鯊烯水平升高,亞油酸水平降低;治療后,痤瘡患者皮脂中過氧化脂質尤其是過氧化鯊烯的含量顯著降低,而高水平的亞油酸成分可減少粉刺的發生[8]。因此,脂質組學在痤瘡發病和治療中的作用也受到了越來越多的關注。研究顯示,飲食Omega-3脂肪酸和(或)亞油酸可以輔助治療痤瘡[9-11],而膳食補充的有效成分作用于皮膚的功效是有限的,若能有藥物直接作用于皮膚、調節脂質代謝,則治療效果將會更佳。

本研究中所使用的思膚安營養修護仿生膏正是基于此理念自主研發的一款仿生護理膏,由亞麻酸、亞油酸和卵磷脂組成。亞麻酸具有有效的5α-還原酶抑制作用和抗炎作用[12],亞油酸可下調中性粒細胞的氧代謝和吞噬作用[13],卵磷脂通過減少角質層的水分損失和降低角質細胞中脂褐素的含量來維護皮膚屏障功能[14]。本實驗以阿達帕林為陽性對照,探討了思膚安對痤瘡大鼠的干預效果及可能機制,結果顯示思膚安營養修護仿生膏及阿達帕林均可促進痤瘡皮損處結節、紅腫消退,干預4周后思膚安組大鼠造模處的皮膚較阿達帕林組更光滑、凹陷性瘢痕更少,毛發更多,皮膚屏障功能修復表現更佳。在脂質調節方面,思膚安組皮損脂質百分比呈現先上升后下降的趨勢,干預 4周時思膚安組抑制脂質分泌的效果稍劣于阿達帕林組,與使用阿達帕林2周作用相當。此結果和思膚安營養修護仿生膏本身性質有關,因該制劑模擬了皮脂組分,短期使用可能會造成外來脂質的增加,而隨著其本身對脂質代謝的調節作用,繼續使用則呈現脂質下降的趨勢。此外,蛋白印跡及免疫組化結果均顯示思膚安組皮損組織中IGF-1、PI3K、Akt、SREBP-1蛋白表達顯著減少,且減少較阿達帕林組更顯著。SREBP是一種調節膽固醇和脂肪酸的主要轉錄因子,它在脂代謝的作用機制中至關重要,而IGF-1/PI3K/Akt通路是其主要的上游調控因子。因此推測思膚安營養修護仿生膏下調了IGF-1通路,隨后抑制PI3K/Akt通路,導致前體和成熟形式的SREBP-1減少,從而使得皮膚脂質中的膽固醇和脂肪酸代謝降低而起到了治療作用。雖然未能進行大鼠皮損的脂質分析,但推測思膚安營養修護仿生膏的脂質調節作用導致的游離脂肪酸如棕櫚酸、亞油酸等濃度的變化也可以導致炎癥的減輕,從而發揮治療作用。

綜上所述,思膚安營養修護仿生膏可以有效改善大鼠痤瘡皮損,且有一定的脂質調節作用,其治療痤瘡的機制可能與抑制IGF-1R/PI3K/Akt通路,從而下調SREBP-1的表達有關。

利益沖突:所有作者均聲明不存在利益沖突。