木瓜蛋白酶納米簇熒光探針的汞離子檢測及其在環境監測中的應用

曹 毅，許心愿，張進浩，桂心平，王寶娟，2

（1.安徽師范大學 生命科學學院，安徽 蕪湖 241000；2.安徽省重要生物資源保護與利用研究重點實驗室，安徽 蕪湖 241000）

引言

在早期工業化的發展中，我國多數河流和湖泊都曾受到汞的影響，且由于早期含汞農藥的濫用，致使我國土壤中有相當大一部分受到汞的污染。然而汞作為一種常見的、毒性強的重金屬在土壤中常以Hg2+形式存在，并在土壤微生物的共同作用下發生富集[1］，當被生物攝入體內后，會被轉化為毒性更高的甲基汞[2］，借助食物鏈進一步加重毒性，具有高度的生物富集性且進入人體后會破壞蛋白質的空間結構，對人體健康產生嚴重影響[3-4］。根據世界衛生組織規定，飲用水中的Hg2+含量不得超過29.9 μM，而中國國家飲用水標準規定Hg2+含量不得超過5.0 μM，因此對Hg2+的靈敏檢測是極其必要的。現階段常用的Hg2+檢測方法有原子吸收光譜[5］、高效液相色譜法[6］、電化學檢測[7］等，然而這些方法通常需要復雜昂貴的設備、嚴格的樣品預處理、繁瑣耗時的檢測程序，難以實現Hg2+的快速檢測。

金屬納米簇（nanoclusters，NCs）是由幾個到幾十個原子與模板分子構成的一種新型熒光納米傳感器，粒徑通常在2~3 nm左右[8］，由于其制備簡單、成本較低、操作方便、靈敏度較高等優勢，在離子檢測領域具有巨大的應用潛力，逐漸引起研究者們的重視。目前，已經成功報道的金屬納米簇包括金、銀、銅、鉑、鐵納米簇等[9-12］，除離子的種類在選擇上有所不同外，其模板也多種多樣，如氨基酸、多肽、蛋白質、DNA等。其中，以具有不同氨基酸序列和空間構象的蛋白質為模板制備的鉑納米簇因其良好的生物相容性、更高的光穩定性以及潛在的催化能力而備受研究者們青睞。例如，Xia[13］等人利用牛血清蛋白（BSA）為模板成功合成了BSA-Pt NCs，并將其用于次氯酸的檢測中，線性檢測范圍為12~240 μM；Mei[14］等人利用牛血清蛋白（BSA）作為模板成功合成了BSA-Au NCs，利用Hg2+對BSA-Au NCs的淬滅作用達到檢測目的，檢測限為1 nM，回收率在97.00%~101.89%，具有良好的檢測效果。但是，到目前為止尚未有將鉑納米簇應用于重金屬離子檢測的報道。

本文以木瓜蛋白酶（Papain）為穩定劑和還原劑，采用“生物礦化法”制備以木瓜蛋白酶為模板的鉑納米簇（Papain-Pt NCs），利用暗箱四用紫外分析儀觀察其光學性質以及紫外-可見分光光度計檢測該探針的吸收光譜。隨后探究Papain-Pt NCs作為熒光探針對不同金屬離子檢測的特異性，選取具靈敏性的金屬離子并在環境樣品中檢驗Papain-Pt NCs對該離子的實際檢測能力。

1 實驗部分

1.1 實驗試劑

木瓜蛋白酶和氫氧化鈉（NaOH）購自生工生物工程有限公司（上海）。六氯鉑酸（H2PtCl6·6H2O）購自國藥集團化學試劑有限公司（上海）。金屬離子（Mn2+、Mg2+、Na+、La2+、K+、Co2+、Cr3+、Li+、Zn2+、Hg2+、Ca2+、Bi3+、Pb2+、Ba2+、In3+、Al3+）購自國藥集團化學試劑有限公司（上海）且均為氯化物。整個實驗過程用水均為Milli-Q過濾系統（Millipore，美國）處理的超純水（18.25 MΩ·cm）。如未特殊說明，所用試劑均為分析純，且未經過進一步純化處理。

1.2 Papain-Pt NCs的制備及鑒定

Papain-Pt NCs的配制參照本課題組已有研究[15］：將Papain與H2PtCl6水溶液按摩爾比為3.5:1充分混合，加入1M NaOH 調節pH=12，充分震蕩避光反應36 h 使Pt4+與Papain 相互作用，反應結束后8，000 rpm 離心5 min，取上清在截留分子量1，000 Da透析袋中透析24 h后得到Papain-Pt NCs，置于4℃冰箱中保存備用。

隨后取200 μL Papain-Pt NCs溶液于微量石英比色皿中，在暗箱四用紫外分析儀中觀察Papain-Pt NCs的光學性質；取體積均為200 μL Papain-Pt NCs、Papain、H2PtCl6三種等濃度溶液于微量石英比色皿中，設置掃描波長范圍為200~500 nm，檢測其紫外吸收光譜。

將上述Papain-Pt NCs稀釋后，用10 μL移液槍將溶液滴于銅網中央，80 ℃烘干5 min，徹底去除銅網表面水分，利用透射電子顯微鏡（TEM）觀察Papain-Pt NCs的形貌特征。

1.3 金屬離子的選擇性與靈敏性檢測

為了評價Papain-Pt NCs對金屬離子的選擇性，使用超純水制備了16種濃度均為1 mM的金屬離子溶液。將金屬離子溶液（20 μL）、Papain-Pt NCs溶液（10 μL）和超純水（170 μL）作為標準反應體系在25 ℃下混合反應5 min，并通過熒光分光光度計RF-5301PC檢測Papain-Pt NCs在490 nm處的發射強度，分別固定激發與發射的狹縫波長在5 nm和5 nm。對于靈敏性測定，將20 μL不同濃度的特異性金屬離子溶液（0~140 μM）加入到標準反應體系中，在25 ℃下反應5 min后在相同條件下檢測Papain-Pt NCs的熒光強度。所有實驗均獨立重復3次及以上。

1.4 對實際樣品中金屬離子濃度的檢測

水樣分別來自長江（蕪湖市濱江公園段）、蕪湖市鏡湖、安徽師范大學（中校區）自來水，土樣來自蕪湖市赭山、葡萄園。長江水、鏡湖水、自來水、赭山土、葡萄園土取樣后過濾得上清液，將上清液經8，000 rpm離心5 min，再通過0.45 mm 膜濾器處理后供實驗使用。長江水、自來水及鏡湖水樣品濾液樣品稀釋50 倍后用于金屬離子濃度的檢測，赭山土和葡萄園土濾液樣品稀釋200倍后用于金屬離子濃度的檢測。隨后在標準反應體系中，將Papain-Pt NCs 溶液、經過預處理后的水樣（或土樣）與特異性金屬離子溶液（濃度分別為20、40 和100 μM）混合，在25℃下孵育5 min 后使用熒光分光光度計記錄490 nm 處混合溶液的熒光強度并計算加標回收率。

2 結果和討論

2.1 Papain-Pt NCs的鑒定

利用紫外-可見分光光度計研究Papain-Pt NCs、Papain 以及H2PtCl6的光譜性質。Papain-Pt NCs 在300～350 nm 范圍內具有較寬的吸收光譜，而Papain 和H2PtCl6在這個范圍內沒有明顯的吸收帶（圖1 A）；合成的Papain-Pt NCs溶液在可見光下呈現淡黃色，在365 nm紫外燈下呈現顯著的綠色熒光（圖1 B）。該實驗結果證實，我們成功合成了具有綠色熒光發射的Papain-Pt NCs新型納米熒光探針。進一步利用透射電子顯微鏡對Papain-Pt NCs的表面形貌進行分析，結果顯示，Papain-Pt NCs粒子呈球形，且分布均勻。

2.2 金屬離子的選擇性檢測

Hg2+在環境中的殘留嚴重影響了人類的身體健康，因此對環境中Hg2+含量的測定至關重要。為了評價Papain-Pt NCs對Hg2+的檢測性能，測定了Papain-Pt NCs與16種濃度均為1 mM金屬離子混合后的熒光強度（圖2）。值得注意的是，Papain-Pt NCs的熒光強度僅在Hg2+存在的情況被明顯淬滅，淬滅程度為84%，而其余金屬離子僅淬滅2%～11%。

圖2 (A)不同金屬離子與Papain-Pt NCs混合時的相對熒光強度（I/I0，其中I與I0分別為金屬離子存在和不存在下的熒光強度）；(B)365 nm紫外光照射下的不同金屬離子與Papain-Pt NCs混合溶液Fig.2 (A)Relative fluorescence intensity(I/I0)of Papain-Pt NCs when excited at 380 nm with various metal ions(I/I0，where I and I0 are the fluorescence intensity of Papain-Pt NCs in the presence and absence of various metal ions，respectively)；(B)Photographic image of Papain-Pt NCs solution upon the addition of various metal ions under UV light illumination at 365 nm

金屬納米簇的穩定發光結構依賴于金屬核與蛋白模板之間的共價鍵或是分子間作用力，基于彼此間的相互作用形成較穩定的發光結構，蛋白模板在這個過程的作用類似于自然界中的生物礦化作用[16］。因此，Hg2+對本金屬納米簇的淬滅效應，有以下兩個可能的推測：一是Hg2+與金屬鎳之間的親金屬相互作用，競爭Papain-Pt NCs中的金屬核，導致熒光淬滅；二是Hg2+與木瓜蛋白酶巰基等負電基團之間的相互作用，破壞了模板與金屬核之間穩定的發光結構，這種強烈的刻蝕作用致使熒光淬滅[14-15］。

2.3 Hg2+的靈敏性檢測

當一系列濃度的Hg2+與Papain-Pt NCs混合，其熒光強度呈濃度依賴性減弱（圖3 A，圖3 B），在5～100 μM的濃度范圍內加入Hg2+，線性回歸方程為y=4.52×10-3x+1.00482(R2=0.9919)（圖3 C）。根據3σ/S原則，計算得其檢測限為2.7 μM，其中σ表示空白信號的標準偏差，S是線性擬合曲線的斜率。

圖3 (A)365 nm紫外光下不同濃度的Hg2+（0~140 μM）與Papain-Pt NCs的混合溶液；(B)Papain-Pt NCs與不同濃度的Hg2+（0～140 μM）混合后熒光強度；(C)不同濃度的Hg2+（5～100 μM）與混合后相對熒光強度（I0/I）之間的線性關系（其中I0為不加Hg2+的熒光強度，I為加不同濃度Hg2+的熒光強度）Fig.3 (A)Photographic image of Papain-Pt NCs solution upon the addition of Hg2+with a certain concentration gradient(from top to bottom:0～140 μM)under UV light illumination at 365 nm.(B)Fluorescence spectra of Papain-Pt NCs with various concentrations of Hg2+(from 0 to 140 μM)；(C)The linear relationship between I0/I and different concentrations of Hg2+(from 5 to 100 μM)

國家規定飲用水中的Hg2+含量不得超過5.0 μM，因此在復雜背景中實現Hg2+的靈敏性檢測至關重要。比較不同熒光法對Hg2+濃度的檢測（表1），相較于SBA-Pr-IS、RMTE，本研究的檢測限與之接近甚至更低，因此可實現對Hg2+的靈敏性檢測。相較于NSCD、N and S co-doped C-dots、TA-GNPs、Coumarin-boronic，盡管上述方法所提供的檢測限更低，但是本研究提供的熒光納米探針線性檢測范圍更寬，其應用前景更廣闊。在實物檢測方面，七種方法的回收率并無明顯區別，在實際檢測中都具備較高的可信度。因此，本方案提供了一種檢測限低且檢測范圍更寬的生物傳感器，具有較高的實際應用價值。

表1 不同熒光方法對Hg2+濃度的線性檢測范圍及其檢測限比較Table 1 Comparison of linear detection ranges and detection limits of Hg2+concentrations by different fluorescence methods

2.4 環境樣品中Hg2+濃度的檢測

在實際環境樣品（例如水體、土樣）中對Hg2+濃度的靈敏性檢測十分必要，為了驗證Papain-Pt NCs 作為熒光探針對實際環境樣品中Hg2+濃度檢測方法的可行性，通過加標回收法測定水樣和土樣中的Hg2+濃度。3 種濃度的Hg2+溶液（20、40 和100 μM）分別加入到經預處理后的土樣、水樣中，檢測并記錄對應的熒光強度，根據相對熒光強度與Hg2+濃度的線性回歸方程計算加標回收率。結果如表2所示，在水樣和土樣中檢測的加標回收率變化在可接受的良好范圍內，為95.82%~109.20%。本研究為在復雜環境中檢測Hg2+提供了一種簡單的分析替代方案，具有較好的準確性和精確度。

表2 實際樣品中Hg2+濃度的檢測Table 2 Detection of Hg2+concentration in actual samples

3 結論

綜上所述，我們開發了一種以Papain-Pt NCs為基礎的Hg2+熒光檢測方法，利用其熒光特性實現了對Hg2+的特異性及靈敏性檢測。Papain-Pt NCs在365 nm紫外燈下可發出綠色熒光，在300~350 nm范圍內具有較寬的吸收光譜。基于Hg2+對Papain-Pt NCs熒光的淬滅響應，本研究發現該熒光傳感器具有優異的靈敏性，檢測范圍在5~100 μM，檢測限為2.7 μM。此外，該生物傳感器驗證了在長江水、鏡湖水、自來水、赭山土、葡萄園土中檢測Hg2+的可行性，回收率為95.82%~109.20%，實現了鉑納米簇在實際環境中對重金屬離子濃度的檢測，拓寬了鉑納米簇的應用領域，為復雜環境樣品中的Hg2+濃度檢測提供了一種新方案。