野山杏總黃酮對LPS誘導雞肝炎的影響

束佳敏,郭元印,衛丁一,劉浩然,依斯馬依力,黃 磊,何子涵,姚 剛,戴小華

(新疆農業大學動物醫學學院,烏魯木齊 830052)

0 引 言

【研究意義】野山杏(Armeniacasibirica(L.)Lam.)屬薔薇目、薔薇科李屬亞喬木植物,主要分布于新疆、山西等西部地區[1]。野山杏中含有氨基酸、多糖、黃酮類化合物等多種成分[2-4]。野山杏具有抑菌、抗病毒、抗感染、保肝、降血脂及抗氧化等作用[5-10]。通過提取分離純化野山杏總黃酮,分析其對LPS誘導雞肝炎的影響,對豐富野山杏藥效學價值并為畜禽抗炎藥物的開發有實際意義。【前人研究進展】有研究[11]采用RP-HPLC法分析了新疆野山杏果肉中的原花青素、蘆丁、柚皮苷二氫查爾酮、槲皮素等4種黃酮類化合物。谷虹霏等[12]研究表明,野山杏總黃酮可顯著延長小鼠疼痛反應痛域,減輕局部疼痛反應,具有明顯的鎮痛作用。戴小華等[13]發現野山杏總黃酮對腫脹反應和毛細血管通透性增加有顯著的抑制作用,對腫脹和滲出等局部急性炎癥有一定的抑制作用。【本研究切入點】阿依姑麗等[14]發現野山杏總黃酮可降低高血脂大鼠的血脂,減少肝臟損傷,抑制肝臟脂質過氧化過程并具有一定的劑量依賴性。需分析野山杏總黃酮對LPS誘導雞肝炎的影響。【擬解決的關鍵問題】通過LPS誘導雞肝炎模型,測定雞體溫、體重變化和血液學參數及血液生化指標,分析雞肝臟病理變化及野山杏總黃酮對雞肝炎的影響,為畜禽養殖業過程中發生的急性炎癥提供參考。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 野山杏

野山杏干燥果肉(購自新疆哈密伊吾縣天葦生物科技有限公司),LPS脂多糖(L2880,Sigma)、蘆丁(B20771,上海源葉生物科技有限公司)、吲哚美辛(R018115,羅恩試劑)、大孔吸附樹脂(D101,陜西博暉生化科技有限公司)、伊紅染液(Servicebio G1001,武漢賽維爾生物科技有限公司 )、蘇木素染液(Servicebio G1004,武漢賽維爾生物科技有限公司);黃羽肉雞購自天康生物股份有限公司。

1.1.2 主要儀器

蘭格恒流泵(BT00-300T,河北省保定蘭格);全自動血細胞分析儀(PE-6800,深圳市普康電子有限公司);尼康顯微鏡(712900,尼康儀器上海有限公司)。

1.2 方 法

1.2.1 試驗設計

90只14日齡黃羽肉雞,平均體重為(192.73±2.61) g,將90只黃羽肉雞隨機分為6組,每組15只,分別為空白對照(生理鹽水組)、模型組(LPS組5 mg/kg LPS)、陽性對照組(吲哚美辛組1 mg/kg)、野山杏總黃酮低劑量組(50 mg/kg)、野山杏總黃酮中劑量組(100 mg/kg)、野山杏總黃酮高劑量組(200 mg/kg),劑量組和陽性對照組組氣管滴注;空白對照組按照等量無菌生理鹽水腹腔注射,試驗進行7 d。

飼養條件:清潔級動物房,室溫保持在27℃至29℃,自由飲水飲食,給予標準動物飼料。各實驗組在同棟雞舍常規飼養,在雛雞入雞舍前,雞舍用福爾馬林熏蒸消毒。飼養管理按照《肉雞飼養管理手冊》執行。

1.2.2 測定指標

1.2.2.1 野山杏總黃酮

野山杏粉碎后,經超聲、離心、抽濾、旋轉蒸發得野山杏總黃酮粗提物,經D101大孔樹脂進行分離純化得野山杏總黃酮純提物,可冷凍干燥備用;以蘆丁為標準品、亞硝酸鈉溶液、硝酸鋁溶液、氫氧化鈉、60%乙醇等匯制標準曲線并測定總黃酮含量。

1.2.2.2 體溫、體重

每日觀察黃羽肉雞的精神狀態,測量體溫、體重等基本生理指標;每日上午10:00開始,以0、1、2、3、4、8、12和24 h測量每組每只雞直腸部位的體溫;稱量每組每只雞體重。

1.2.2.3 血常規參數及血液生化指標

黃羽肉雞經LPS誘導24 h后,進行翅下靜脈采血,收集血樣,采用全自動血細胞分析儀對全血中的白細胞總數(WBC)、淋巴細胞數(LYM#)、中間細胞數(MID#)、中性粒細胞數(GRAN#)、紅細胞數(RBC)、紅細胞比容(HCT%)、紅細胞平均體積(MCV)、紅細胞分布寬度SD(RDW-SD)、紅細胞分布寬度CV(RDW-CV)、血紅蛋白含量(MCH)、血紅蛋白(HGB)、血紅蛋白濃度(MCHC)等12項血常規參數進行檢測;采用ELASA試劑盒對血清中的ALT、AST兩種血液生化指標進行分析。

1.2.2.4 肝臟病理切片

LPS誘導24 h后,采集完血樣后屠宰解剖,統一選取右側肝臟制作石蠟切片,顯微鏡400倍進行觀察。

1.3 數據處理

2 結果與分析

2.1 野山杏總黃酮對LPS誘導雞肝炎體溫影響

研究表明,從1 h時開始野山杏各劑量組對LPS導致的體溫升高具有下調作用,1 h時低劑量組作用極顯著(P<0.01),2 h時低、中劑量組亦能極顯著下調體溫,3、4 h各劑量組均能極顯著下調體溫(P<0.01),8、12、24 h對體溫的改變程度不同(P<0.01,P<0.05)。圖1

注:#表示模型組與空白對照組比較,*表示實驗組與模型組比較,△表示陽性對照組與模型組比較,P<0.05表示差異顯著(單符號),P<0.01表示差異極顯著(雙符號),下同

2.2 野山杏總黃酮對LPS誘導雞肝炎體重影響

研究表明,野山杏總黃酮各劑量組對體重變化影響極顯著(P<0.01)。與模型組相比,體重變化有所提高,隨著劑量增加體重隨之增加。圖2

圖2 野山杏總黃酮下LPS誘導雞肝炎體重變化

2.3 野山杏總黃酮對LPS誘導雞肝炎血常規指標影響

研究表明,與炎癥相關的白細胞總數、淋巴細胞數、中間細胞數和中性粒細胞數均有變化。野山杏總黃酮各劑量組均可顯著或極顯著(P<0.05,P<0.01)逆轉LPS導致的炎性細胞增多,且對白細胞總數、中間細胞數的恢復存在劑量依賴性。表1

表1 野山杏總黃酮對雞血常規檢測(±SE,n=15)

Tab.1 Routine detection of total flavonoids of Apricot apricot in chicken blood

表1 野山杏總黃酮對雞血常規檢測(±SE,n=15)

指標Indicators空白對照組Blank control group模型組Model group低劑量組Low dose group 中劑量組Dose group 高劑量組High dose group陽性對照組Positive group白細胞總數Total leucocyte count (109/L)89.81±3.05114.94±1.27##86.54±1.40??83.38±2.88??81.57±1.70??83.37±2.83△△淋巴細胞數Lymphocyte count (109/L)73.08±2.6382.73±3.10##68.93±1.23??69.73±3.26??68.57±1.34??68.42±2.37△△中間細胞數Intermediate cell number (109/L)7.13±0.288.41±0.25##7.71±0.20?6.99±0.23??6.60±0.24??6.61±0.28△△粒細胞數Granulocyte count (109/L)7.50±0.3010.59±0.79##8.88±0.50?6.69±0.45??7.38±0.46??7.61±0.39△△紅細胞數Red blood cell count (1012/L)2.03±0.102.42±0.10##2.56±0.042.41±0.081.82±0.11??2.34±0.08紅細胞壓積Hematocrit (%)26.93±1.2431.53±1.73##32.08±0.4330.14±0.8423.15±1.27??29.55±1.16紅細胞平均體積Mean erythrocyte volume (fL)132.53±1.33124.79±0.84##126.18±0.77127.46±1.31130.78±1.07??126.46±1.16紅細胞分布寬度SDRed cell distribution width SD (%)41.02±0.7136.43±0.31##36.63±0.6936.54±0.6538.29±0.74?36.64±0.50紅細胞分布寬度CVRed cell distribution width CV (%)10.89±0.2110.15±0.07##10.09±0.159.97±0.1510.22±0.259.91±0.22血紅蛋白含量Hemoglobin content (pg)68.63±1.7156.73±0.50##60.56±1.0864.73±2.54??78.25±4.17??60.16±1.09血紅蛋白Hemoglobin(g/L)151.15±4.54139.64±3.33#155.14±2.52??152.86±3.20??150.79±3.19?144.45±5.85血紅蛋白濃度Hemoglobin concentration (g/L)518.31±11.00455.60±4.85##480.57±8.19504.15±9.62??604.18±29.24??474.15±7.50

2.4 野山杏總黃酮對LPS誘導雞肝炎血液生化指標影響

研究表明,野山杏總黃酮各劑量組均能降低LPS導致的ALT、AST水平升高,尤其極顯著(P<0.01)降低ALT的活性,但對AST的影響程度弱于ALT,野山杏總黃酮各劑量組對兩者的影響還存在劑量依賴性。圖3,圖4

圖3 野山杏總黃酮下LPS誘導雞肝炎ALT含量變化

圖4 野山杏總黃酮下LPS誘導雞肝炎AST含量變化

2.5 野山杏總黃酮對LPS誘導雞肝炎肝臟組織結構影響

研究表明,空白對照組肝小葉結構清晰;經LPS誘導后,雞肝臟出現損傷,模型組炎性細胞增生,巨噬細胞聚集,中央靜脈有炎性細胞浸潤,肝小葉輪廓不清晰;野山杏各劑量組對肝小葉的損傷有一定的改善作用,中央靜脈中炎性細胞浸潤減少,巨噬細胞聚集減少;尤其高劑量組改善效果較好,中央靜脈清晰可見,炎性細胞浸潤明顯減少;陽性對照組改善效果最好,肝板排列清晰,炎性細胞侵潤較少。圖5

注:A:空白對照組,B:模型組,C: 低劑量組,D: 中劑量組,E: 高劑量組,F:陽性對照組,所指為中央靜脈,↑所指為炎性細胞,△所指為巨噬細胞

3 討 論

管曉輝等[15]研究發現,多毛橐吾總黃酮可以抑制NF-κB信號途徑的活化,具有顯著的抗炎效果;周康盛等[16]報道了黃花棘豆所含的黃酮類化合物具有抗乙型肝炎病毒的生物活性;趙興輝等[17]研究表明,鐮形棘豆總黃酮可改善乙肝大鼠肝組織損傷,可抑制肝纖維化并保護肝功能;雷斯瑀等[18]發現趕黃草總黃酮對酒精性肝損傷有較好的治療作用;劉舒凌等[19]分析得出,餓螞蝗總黃酮具有抗鴨乙型病毒性肝炎作用;李曉東等[20]發現山楂葉總黃酮可減輕氧化反應導致的細胞損傷和肝組織炎癥,可防止非酒精性脂肪性肝炎的進展。LPS為細菌內毒素,可引發細菌感染、神經系統疾病、心血管病、腎功能衰竭、內毒素敗血癥等全身性炎癥性疾病[21],常被用作刺激因子調控IL-6、IL-1β等相關炎性因子的表達,構成炎癥模型[22]。LPS誘導后,動物機體的精神狀態及各項生理指標均會發生變化,如體溫升高、消瘦、食欲不振等臨床特征[23]。研究發現LPS誘導雞肝炎后,雞出現精神不振、食欲不佳等現象;結果表明,經LPS誘導后,體溫會升高,但不同時間對體溫的影響程度不同,即野山杏總黃酮能夠使體溫下調至正常體溫(0 h),可緩解LPS誘導的體溫升高。通過對比灌胃前、后的體重變化發現,腹腔注射LPS會導致雞的體重增加減慢,但野山杏各劑量組增加了炎癥條件下黃羽肉雞的體重,對炎癥造成的體重減輕有一定的緩解作用,對雞生長有一定促進作用。

血常規中白細胞相關參數可以判斷機體是否存在炎癥,紅細胞相關參數可以判斷機體是否有貧血情況[24]。有研究表明[25]血紅細胞指標的變化與肝損傷程度有關。研究結果表明,野山杏總黃酮不僅能緩解LPS誘導的炎癥,同時可緩解LPS引起的潛在貧血。

肝炎會導致血清ALT、AST含量升高,這與肝損傷的程度呈正相關,ALT、AST含量是檢測肝損傷最敏感的指標[26]。ALT升高反映肝細胞質受損,AST升高說明肝細胞結構受損。通常肝細胞受損時,ALT先釋放進入血液,當肝細胞損傷危害到線粒體時,AST也會釋放進入血液。當AST顯著高于ALT時,提示病變的慢性化和進展性[27]。野山杏總黃酮對雞肝損傷具有保護作用,其中高劑量組抑制效果最佳;野山杏總黃酮對肝組織病變有明顯的改善,使肝小葉結構基本恢復,炎性體細胞浸潤得到抑制,肝細胞形態和排列基本恢復,野山杏總黃酮能改善LPS引起的雞肝組織病理損傷,對家禽養殖過程中產生的急性炎癥有一定的緩解和改善作用。

4 結 論

野山杏總黃酮各劑量組均促進雞的生長發育,抗炎效果與吲哚美辛作用相似,LPS誘導的炎癥模型建立成功,野山杏總黃酮各劑量組均對肝炎具有良好的療效,其中劑量在100～200 mg/kg范圍內時可顯著改善肝損傷。