基于網絡藥理學與分子對接技術探討三七治療糖尿病足的作用機制※

利德爾 孫官文 包呼和 郭家幸 倪熙宇

糖尿病足（Diabetic Foot，DF）是糖尿病（Diabetes Mellitus，DM）患者最常見的下肢微血管并發癥[1]。DF的形成主要歸因于DM 相關的慢性炎癥、周圍神經病變、遠端動脈血管內皮細胞的損傷等多種原因[2]。當前DF的治療方案眾多，其中Ilizarov技術[3-4]、持續封閉式負壓引流技術[5]治療，能改善踝肱指數，加速創面愈合。但是運用Ilizarov 技術時患者需要忍受長期佩戴外固定架引起的慢性疼痛；而負壓引流技術面對慢性感染性創面時存在需要多次更換的弊端。因此，臨床迫切需要探索出新的藥物以輔助Ilizarov 技術或持續封閉式負壓引流技術加速創面愈合，而選擇中醫藥治療DF在我國具有明顯的優勢。

中藥三七具有止血散瘀、消腫定痛的功效，現代藥理研究發現三七在抗腫瘤[6]、抗炎[7]、免疫調節[8]、神經保護[9]、降糖[10]等方面具有廣泛作用，同時具有治療DF的作用。三七皂苷類被認為是三七的主要活性成分之一，但由于三七的活性成分復雜，通過傳統試驗方法闡明其治療疾病的作用存在困難且費用巨大，因此有必要使用新的方法解釋三七的主要活性成分與分子作用機制之間的聯系?；诖耍P者采用網絡藥理學與分子對接技術探討三七治療DF 的作用機制，并探究其治療DF的活性物質、靶點的應用價值。

1 材料與方法

1.1 三七化學成分收集與靶點篩選利用TCMSP（https：//tcmsp-e.com/）、TCMID（https：//ngdc.cncb.ac.cn/）中藥系統藥理學平臺檢索“三七”，并根據ADME［即藥物代謝動力學，指機體對外源化學物的吸收（absorption）、分布（distribution）、代謝（metabolism）及排泄（excretion）過程］參數設口服利用度（Oral Bioavailability，OB）預 測 值＞30%、類 藥 性 預 測 值（Drug-Likeness，DL）＞0.18，之后運用UniProt 蛋白數據庫（https：//www.uniprot.org/）標化三七所有有效成分相對應的靶點，去重并刪除無效靶點后獲得藥物作用靶點，之后在Pubchem（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov）數據庫中檢索活性成分分子式，并運用Cytoscape 3.8.0（http：//www.cytoscape.org/）軟件將藥物-活性成分-靶點相關數據優化生成可視化的關系網絡圖。

1.2 DF 靶點篩選在DisGeNET 數據庫（https：//www.disgenet.org/home/）及OMIM（https：//omim.org/）中檢索“diabetic foot”并對搜集到的靶點進行整合去重，獲得DF 疾病相關治療靶點，之后利用Venny 2.1.0（https：//bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/）交集三七靶點與DF靶點獲得共同靶點。

1.3 蛋白互作網絡構建將共同靶點導入STRING數據庫（https：//string-db.org/）并限定種屬為人種，置信度為0.4，其他設置為默認，并轉化靶點為蛋白質，獲得共同靶點蛋白質互作網絡關系圖（Protein-Protein Interaction Networks，PPI），后下載tsv格式的上述網絡數據導入Cytoscape 計算Degree 值來篩選排序核心基因并優化PPI網絡。

1.4 GO功能富集分析與KEGG信號通路分析將共同靶點導入DAVID 平臺（https：//david.ncifcrf.gov/tools.jsp），設置P-value＜0.05，并限定種屬為Human，進行GO功能富集分析及京都基因和基因組百科全書（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）信號通路分析，并評估分析結果。之后，利用R 語言4.1.2（https：//www.r-project.org/）分類歸納生物過程（Biological Process，BP）、細 胞 組 分（Cellular Component，CC）、分子功能（Molecular Function，MF）的GO功能分析柱狀圖，并重點分析BP；運用KEGG平臺（https：//www.kegg.jp/）進行信號通路分析，并進行歸類后將數據導入Cytoscape 進行分析，生成靶點-信號通路網絡圖。后將共同靶點參與的主要信號通路進行評估并加以注釋，生成三七治療DF 的主要信號通路圖。

1.5 分子對接實驗從Pubchem數據庫下載篩選獲得的三七活性成分mol 2 格式的3D 分子結構，運用PyMOL軟件去除活性成分的水和殘基，并設置為最低結合能的空間結構。在UniProt 數據庫（https：//www.uniprot.org/）中獲取共同靶點基因對應的人體蛋白UniProt ID，并 使 用UniProt ID 從PDB 蛋 白 數 據 庫（https：//www.rcsb.org/）中下載共同靶點3D結構，運用AutoDock 1.5.6去除蛋白水和殘基以及無效金屬離子并加氫，后根據配體活性口袋設置Grid Box，運用vina 4.2 對接三七活性成分與共同靶點靶蛋白，并計算出最低結合能及結合方式后評估對接結果。將獲得的核心化合物導入PyMOL 及Discovery Studio 2019 軟件進行可視化并形成2D及3D對接圖。

2 結果

2.1 三七藥物活性成分篩選結果利用TCMSP 中藥系統藥理學平臺、TCMID 平臺檢索“三七”，提重及刪除無效靶點后獲得119種活性成分。根據OB及DL預測值篩選獲得7 個最主要的三七主要活性成分及相對應的174 個靶點。其中OB 為生物口服利用度，表示經過首關效應后評價藥物吸收利用度的指標；DL為類藥性，表示其分子結構與現存藥物的類似性。在運用UniProt 蛋白數據庫標化并注釋上述所有靶點的UniProt ID 后，在Pubchem 數據庫獲得mol 2 格式的上述7 個活性成分的3D 結構及分子式并注釋。結果顯示槲皮素（Quercetin）、豆甾醇（Stigmasterol）、鄰苯二甲酸二異鋅酯（Diop）、甘露醇（Mandenol）具有較高的口服利用度，而豆甾醇（Stigmasterol）、谷甾醇（Betasitosterol）、人參皂苷rh2（Ginsenoside rh2）具有較高的類藥性。見表1。

表1 三七主要活性成分基本信息

2.2 DF靶點獲取及藥物-疾病靶點交集在DisGeNET 數據庫及OMIM 數據庫中檢索“diabetic foot”，并對搜集到的靶點進行整合剔重，獲得DF疾病治療靶點789 個。之后利用Venny 2.1 交集174 個三七活性成分靶點與789 個DF 靶點，共獲得20 個共同靶點。見圖1。

圖1 三七與糖尿病足的藥物-疾病靶點Venny交集圖

2.3 藥物-活性成分-靶點拓撲網絡將三七-活性成分-靶點相關數據輸入Cytoscape 進行可視化處理后獲得藥物-活性成分-靶點拓撲網絡圖。三七的7個主要活性物質對應相關174個靶點，體現了中藥成分對應多靶點的特點。三角形代表三七，菱形代表三七的活性成分，圓形代表活性成分相關靶點。可見Quercetin 節點數最多，其次是Beta-sitosterol、Stigmasterol、Ginsenoside Rh2，由此可見其在三七中可能充當著較為重要的藥理學角色。見圖2。

圖2 三七-活性成分-靶點拓撲網絡圖

2.4 蛋白互作網絡（PPI）構建運用STRING 數據庫對交集獲得的20個共同靶點進行PPI分析，可見不同基因之間的相互作用?；蛑g功能關聯表達分別用淺藍色、綠色、紅色、紫色、黑色、灰色實線標識為輔助數據庫證據、基因相近、基因融合、實驗證明、基因共表達、蛋白質同源等關系。另外兩個節點之間線條越密集，表示基因之間關聯性越強，在網絡中起到的作用越高。把PPI 數據以tsv 格式下載后導入Cytoscape，運用Network analyzer 插件計算Degree 值，發現PPARG、TP53、AKT1 的值最高，其次是MYC、ESR1、PTEN、IGF2、MMP1，后經重新可視化處理，節點大小及顏色的深淺根據Degree值大小進行排序，可見上述基因之間相互作用密切關聯。見圖3。

圖3 三七治療糖尿病足的蛋白互作網絡PPI圖

2.5 GO 功能富集分析利用DAVID 平臺進行GO功能富集分析發現，P-value＜0.05的條目共有189個，歸類分析上述條目發現分子功能（MF）主要有蛋白結合、酶結合、轉錄因子活性，特異性序列DNA 結合、RNA 聚合酶II核心啟動子近端區序列特異性DNA 結合，細胞組分（CC）主要位于核質、胞漿、細胞質等。對主要參與的生物過程（BP）進行重新歸納整理，發現主要集中于細胞增殖調控、炎癥反應、氧化應激反應三類。其中BP歸類于細胞增殖調控的有細胞增殖的正調控、細胞周期阻滯、對生長因子的反應、干細胞分化、細胞對神經生長因子刺激的反應、神經元死亡的正調控、表皮生長因子刺激的細胞反應、成纖維細胞增殖的正調控、脂肪細胞分化的正調控。BP 歸類于炎癥反應過程的有細胞因子介導的信號通路、對脂多糖的反應、I-κB激酶/NF-κB信號的正調控、巨噬細胞分化、腫瘤壞死因子介導的信號通路調控。BP 歸類于氧化應激反應過程的有細胞對缺氧的反應、一氧化氮生物合成過程的正調控、細胞對外源刺激的反應、缺血反應、對氧化應激的反應、一氧化氮合酶活性的正調控、細胞對活性氧的反應等。運用R 語言繪制GO柱狀圖，可見三七治療DF主要可能是通過參與細胞增殖調控、炎癥反應、氧化應激反應等生物過程而起到治療作用。見圖4。

圖4 三七治療糖尿病足靶基因集的GO_BP分析圖

2.6 KEGG信號通路富集分析運用KEGG平臺進一步對共同靶點進行通路富集分析，共發現170個相關通路。結果顯示三七治療DF的作用機制可能與多種信號通路相關，如癌癥相關通路、PI3K-AKT信號通路、MAPK 信號通路、甲狀腺激素信號通路、IL-17 信號通路、鞘脂類信號通路、松弛素信號通路、P53 信號通路、C 型凝集素受體信號通路、T 細胞受體信號通路、Ras 信號通路、JAK-STAT 信號通路、FoxO 信號通路、TNF 信號通路、Toll 樣受體信號通路、mTOR 信號通路等。對KEGG 結果進一步篩選DF 相關信號通路，最終保留了37 個通路及對應的13 個共同靶點。隨后基于Cytoscape 建立共同靶點-信號通路網絡，發現共同靶點主要集中參與的通路為PI3K-AKT 信號通路，其次是MAPK 信號通路、IL-17 信號通路，而三七治療DF 起主要作用的共同靶點是AKT1、CHUK、MYC。最后修飾上述信號通路數據獲得最終的信號通路作用圖，可見這些通路之間存在著復雜的相互作用關系，也間接驗證了三七治療DF 是通過多種有效成分-多靶點-多通路模式產生的生物學作用。見圖5、圖6。

圖5 三七治療糖尿病足的靶點-信號通路網絡圖

圖6 三七治療糖尿病足的主要信號通路圖

2.7 分子對接結果首先把三七活性成分視為配體，把共同靶點編碼的蛋白視為受體，后從藥物-活性成分-靶點拓撲網絡中選出共同靶點相對應的配體進行AutoDock Vina 對接，并計算每個復合體的結合能及結合方式，并取最低結合能進行分析。通常，結合能＜-8 kcal/mol 表示受體與配體自由結合能力強；結合能＜-5.5 kcal/mol表示自由結合能力較強；結合能＜4.25 kcal/mol 表示結合能力一般。結果顯示，MMP1與Quercetin，AR 與DFV，PPARG 與Quercetin，CASP8與Beta-sitosterol，ESR1與Quercetin的結合能力強，其余對接的結合能力均顯示較強。其中Quercetin 與MMP1 蛋白A 鏈第180、181、182 號位點的ASN、LEU、ALA以及第219號位點GLU以氫鍵對接，還與PPARG蛋白D 鏈第259、271、285、342 號位點的GLU、GLN、CYS、SER 以氫鍵對接，此外還與ESR1 蛋白A 鏈第353、387、394、521 號位點的GLU、LEU、ARG、GLY 以氫鍵對接。DFV 與AR 蛋白A 鏈第701、705、711、752號位點的LEU、ASN、GLN、ARG 以氫鍵對接。研究表明三七活性成分與靶點可能通過上述結合模式進行結合，從而起到治療DF的作用。見表2、圖7。

圖7 三七主要活性成分與靶點蛋白分子對接模式圖

表2 三七主要活性成分與靶點蛋白分子對接結果

3 討論

本研究應用網絡藥理學方法與分子對接技術，預測了三七治療DF的可能分子機制。富集分析結果提示三七的潛在作用機制可能涉及細胞增殖調控、炎癥反應、氧化應激反應等多種密切相關的生物學過程。研究顯示，AKT1、CHUK、MYC 可能是參與三七治療DF 的主要靶點，并通過PI3K-AKT 信號通路、MAPK信號通路、IL-17 信號通路進行參與。另外分子對接結果顯示配體與受體結合穩定，并提示槲皮素有可能是三七治療DF的主要活性成分。

3.1 三七藥理學分析本研究篩選獲得7 個主要的三七活性成分，后繪制三七-活性成分-靶點拓撲網絡發現槲皮素、谷甾醇、豆甾醇、人參皂苷rh2 的節點數最多，故可認為其為三七治療DF 的主要活性成分。據研究發現，上述化合物具有廣泛的藥理學作用，如Jayachandran M 等[11-12]發現糖尿病大鼠脂質過氧化物水平升高，而在異槲皮素處理后，脂質過氧化物水平顯著降低。此外，槲皮素還可以通過調節巨噬細胞從M1表型向M2表型的極化轉換，從而抑制炎癥反應[13]。研究顯示，谷甾醇與豆甾醇同樣具有抗炎作用[14]；人參皂苷rh2 則可通過STAT3-miRNA 214 產生抗炎及免疫調節作用[15]。這可能為三七治療DF 慢性炎癥提供有利的依據。此外，相關研究發現槲皮素還可通過促進自噬以減輕高糖誘導的人臍靜脈內皮細胞損傷，且可減輕氧化應激反應[16-17]，這為其治療DF創面愈合提供了可靠依據。

在篩選出的三七主要活性成分中，槲皮素節點數目顯著多于其他活性成分，可能與槲皮素類現象有關。究其原因，首先考慮到本研究以單味藥物為研究對象，其次相關研究表明槲皮素的確在治療DF 時存在藥理學活性，且槲皮素廣泛存在于各種植物。

3.2 關鍵靶點及通路作用通過交集三七活性成分靶點與DF 疾病治療靶點獲得20個共同靶點，在此基礎上通過篩選DF 相關KEGG 信號通路，最終獲得37個通路和13個靶點，最后選取靶點-信號通路網絡節點數排前三位的AKT1、CHUK、MYC。

AKT 已被證明是參與調控細胞增殖、細胞凋亡、細胞遷移及葡萄糖代謝的ACG家族的絲氨酸/蘇氨酸激酶?，F認為AKT1 是較為成熟的治療DF 的重要靶點，相關研究發現，AKT1 可通過下游的mTOR/eNOS調節血管內皮細胞增殖[18-19]、成纖維細胞增殖[20]、餐后血糖水平[21]，同時可以通過其下游的IKK/NF-κB通路減少炎癥因子的釋放[22]。此外還可以通過PI3K/AKT減輕胰島β細胞的凋亡[23]，經AKT/GSK3β可以促進胰島β 細胞的再生[24]，GSK3 進一步通過下游的MYC 調節細胞增殖、遷移進而收斂創面[25]。AKT/MAPK 同樣在細胞增殖、炎癥方面發揮著重要作用[26]。此外，在KEGG信號通路分析中發現JAK-STAT信號通路、Toll樣受體信號通路主要集中于PI3K-AKT 的上游，可能是三七治療DF的生物學關鍵的起始部分。

CHUK 是一種保守的螺旋-環-螺旋激酶（Conserved helix-loop-helix ubiquitous kinase），也稱激酶α亞單位抑制劑（IKKα/IKKA）或IKK1，是一種在NFκB通路起到重要作用的絲氨酸/蘇氨酸激酶[27]。在經典NFκB 通路中，正常條件下NFκB 與IκB 結合并失活，當受到外部刺激后，IκB磷酸化并解離NFκB被激活；在非經典通路中，在外部刺激下磷酸化的IKKα與NIK（NF-κB 誘導激酶）結合，進而激活NF-κB 通路[28-29]。研究發現，NF-κB通路主要在細胞炎癥、生長凋亡等生物學過程中起到重要作用，這與本研究結果相一致，側面印證了三七治療DF的有效性。

最后，MYC 是最早發現于癌癥的基因，包括Cmyc、N-myc、L-myc、R-myc，具有促進細胞增殖、分化、轉化的多種生物學作用[30]。例如，Zhang J發現DF中C-myc 通過Wnt/β-catenin 途徑提高表達量，進而促進人類永生化細胞（Human Keratinocytes Cell，Ha-CaT）增殖并抑制其遷移和分化，而敲除C-myc則可以促進分化進而促進糖尿病足創面的愈合[31-32]。因此AKT1、CHUK、MYC可能是三七治療DF的潛在靶點。

4 結語

本研究采用網絡藥理學方法，探討三七的有效成分及其治療DF 的潛在機制。三七治療DF 的作用機制可能與細胞增殖調控、炎癥反應、氧化應激反應三個主要的生物學過程密切相關。筆者就參與這些生物過程的PI3K-AKT 信號通路、MAPK 信號通路、IL-17信號通路中確定了AKT1、CHUK、MYC三個重要的治療靶點。此外進行分子對接結合能表示三七活性成分與靶點的結合穩定，為三七治療DF 的治療靶點研究提供了新的線索。