CI-LLME萃取技術在果蔬多種殺菌劑殘留分析中的應用

王丹 李琳 聶丹丹 王守彬

摘 要：目的：建立CI-LLME-超高效液相色譜-串聯質譜法檢測果蔬中8種殺菌劑殘留量的方法。方法：使用冷凍誘導液液微萃取前處理技術結合三重四極桿分析技術檢測果蔬產品中8種殺菌劑的殘留量。結果：在給定的濃度范圍內8種殺菌劑存在良好的線性關系（R2＞0.990）；方法檢出限為0.04～1.83 μg·kg-1，定量限為0.12～5.49 μg·kg-1。10.0 μg·L-1、20.0 μg·L-1、100.0 μg·L-1添加水平的回收率為81.5%～117.1%，精密度（RSD）為0.05%～6.12%，重復性實驗標準偏差為0.045～0.887，RSD為0.47%～9.47%，均符合國家標準要求。結論：該前處理技術具備一步式樣品前處理能力，簡單快速、成本較低，靈敏度高且重現性好，因此該技術可用于檢測果蔬中多種微量殺菌劑的含量。

關鍵詞：殺菌劑；果蔬；冷凍誘導液液微萃取；超高效液相色譜-串聯質譜法

Abstract： Objective： To create a method for detecting the residues of eight fungicides in fruits and vegetables using CI-LLME-ultra high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry. Method： The residue of eight fungicides in fruit and vegetable products was detected using liquid-liquid freeze-induced liquid-liquid microextraction pre-treatment technology combined with triple quadrupole analysis technology. Result： Good linear relationships （R2＞0.990） were observed for the eight fungicides in the given concentration ranges; the limits of detection of the method were in the range of 0.04～1.83 μg·kg-1， and the limits of quantification of the method were in the range of 0.12～5.49 μg·kg-1. The recoveries were in the range of 81.5%～117.1% at the spiked levels of?10.0 μg·L-1， 20.0 μg·L-1， 100.0 μg·L-1 and precision of the method was in the range of 81.5%～117.1%， the precision （RSD） was 0.05%～6.12%， and the standard deviation of repeatability experiment was 0.045～0.887 with the RSD of 0.47%～9.47%. Conclusion： This pre-treatment technology has the capability of one-step sample pretreatment， which is simple， fast， cost-effective， sensitive， and reproducible. Therefore， this technology can be used to detect the content of various trace fungicides in fruits and vegetables.

Keywords： fungicides; fruits and vegetables; liquid liquid freezing induced microextraction; ultra high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry

隨著生活水平的提高，人們對農產品的質量安全以及農產品中農藥的使用越來越關注。因此，加強農藥殘留分析方法的研究至關重要，目前在檢測殺菌劑殘留量前，通常會采用分散固相萃取方法對樣品進行處理。分散固相萃取方法是在水和乙腈溶液中加入無水硫酸鎂等物質，實現乙腈層的分離[1-3]。

研究顯示，利用水和有機溶液進行冷凍誘導液液微萃取（Cryoinduced Liquid-Liquid Microextraction，CI-LLME），能夠減少鹽的使用量，從而降低可能引入的雜質，在多種食品基質中得到了應用[4-6]。本研究優化了CI-LLME檢測方法，使該方法可以快速準確地檢測果蔬中的殺菌劑。

1 材料與方法

1.1 儀器與設備

Aglient 1290-6460超高效液相-三重四極桿分析儀、Aglient RRHD Eclipse plus C18分析柱，安捷倫公司。

1.2 材料與試劑

水果和蔬菜樣品為市場銷售產品。

液質專用乙腈、甲酸（賽默飛）；無水硫酸鎂、C18、PSA粉末（Aglient）；屈臣氏蒸餾水；8種殺菌劑標準品（100 μg·mL-1，農業農村部環境保護科研監測所）。

1.3 方法

1.3.1 標準系列溶液配制

分別量取一定量的殺菌劑標準溶液（100 μg·mL-1），用乙腈溶液稀釋10倍后，搖勻制成混合標準品儲備液（10 μg·mL-1）。再取不同量的混合標準儲備液，用初始流動相配制成濃度為0.5 ng·mL-1、1.0 ng·mL-1、5.0 ng·mL-1、10.0 ng·mL-1、20.0 ng·mL-1、40.0 ng·mL-1、80.0 ng·mL-1和100.0 ng·mL-1的標準系列溶液。

1.3.2 樣品制備

準確稱量5 g水果、蔬菜樣品，放入50 mL BD管中，加入乙腈溶液10 mL旋渦，混合6 min，加入4 g無水硫酸鎂和1 g氯化鈉混合5 min，以8 000 r·min-1冷凍離心4 min，取1.5 mL上清液，加入裝有250 mg無水硫酸鈉、50 mg PSA、25 mg C18粉的混合凈化劑中，混勻40 s，以8 000 r·min-1冷凍離心4 min，取1.0 mL上清液加入5 mL BD管中，加入1.5 mL純水混勻，進行冷凍誘導液液微萃取、純化，-80 ?C冷凍6 min，提取上層有機相，以8 000 r·min-1冷凍離心4 min后，過0.22 μm濾膜上機。

1.4 儀器分析條件

（1）液相色譜條件。流動相：A為0.05%甲酸水溶液，B為乙腈；洗脫梯度：80%A，0～0.01 min；70%A，0.01～3.00 min；15%A，3～5 min；70%A，5.0～7.5 min；10%A，7.5～10.0 min；80%A，10～15 min；柱溫：40 ℃；流速：0.2 mL·min-1；進樣方式：自動進樣；進樣體積：5 μL。

（2）質譜條件。掃描方式：正離子掃描；離子源：ESI；檢測方式：多反應監測；霧化器壓力：30 psi；鞘氣溫度：300 ℃；流速：11 L·min-1；毛細管電壓：4 000 V；噴嘴電壓：250 V。8種殺菌劑的相關參數見表1。

2 結果與分析

2.1 方法線性、檢出限和定量限

按照1.4儀器條件測定1.3.1配制的標準系列溶液，以濃度為橫坐標、峰面積為縱坐標繪制標準曲線，8種殺菌劑標準曲線線性相關系數見表2。線性回歸方程的相關系數為0.993 1～0.999 0，表明冷凍誘導液液微萃取技術聯合液相三重四極桿分析儀檢測8種殺菌劑能夠獲得良好的線性表現。以3倍信噪比計算得到檢出限為0.04～1.83 μg·kg-1，以10倍信噪比得出定量限為0.12～5.49 μg·kg-1，符合國標要求。

2.2 加標回收率

在空白樣品中分別加入1.0 μg·L-1、20.0 μg·L-1、100.0 μg·L-1 3種濃度標準物質，3次進樣測定。圖1展示了8種殺菌劑TIC圖，加標回收率結果見表3。樣品加標回收率在81.5%～117.1%，相對標準偏差（RSD）在0.05%～6.12%。

2.3 樣品重復性實驗

對已知濃度的樣品進行6次連續進樣檢測，結果見表4。標準偏差在0.045～0.887，相對標準偏差（RSD）在0.47%～9.47%，均符合國標要求。

3 結論

冷凍誘導液液微萃取前處理技術結合UPLC-MS/MS分析技術檢測果蔬中8種殺菌劑線性關系良好，檢出限和定量限均符合國標要求，且方法重現性令人滿意。冷凍誘導液液微萃取前處理技術快速、高效，易操作，節約了試劑和時間成本。冷凍誘導液液微萃取前處理技術結合UPLC-MS/MS分析技術能夠實現樣品提取、富集和凈化一步式處理，適用于果蔬中多種殺菌劑的檢測。

參考文獻

[1]呂冰，尹帥星，陳達煒，等.QuEChERS-四極桿/靜電場軌道阱高分辨質譜測定動物性食品中氟蟲腈及其代謝物殘留[J].分析測試學報，2017，36（12）：1424-1430.

[2]ZHANG C Y，DENG Y C，ZHENG J F，et al.The application of the QuEChERS methodology in the determination of antibiotics in food ： a review[J].Trends in Analytical Chemistry，2019，118：517-537.

[3]PERESTRELO R，SILVA P，PORTO-FIGUEIRA P，et al.QuEChERS-Fundamentals， relevant improvements， applications and future trends[J].Analytica Chimica Acta，2019，1070：1-28.

[4]LI S H，CHEN D W，LV B.et al.Enhanced sensitivity and effective cleanup strategy for analysis of neonicotinoids in complex dietary samples and the application in the total diet study[J].Journal of Agricultural and Food Chemistry，2019，67（9）：2732-2740.

[5]CHUNG S W C，LAM C H.Development of a 15-classes multiresidue method for analyzing 78 hydrophilic and hydrophobic veterinary drugs in milk， egg and meat by liquid chromatography-tandem mass spec-trometry[J].Analytical Methods，2015，7（16）：6764-6776.

[6]WANG F Q，LI S H，FENG H，et al.An enhanced sensitivity and clean-up strategy for the nontargeted screening and targeted determina- tion of pesticides in tea using modified dispersive solid-phase ex-traction and cold-induced acetonitrile aqueous two-phase sys-tems coupled with liquid chromatography-high resolution mass spectrometry[J].Food Chemistry，2019，275：530-538.