化裁消癭方抑制免疫缺陷小鼠甲狀腺癌成纖維細胞機制研究

周思聰

（福建中醫藥大學附屬第二人民醫院甲狀腺血管疝外科，福建 福州 350001）

甲狀腺癌是臨床最常見的內分泌惡性腫瘤之一，約占全部惡性腫瘤的1%。根據我國2022年衛生組織公布數據：甲狀腺癌的發病率以每年約4%的速度上升，已成為全球發病率增長最快的惡性腫瘤。對于甲狀腺乳頭狀癌，如薛立齋所云：“堅硬不可移曰石癭”早期查體時發現甲狀腺結節質硬，不能隨吞咽上下移動，推之不動，與周圍邊界不清。糾其病機，亦責之于氣、痰、瘀結聚。痰凝、血瘀、氣滯日久結于頸前，日久蘊毒乃發石癭之病。故推測甲狀腺乳頭狀癌的發病與氣、血、水運行失常相關，病灶位之肝、脾[1]。根據本病的主要臨床表現[2]，中醫將其類屬于癭瘤范疇。活血消癭方是陳如泉教授臨床治療甲狀腺腫的經驗方[3]，已有臨床研究顯示[4-5]，活血消癭方治療結節性甲狀腺腫作用優于優甲樂，具有肯定的臨床療效及安全性。

1 實驗材料與方法

1.1 藥品及試劑

1.1.1 實驗動物 BALB/C裸鼠（SPF級）60只，雌性；體質量（18±2）g。

1.1.2 試劑與儀器 主要試劑與試劑盒：RPMI 1640基本培養基（美國Gibco公司）、DMSO（德國Wcker Chemie公司）、碘125I甲狀腺球蛋白試放射免疫分析藥盒。主要儀器：震蕩器（公司：常州國華，型號：SHA-B）、CO2培養箱（公司：美國Revco，型號：300/3000）、高壓蒸汽滅菌鍋（公司：美國Zealway，型號：GI54DWS）、電冰箱（-24～8 ℃）公司：青島海爾，型號：BCD）、γ-放射免疫計數器（公司：西安二六二廠，型號：FJ-2021）、電熱恒溫水箱（公司：天津泰斯特，型號：600型）[6]。

1.1.3 動物 在相對無菌的通風清潔SPF級環境中，飼喂的6～8周齡的成年免疫缺陷鼠將成為最佳人腫瘤細胞接種鼠。根據實驗目進行皮下接種腫瘤細胞株進行造模。分組與處理：將造模完成的免疫缺陷小鼠進行篩選，剔除腫瘤過大或過小的甲狀腺癌小鼠，將篩選完的小鼠隨機平均分為4個組，分別為對照組、低劑量組、中劑量組、高劑量組，對低劑量組、中劑量組、高劑量組進行灌胃化裁消癭方溶液，其中相對應的喂養成人用量的5倍、10倍、20倍計算，分別對小鼠進行灌胃治療，每次灌胃量為0.4 mL，對照組予等體積無菌蒸餾水0.4 mL，連續灌胃14 d[7]。

1.2 方法

1.2.1 藥品制備 主要分為3個小組：將化裁消癭方（方藥組成：夏枯草12 g、柴胡9 g、半夏9 g、莪術9 g、郁金6g、白術9 g、茯苓12 g、甘草6 g）依據用量不同分3組。其中主要以6 g/kg（低劑量組）、12 g/kg（中劑量組）、24 g/kg（高劑量組），分別對小鼠進行灌胃治療[8]。

1.2.2 細胞培養

1.2.2.1 甲狀腺乳頭狀癌細胞的復蘇 ①從液氮罐里將細胞株取出，凍存管中的2/3放進37 ℃水浴鍋中，通過最大速度振蕩，令其迅速在2 min內融化[9]。②經酒精消毒過雙手后，將酒精燈點燃，拿酒精棉球擦拭培養基的瓶口，分別用酒精燈對瓶口和瓶蓋消毒，將它們分別放在酒精燈兩側。③將15 mL離心管用封口膜封口，放置離心機中，并且將離心管配平。1 000 r離心5 min。④將裝有細胞株的離心管拿出，在培養瓶的瓶身處做上實驗標記，用手指輕輕晃動使細胞分散均勻。

1.2.2.2 培養液的更換 ①首先將瓶子通過紫外線消毒大概30 min，之后放在超凈工作臺上，然后雙手進行消毒。②把瓶身保持干凈，然后再采用酒精對瓶口進行擦拭，同時瓶蓋也是需要進行消毒，具體消毒時間一般再反復打開瓶蓋5～6次以后再進行消毒。③瓶口在酒精燈上消毒2～3次。④拿出 1個5 mL的巴氏滴管，吸管進行懸空，吸取內部培養液體。然后懸空移入到培養皿中。在此過程中在把實驗試劑和相關超工作臺器材進行取出[10]。⑤培養瓶放置再37 ℃，5%二氧化碳培養液中，然后不斷地進行觀測，看自身在2～9 h后，纖維細胞生長情況。

1.2.2.3 細胞株的保存 ①消毒大概30 min以后，需要開啟全新超干凈工作臺[11]。②操作核心就是培養皿和操作臺的干凈，在此過程中需要將酒精的棉化不斷的進行放在的培養的瓶口進行慢慢的擦拭。③將培養皿中胰島素導入器皿中，在此過程中需要5 min，等細胞之間具有空洞以及各種縫隙在找合適機會進行填充。④吸取在此過程中，主要的在此基礎上2 mL主要培養的各種的在此基礎上在此過程中在反復的沖洗的過程中需要各種的15～20次，在此基礎上需要不斷進行封口以及在此基礎上需要的做的則是在離心機的平均的轉速位1 000 r離心5 min[12]。⑤需要在此將離心管中的一些廢棄倒入到缸中，在加入離心管需要加入2 mL完全培養，在用3 mL巴氏滴管輕柔吹吸30次左右使細胞分散均勻。

1.2.2.4 動物模型的制備 60只5周齡左右，所有的小白鼠的都是在實驗一周，這樣傳到0.25%胰酶消化離心，在放入到沒有血清的培養皿中其中對于該濃度為1×106個/0.1 mL，在此細胞的懸浮液，必須的操作者是無菌的進行而且必須的戴口罩，手部也是進行全方面的消消毒。每日用游標卡尺測量記錄每只小裸鼠腫瘤的長徑與寬徑，每次測量兩遍。接種后12 d，接種人甲狀腺癌裸鼠移植瘤動物隨機分為4組，分別予等體積的無菌蒸餾水、低劑量化裁消癭方溶液、中劑量化裁消癭方溶液、高劑量化裁消癭方溶液0.4 mL進行灌胃治療，每日1次，連續灌 胃14 d。

1.2.3 取材和指標檢測 對實驗8周以后的老鼠，在進行雙甲狀腺，主要在于保存，采用相關儀器給監測，結果以A-lphaEase FC軟件取值，大鼠甲狀腺細胞凋亡水平；PCNA計算指標的測定與標本的采集分別于模型制備完成后d1、d2、d4、d8、d12、d14定期測量裸鼠抑瘤率。灌胃治療結束后第1天，即接種后27 d將各組裸鼠以頸椎脫臼法處死，取出瘤體組織。

1.3 統計學方法 統計學方法采用SPSS 26.0統計軟件進行分析，計量數據采用均數±標準差（±s）進行描述。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠甲狀腺組織中PCNA的表達 對照組平均灰度值為（5 673±444），低劑量組平均灰度值為（6 236±567），中劑量組平均灰度值為（9 065± 721），高劑量組平均灰度值為（8 097±456）。由此可見，低、中、高劑量活血消癭方均可降低模型大鼠甲狀腺細胞PCNA的表達。見表1。

表1 PCNA在大鼠甲狀腺細胞中表達（±s）

表1 PCNA在大鼠甲狀腺細胞中表達（±s）

2.2 各組大鼠甲狀腺細胞凋亡水平 對照組平均灰度值為（40.76±2.24），低劑量組平均灰度值為（22.67±5.18），中劑量組平均灰度值為（22.46± 6.99），高劑量組平均灰度值為（17.15±4.59）。由此可見，低、中、高劑量活血消癭方均可促進大鼠甲狀腺細胞纖維抑制亡，并且小劑量活血消癭方作用最為顯著。見表2。

表2 各組大鼠甲狀腺凋亡細胞比例（±s）

表2 各組大鼠甲狀腺凋亡細胞比例（±s）

3 討論

化裁消癭方組成：夏枯草12 g、柴胡9 g、半夏9 g、莪術9 g、郁金6 g、白術9 g、茯苓12 g、甘草6 g進行治療，目前己發現有多種評價細胞增殖的方法，其中PCNA是最常用的指標之一[13]。在細胞核內存在可溶性與不溶性2種PCNA，可溶性PCNA在細胞周期各期中均有表達，不溶性PCNA較穩定，一般作為評價細胞增殖狀態的一個指標。

結節性甲狀腺腫的發病機制尚不清楚[14]，目前認為可能與甲狀腺細胞的增殖和凋亡失去平衡有關[15]。PCNA是目前己發現的最常用的評價細胞增殖的方法。在實驗性大鼠甲狀腺腫模型中，PCNA較正常對照組相比，表達明顯增強，在去掉致甲狀腺腫因素后，隨著甲狀腺重量的減輕，PCNA的表達也逐漸減弱，此結果與本實驗相符。