溫針灸對膝骨關節炎大鼠IL-1β、ADAMTS-7、MMP-3表達的影響※

李益軍 梁興森 方細霞 肖文良 陳璟昆 謝美玲 王華軍 高彥平 李 嘉 李 玲▲

膝骨關節炎（knee osteoarthritis，KOA）是一種以關節軟骨退變、軟骨下骨重塑、骨贅形成、滑膜炎癥反應和血管生成為特征的慢性退行性疾病[1-2]。流行病學調查表明，全球195 個國家中約有30310.68 萬人患有髖、膝關節骨關節炎，同時KOA 也對社會經濟造成了巨大的負擔，美國每年膝關節炎患者的醫療消耗約為8000萬美元[3]。在我國，KOA的發病率也常年居高不下，60 歲以上人群患病率可達50%，75 歲以上人群則達80%[4]。對于骨關節炎晚期的患者只能行全膝關節置換手術，但有10%～20%的患者在手術后因疼痛、僵硬、日?；顒邮芟薜仍蚋械讲粷M[5]，因此，早期KOA 的保守治療方案越來越受到重視?，F代醫學對于早期KOA 的治療主要以控制體質量、運動、藥物等為主[6]，但無法有效阻止疾病的進展，達不到預期效果[7-8]。KOA在中醫學屬于“骨痹”范疇，溫針灸作為中醫學的重要組成部分，被廣泛應用于早期骨關節炎的治療，但對其有效性與優勢，也有研究提出了保留意見[9-10]，尤其是其治療機制的研究仍較少。本研究從動物實驗的角度探究溫針灸治療KOA 的有效性及作用機制，以期為臨床方案的制定提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與分組健康雌性清潔級SD 大鼠20只，體質量（210±10）g，所有大鼠分籠飼養，由專人負責管理。實驗室定期消毒，環境溫度（23±2）℃，相對濕度50%～70%。所有大鼠適應性飼養1 w后開始實驗。按照隨機數字表法將大鼠分為模型組與溫針灸組，每組10 只。本研究符合中國倫理委員會有關動物研究指導原則。

1.2 主要材料艾粒（10 mm×15 mm，0.7±0.07 g/粒，南陽市臥龍漢醫艾絨廠）；一次性無菌針灸針（0.30 mm×13 mm，蘇州醫療用品廠有限公司）；IL-1β ELISA試劑盒（Mreda，批號：M149213-48T）；MMP-3 ELISA 試 劑 盒（Mreda，批 號：MF16171-48T）；ADAMTS-7 ELISA 試劑盒（Zokeyo，批號：Y-97285-96T）；IL-1β 抗 體（Abcam，批 號：ab254360）；ADAMTS-7抗體（Abcam，批號：ab201083）；MMP-3抗體（Abcam，批 號：ab52915）；RIPA 裂 解 液（Elabscience，批號：E-BC-R327）。

圖2 ELISA檢測兩組大鼠膝關節液IL-1β、ADAMTS-7、MMP-3的表達情況

圖3 Western blot檢測兩組大鼠膝關節軟骨組織中IL-1β、ADAMTS-7、MMP-3的表達情況

圖4 RT qPCR檢測兩組大鼠膝關節軟骨組織中IL-1β、ADAMTS-7、MMP-3的mRNA 表達情況

1.3 模型制備采用改良Hulth法建立KOA模型[11]。造模方法：腹腔注射2 mL/kg 戊巴比妥鈉（30 g/L）麻醉大鼠，于無菌條件下切除大鼠右膝內側半月板及內側副韌帶，術后向大鼠肌內注射20 U 青霉素以預防感染，每天1次，連續3 d。模型制備后需等待2 w形成大鼠KOA模型，造模成功后再進行干預。

1.4.1 模型組 正常抓取、捆綁固定，每天1 次，連續20 d。

1.4.2 溫針灸組 參照《實驗動物針灸穴位圖譜》[12]，取膝前穴，一次性針灸針針刺深度約5 mm，上下提插3次后，將艾粒置于針柄處后點燃，燃完起針，每天1次，連續20 d。

1.5 觀察指標

1.5.1 行為學評分 由同一位經過培訓的醫師，從疼痛程度、步態改變、關節活動范圍、關節腫脹度四個方面，分別于模型制備前、模型制備后2 w、治療20 d后對大鼠進行行為學評測，根據膝骨關節炎功能指數Leauesne MG 量表[13]進行評分，分數越高說明癥狀越嚴重。

1.5.2 影像學指標 干預20 d 后，對兩組大鼠做右側膝關節micro-CT 掃描。將大鼠麻醉固定于micro-CT 床進行掃描，之后借助micro-CT 系統配套的軟件對掃描數據進行結構重建，利用三維旋轉功能選取膝關節脛骨平臺區域軟骨下骨進行分析。骨組織分析指標：骨體積分數（bone volμme fraction，BV/TV）為皮質骨和松質骨骨量評價常用指標，能夠反映不同樣本骨小梁骨量的多少，該值增高說明骨合成代謝大于分解代謝，骨量增加；骨小梁厚度（trabecular thickness，Tb.Th）、骨小梁數量（trabecular nμmber，Tb.N）、骨小梁分離度（trabecular separation，Tb.Sp），上述三個指標是評價骨小梁空間形態結構的主要指標，在骨合成代謝大于骨分解代謝時，Tb.N 和Tb.Th 數值上升，Tb.Sp數值下降。

1.5.3 酶聯免疫吸附（ELISA）檢測IL-1β、ADAMTS-7、MMP-3 含量 治療20 d 后，按照白細胞介素-1β（Interleukin-1β，IL-1β）、基質金屬蛋白酶-3（matrix metalloproteinase-3，MMP-3）、聚蛋白多糖酶-7（a disintegrin and metalloproteinase with thrombospondin motifs-7，ADAMTS-7）的ELISA 試劑盒子上的操作方法使用ELISA 檢測大鼠關節液中的IL-1β、ADAMTS-7、MMP-3的含量。

1.5.4 蛋白免疫印跡（Western blot）檢測IL-1β、ADAMTS-7、MMP-3含量 檢測兩組大鼠右側膝關節軟骨組織IL-1β、ADAMTS-7、MMP-3 蛋白表達水平。摘取大鼠右側膝關節，剝離軟骨組織并粉碎后，再加0.5 mL RIPA 裂解液沒過軟骨組織，于2 ℃下15000 r/min 離心10 min，取上清液，對待測蛋白進行上樣，依次完成電泳、轉膜、封閉及免疫印跡顯色等步驟。采用Image J 軟件分析條帶灰度值。以目的蛋白條帶與GAPDH灰度比值表示蛋白相對表達水平。

1.5.5 實時熒光定量逆轉錄PCR（Real-time qPCR，RT-qPCR）檢測IL-1β、ADAMTS-7、MMP-3的mRNA 表達 使用RT qPCR 檢測兩組大鼠軟骨組織中IL-1β、ADAMTS-7、MMP-3 的mRNA 表達。反應條件為：95℃預變性5 min，95 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，延伸90 s，共30個循環。

10月19日早上8：20，離金樽獎論壇開幕還有40分鐘時，我見到了David。他背著鼓囊囊的挎包，一步步走向舞臺，一邊的肩膀被壓得微微有些傾斜。坐了一個晚上的飛機，早上6點才落地廣州，他看起來似乎有些疲憊。論壇、大師班、品鑒會、晚宴，4場幾乎無縫銜接的活動都需要他在場發言或是主持，這天對David而言會是漫長的一天。

1.6 統計學方法用SPSS 19.0 軟件進行數據分析，計量資料以（±s）表示，采用t檢驗進行比較，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 行為學檢測結果模型制備前兩組大鼠Lequesne MG評分比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。模型制備后2 w，模型組、溫針灸組Lequesne MG評分較之前升高（P＜0.05），說明KOA大鼠造模成功。治療20 d 后，兩組Lequesne MG 評分明顯降低（P＜0.05），且與模型組比較，溫針灸組的Lequesne MG 評分更低（P＜0.05）。見表1。

表1 兩組大鼠Leauesne MG評分結果比較（ ± s，分）

表1 兩組大鼠Leauesne MG評分結果比較（ ± s，分）

注：與制備前比較，①P＜0.05；與治療前比較，②P＜0.05；與模型組比較，③P＜0.05

組別模型組溫針灸組模型制備前0.60±0.70 0.60±0.70模型制備后2 w 9.00± 0.94①8.90±1.20①治療20 d后6.50±1.58②8.20±1.14②③

2.2 影像學檢測結果治療20 d 后，觀察兩組大鼠脛骨平臺軟骨下骨情況，結果顯示模型組大鼠軟骨下骨損傷較溫針灸組明顯，見圖1。骨組織分析結果顯示，與模型組比較，溫針灸組的BV/TV、Tb.Th、Tb.N上升，Tb.Sp 降低，兩組差異具有統計學意義（P＜0.05），見表2。

表2 兩組大鼠膝關節骨組織分析結果比較（ ± s）

表2 兩組大鼠膝關節骨組織分析結果比較（ ± s）

注：與模型組比較，①P＜0.05

溫針灸組49.36±1.29①78.36±2.36①6.53±0.16①102.89±1.69①指標BV/TV（%）Tb.Th（μm）Tb.N（mm-1）Tb.Sp（μm）模型組33.07±2.06 69.62±1.36 5.02±0.33 118.25±1.66

2.3 ELISA 檢測結果治療20 d 后，與模型組比較，溫針灸組關節液中IL-1β、ADAMTS-7、MMP-3 含量均降低（P＜0.05）。見圖2。

2.4 Western blot 檢測結果治療20 d 后，與模型組比較，溫針灸組大鼠軟骨組織中IL-1β、ADAMTS-7、MMP-3含量均降低（P＜0.05）。見圖3。

2.5 RT qPCR檢測結果治療20 d后，與模型組比較，溫針灸組IL-1β、ADAMTS-7、MMP-3 的mRNA 含量均降低（P＜0.05）。見圖4。

3 討論

近年來，溫針灸廣泛應用于KOA 的治療，大部分研究認為其在鎮痛、恢復關節功能等方面具有很好的療效[14]。何敏昌等[15]研究發現，相較于傳統口服藥物治療，溫針灸治療KOA 可以改善患者的骨關節炎指數，增加膝關節屈曲度。但也有研究[10]認為溫針灸在與傳統針刺、電針的比較中，總有效率并沒有區別。部分回顧性研究指出，對于溫針灸的治療效果，仍需要更多高質量的研究進一步驗證[16-17]。與此同時，關于溫針灸治療骨關節炎的動物實驗逐漸受到重視。王永超等[18]對溫針灸治療前后的大鼠進行行為學檢測，利用局部疼痛度和關節腫脹程度兩個指標評價溫針灸的治療效果。本研究通過Lequesne MG 量表評分，觀察KOA 大鼠在溫針灸治療后疼痛程度、步態改變、關節活動范圍、關節腫脹程度四個指標的改善程度，結果表明溫針灸確實可以改善KOA 的癥狀，療效確切。

骨關節炎主要是以關節內異常的炎癥反應及軟骨等組織的破壞為主要病理表現。軟骨細胞賴以生存的軟骨細胞外基質（extracellular matrix，ECM）的合成與降解失衡是導致軟骨退變的重要原因之一[19]。其中ADAMTS 和MMPs 與ECM 退變密切相關。軟骨寡聚基質蛋白（cartilage oligomeric matrix protein，COMP）作為軟骨細胞中重要的非膠原成分，可以維持軟骨的穩定性[20]。骨關節炎發病時關節軟骨組織中的ADAMTS-7 明顯提高，可以消化分解COMP，進而導致軟骨細胞ECM的破壞，導致軟骨組織受損[21]。研究[22]表明，ADAMTS-7 對于軟骨細胞的分化及軟骨形成具有抑制作用，認為可以通過抑制ADAMTS-7從而治療骨關節炎。周逸敏[23]研究發現，強骨寶湯可通過抑制ADAMTS-7 的表達，減少COMP 的降解，穩定軟骨細胞外基質內環境，從而有利于KOA 的修復。羅素娟[24]發現，消骨痛湯可通過抑制“ADAMTS-7-COMP 降解-細胞外基質穩定性下降”達到治療骨關節炎的目的。由此可見，ADAMTS-7 的上調是KOA中促進軟骨損傷、阻礙軟骨修復的重要因子，同時也為骨關節炎治療提供了新的思路。然而，目前溫針灸治療骨關節炎的研究中，還未有人關注過ADAMTS-7的變化。

MMPs家族構成了細胞外基質降解最重要的蛋白水解系統，其中MMP-3是基質溶解素中的重要成分，在KOA 的不同病理時期均有表達，可促進軟骨組織的退變[25]。林如意等[26]研究證明，溫針灸可以降低患者血清中MMP-3 的表達。本研究結果表明，與模型組比較，溫針灸組關節液、軟骨組織中ADAMTS-7、MMP-3 含量均降低，差異均具有統計學意義（P＜0.05），說明溫針灸可以通過降低ADAMTS-7 以及MMP-3的表達，延緩軟骨細胞外基質的破壞，從而起到保護關節軟骨的作用，進而延緩骨關節炎的發生、發展。炎癥反應作為骨關節炎的主要病理機制，抑制炎癥反應對于疾病的治療有著重要意義。大量研究發現，IL-1β 在KOA 患者關節軟骨中表達增加[27]，IL-1β 是重要的促炎細胞因子，可加重關節內的炎癥反應，還可以促進ADAMTS-7、MMP-3 的表達[28-29]，在骨關節炎發病過程中參與關節軟骨的損傷及破壞。夏循富等[30]研究發現，通過溫針灸治療，關節炎患者關節滑液中IL-1β含量降低，與治療前比較差異具有統計學意義（P＜0.05）。但其檢測手段單一，檢測結果不夠直觀。而本研究通過多種檢測方法，證明溫針灸確實可以有效降低骨關節炎中IL-1β的表達?？傊狙芯揩@取大鼠關節軟骨和關節液等標本，通過ELISA檢測、Western blot、RT qPCR等方法，驗證了溫針灸可以同時降低ADAMTS-7、MMP-3、IL-1β 的表達，從多方位起到對骨關節炎中軟骨組織退變的延緩作用。

KOA的病變不僅僅累及軟骨，軟骨下骨同樣會發生改變。關節活動依賴于正常的解剖結構，早期KOA軟骨下骨多以軟骨下骨的吸收為主，表現為骨體積減小，可以出現應力性微骨折[31]。軟骨下骨結構改變可導致膝關節生物力學特性發生變化，從而引發并加重KOA。有研究[32]表明，軟骨下骨與軟骨之間存在生物化學交流，這種交流調控在KOA 病程中發揮至關重要的作用。由此可見，保護軟骨下骨對KOA 的治療至關重要。戴燚等[33]發現，青娥方可以通過保護關節軟骨下骨，調節軟骨下骨組織骨小梁各項指標，改善骨代謝，延緩早期軟骨下骨丟失，防治骨性關節炎。柴毅[34]研究發現，左歸丸可改善骨關節炎軟骨下骨、軟骨病變，促進軟骨下骨形成，抑制骨吸收，有助于恢復骨重建平衡，提高骨密度，具有修復軟骨下骨的作用。如今，軟骨下骨的保護在骨關節炎的治療中愈發受到重視，然而目前關于溫針灸對骨關節炎軟骨下骨影響的研究較少。馬遇原等[35]通過切片觀察到，模型組軟骨下骨受損嚴重，軟骨下骨中細胞排列紊亂，大小、密度不均，而溫針灸組較模型組軟骨下骨細胞分布較均勻。朱仕強等[36]通過病理切片染色觀察后發現，溫針灸治療可以使得軟骨下骨的骨小梁面積百分數、骨小梁數目明顯升高，骨小梁彌散度明顯降低。

從本研究大鼠膝關節micro-CT 的掃描結果可以看出，模型組大鼠軟骨下骨損傷破壞較為明顯，而溫針灸組大鼠軟骨下骨的形態較為規整，較模型組破壞程度明顯降低。從骨組織分析發現，與模型組比較，溫針灸組大鼠軟骨下骨的骨體積分數、骨小梁厚度、骨小梁數量均有所上升，而骨小梁分離度有所下降，差異具有統計學意義（P＜0.05），提示溫針灸可以在一定程度上緩解大鼠膝關節軟骨下骨的破壞。由此可見，溫針灸不僅可以保護軟骨，同時可以改善膝關節炎早期軟骨下骨的損傷，延緩疾病的發生和發展。

綜上所述，溫針灸能夠有效改善關節疼痛等癥狀，同時改善關節軟骨下骨的破壞，降低關節軟骨組織IL-1β、ADAMTS-7、MMP-3 等細胞因子對軟骨的降解作用，使KOA的癥狀得以改善。