基于深度學習病原微生物形態學檢測方法的研究現狀及展望

孔令敏，劉恰，姜廷帥，衛娜，田越，崔驪，云慶輝

中國人民解放軍空軍軍醫大學第一附屬醫院 器材設備科，陜西 西安 710032

引言

病原微生物是指能夠引起人或動物感染疾病的微生物，主要包括病毒、細菌、寄生蟲和真菌等。這些病原微生物可在短時間內通過氣溶膠、體液、食物以及身體接觸輕易傳播，會導致各種傳染病甚至死亡，對全球公共衛生構成巨大威脅[1-2]。預防傳染病作為公共衛生措施極其重要，主要有3 個基本策略：① 控制傳染源；② 切斷傳播途徑；③ 保護易感人群。這些策略中，控制傳染源因其方便且成本低，被認為是最關鍵的策略。早發現、早診斷和早治療是控制傳染源的有力措施，在進行及時診斷和治療感染者的過程中，需要快速、敏感和準確的病原微生物檢測方法[3]。病原微生物的準確快速檢測是診斷和預防疾病的關鍵，不僅在公共衛生方面至關重要，而且在食品安全[4-5]、環境污染監測[6]、臨床診斷[7]及反生物恐怖主義[8-9]等方面也具有重要意義。目前，傳染病臨床診斷中病原微生物的分析方法可分為4 類：化學方法、物理方法、生物分子學方法和形態學檢測方法[6]。

（1）化學方法。酶聯免疫吸附試驗（Enzyme Linked Immunosorbent Assay，ELISA）是基于特異性抗原識別和酶的高效生物催化特性，該酶與抗體或抗原結合，催化顯色底物轉化為可見比色輸出并放大信號，利用該原理可對微生物進行檢測。由于其簡單、易于操作和高通量，ELISA 常用于臨床診斷、食品安全和環境檢測等[10]。但ELISA 使用的化學試劑成本高且會造成二次污染。

（2）物理方法。研究表明光譜技術是一種快速、廉價和無損的病原微生物鑒定工具，如拉曼光譜技術根據不同的病原微生物表型以獨特的分子組成，導致其相應的拉曼光譜存在差異，對病原微生物單個細胞的拉曼光譜信號進行采集，可以識別病原微生物的種類[11]。高光譜成形技術可同時采集病原微生物樣本的一維空間信息和二維光譜信息，從而生成三維數據立方體，通過分析病原微生物數據立方體的光譜信息和空間信息對其鑒別[12-13]。此外，光譜技術往往需要昂貴的設備。

（3）分子生物學方法。通過基因組序列分析區分微生物，如聚合酶鏈式反應（Polymerase Chain Reaction，PCR），是一種核酸擴增技術，這一方法相比傳統的基于培養和平板計數的方法具有檢測速度快、靈敏度和特異性高等優點，但其檢測過程中需要特定的儀器和專業的人員[1-2]。

（4）形態學檢測方法。最直接和簡單的方法，在顯微鏡下觀察病原微生物，并根據其細胞形狀手動識別。如在顯微鏡下觀察細菌，可根據其形狀特征、排列方式和革蘭氏染色等形態學特征對細菌進行鑒別和分類[14]。形態學方法是上述方法中成本最低的，但該方法較為繁瑣和耗時。此外，對顯微鏡下的圖像人工分析存在客觀不穩定性，結果的準確性往往取決于檢驗人員的水平。

以上研究表明，將圖像處理方法引入到病原微生物形態學檢測中具有重要意義。近幾年，人工智能（Artificial Intelligence，AI）技術發展迅速，特別是在計算機視覺、圖像處理方面取得了重要的成就。AI 在病原微生物顯微鏡下形態學檢測中也顯示出了潛在優勢。

1 人工智能

AI 發展經歷了三次浪潮，從1956 年AI 概念的首次提出，到20 世紀80 年代基于機器學習的專家系統的應用，以及2010 年以來深度學習和大數據興起帶來的AI 爆發（圖1）[15]。AI 在眾多領域都表現出了卓越的性能，如自動駕駛、人臉識別和疾病診斷等方面。AI 在微生物圖像分析中可以承擔繁重和耗時的工作，快速地從圖像數據中提取有價值的信息，具有強大的客觀分析能力，可避免人工分析造成的主觀差異。因此，AI 在一定程度上，可以減少微生物學家的誤判，提高診斷效率[6]。

圖1 AI的發展趨勢

基于深度學習的AI 使計算機能從大量數據中學習，復制人類技能。深度學習是一項新興的技術，在生物醫學應用中表現出了先進的性能。多項研究表明，深度學習在自動醫學圖像分析的性能上可與專家相媲美[16-17]。例如，Esteva 等[16]利用卷積神經網絡（Convolutional Neural Network，CNN）完成了皮膚損失圖像的自動分類，獲得了與皮膚科醫生相當的測試結果，從而證明了AI能夠將皮膚癌進行分類。另外，深度學習算法應用于病理切片圖像上也可以提高癌癥診斷的準確性和效率[17]。然而，深度學習在微生物學中的應用尚未充分發揮其潛力。微生物研究中產生了大量的生物圖像數據，傳統的計算方法在處理這些數據時較為緩慢，相比之下，深度學習往往在準確性和速度方面表現優異。微生物學家通過深度學習將微生物的研究帶來新應用，隨著AI 驅動的微生物顯微圖像檢測的顯著進步，深度學習在微生物圖像識別和分類中的應用迅速增長[18-21]。

2 AI技術在病原微生物檢測中的應用

研究人員通過使用顯微鏡成像能夠識別和監測病原微生物，并用于臨床診斷和發病機制研究[22-23]。盡管顯微鏡被廣泛使用，但受限于顯微鏡精度以及需要訓練有素的技術人員，人為操作顯微鏡的過程是繁瑣復雜的。因此，在許多資源有限的地區，傳染病的診斷仍然是一個具有挑戰性的過程。為了應對人為操作顯微鏡所存在的挑戰和困難，目前已有研究提出了基于深度學習的病毒、細菌、寄生蟲和真菌等多種微生物的顯微圖像分析方法[24]。在顯微鏡成像領域，深度學習所表現出的潛力是巨大的，研究表明，將深度學習應用于微生物自動檢測的顯微成像將顯著提高診斷的準確性和效率[25-26]。

2.1 AI技術在病毒檢測中的應用

病毒是一種可以傳播和感染其他生物體的微生物，通過釋放并整合宿主細胞基因組的遺傳物質和自身基因組的自我復制進行增殖[27]。宿主生物免疫系統通過產生特異性抗體方式，中和病毒和被病毒感染的細胞。然而，病毒遺傳物質的不穩定使其可以快速進化以適應不斷變化的生態環境[28]。隨著新病毒不斷地出現，病毒性大流行對全球公共衛生構成了嚴重的威脅[29-30]。電鏡觀察病毒形態差異一直被用作病毒檢測的標準，隨著ELISA和PCR 等技術的發展，診斷性電鏡逐漸被取代。但電鏡鑒定病毒簡單快速，特別是在緊急狀況或再次出現傳染源的病原體診斷中發揮關鍵作用[31]。迄今為止，幾乎所有的病毒形態診斷都是由熟練的專家進行，電鏡圖像的手動分析較為耗時，且需要大量的關于病毒形態的知識。因此，基于AI 自動準確的病毒識別方法對于分析大量病毒電鏡圖像至關重要。

與傳統的圖像處理方法相比，CNN 顯示出了更好的分類和檢測能力，但該方法需要大量的圖像訓練數據并進行手動注釋才能更好地執行。然而，在電鏡領域，訓練數據的可用性非常有限，因為這需要耗時的樣本準備、圖像采集和手動標記。Devan 等[32]開發了一種基于CNN 的遷移學習方法，可自動從原始圖像中學習鑒別特征，從而實現自動檢測電鏡中的人類巨細胞核衣殼，與現有深度學習技術比較，該方法不需要耗時的手動定義圖像的結構特征，表明遷移學習方法可以高特異性地檢測電鏡圖像中的病毒衣殼。Ito 等[33]引入全卷積神經網絡（Fully Convolutional Neural Network，FCN）方法用于檢測電鏡圖像中的病毒顆粒，該方法屬于監督學習，需要電鏡輸入圖像和進行注釋的參考圖像饋送到CNN以獲取有效特征，基本上用于檢測已知病毒，在含有貓杯狀病毒顆粒的電鏡圖像數據集評估了所提出方法的檢測性能，對比現有幾種病毒檢測方法，該方法展現出了最新性能，對比結果如圖2 所示。Devan 等[34]通過使用生成對抗網絡（Generative Adversarial Network，GAN）生成的合成標記圖像來增強訓練數據，在電子顯微鏡圖像中區分人巨細胞病毒核衣殼包膜的3 個階段。Xiao 等[35]提出了一種用于病毒分類的殘差混合注意網絡（Residual Mixed Attention Network，RMAN），并通過透射電鏡病毒圖像數據集進行了驗證，該方法在12 個病毒類上的Top-1 錯誤率為4.285%，超過了其他先進的AI 方法甚至是人類專家。表1 對上述基于AI 病毒檢測方法的論文進行了總結和分析。

表1 基于AI病毒檢測方法的總結和分析

圖2 電鏡圖像中病毒顆粒檢測結果的比較[33]

2.2 AI技術在細菌檢測中的應用

細菌是人體微生物群的重要組成部分，定植于包括腸胃和皮膚在內的組織。雖然大多數細菌是無害的，有些菌株甚至在消化和與機會病原體競爭方面提供益處，但細菌感染是最常見的人類疾病之一[36-37]。有些的檢測和治療是預防和減輕細菌感染的關鍵，PCR 和ELISA是廣泛使用的具有高靈敏度和特異性的臨床病原菌鑒定方法。然而，這些方法需要多個步驟，包括樣品預處理、細菌培養和DNA/RNA 擴增，以及訓練有素的操作員來執行[38]。因此，有必要尋求穩健高效且低成本的病原體檢測方法。在圖像識別方面表現出色的AI 技術，被用于細菌檢測方面的研究。

Govindan 等[39]提出了一種基于機器學習的方法，用于結核桿菌抗酸染色痰涂片圖像中的結核病識別，所提出的技術包括使用相關拉伸技術和k 均值聚類的圖像分割，然后提取基于形狀的特征，并使用支持向量機（Support Vector Machine，SVM）將圖像分類為結核抗體陽性和結核抗體陰性。Wahid 等[40]提出了基于遷移學習的細菌顯微圖像分類方法，數據集由5 種細菌的500 張灰度圖像組成，即肉毒梭菌、淋病內瑟菌、霍亂弧菌、伯氏疏螺旋體和結核分歧桿菌，分類結果如圖3 所示。Panicker 等[41]提出了基于深度學習方法來檢測痰涂片圖像種的結核桿菌。Traore 等[42]將CNN 應用于霍亂弧菌和惡性瘧原蟲的圖像分類。Treebpachatsakul等[43]提出了基于深度學習的方法來識別兩種細菌，該研究使用兩個數據集，每個數據集都有金黃色葡萄球菌和德氏乳酸菌的樣本圖像。Shichijo 等[44]構建了CNN在基于內窺鏡圖像診斷幽門螺桿菌胃炎中的應用，評估了其診斷幽門螺桿菌感染的能力，結果證實與內窺鏡醫師手動診斷相比，該方法具有更高的效率。Mithra 等[45]提出了高斯-模糊神經網絡（Gaussian Fuzzy Neural Network，GFNN），將高斯混合模型與模糊神經網絡相結合用于結核檢測；實驗結果表明，所提出的GFNN 獲得了更好的性能。細菌性陰道?。˙acterial Vaginosis，BV）是由陰道內細菌過度和不平衡生長引起的，30%和50%的女性受其影響。革蘭氏染色和顯微鏡下基于細菌形態類型的Nugent 評分被認為是BV 診斷的金標準。但這種方法通常是勞動密集型和耗時的。Wang 等[46]開發并優化了CNN 模型，并評估了其自動識別和分類顯微圖像中三類Nugent 的能力，通過對從三家醫院收集的獨立測試圖像進行評估，獲得了優于中國頂級技術專家和產科醫生的結果。表2 對上述基于AI 細菌檢測方法的論文進行了總結和分析。

表2 基于AI細菌檢測方法的總結和分析

圖3 測試圖像中細菌分類的結果[40]

2.3 AI技術在寄生蟲檢測中的應用

寄生蟲病是由寄生生物引起的傳染病，感染后，寄生蟲在其入侵的不同器官系統誘導發病機制，包括奪取營養、機械損失、毒性和抗原物質等影響[47]。建立省時、準確的診斷方法對于寄生蟲病的檢測、預防和控制有重要意義。一般用于分子診斷的實驗室檢測，可以直接檢測樣本中的核酸分子。雖然這些技術優于病原學檢測，但診斷寄生蟲學的顯微鏡方法具有低成本和簡單的優點。而基于顯微鏡的寄生蟲識別是耗時和勞動密集型的[48]。寄生蟲形狀、密度和染色顏色變化的不確定性，使顯微鏡圖像中的寄生蟲檢查具有挑戰性。AI 將成為基于圖像分類的寄生蟲檢測的強大工具。為了開發寄生蟲自動圖像分析工具，研究人員使用了各種AI 深度學習算法[47]。

Widmer 等[49]提出了一種基于神經網絡的方法，用于在顯微圖像中識別微小隱孢子蟲卵囊，其中訓練集由525 幅顯微圖像組成，測試集由362 張不同圖像組成，該方法準確率可達到81%。Suzuki 等[50]提出了一種基于機器學習的技術，用于人體腸道寄生蟲的分割和分類，分割過程包括圖像森林變化、圖像量化、邊界增強和橢圓匹配，分類過程實現了多種機器學習算法比較，選擇最優的機器學習算法進行分類。Apostol 等[51]開發了一種RadSS 應用系統，使用SVM 自動識別放射蟲物種，該系統通過提取形狀和紋理特征，然后使用PCA 進行特征選擇，SVM 進行分類。Vijayalakshmi等[52]使用了轉移學習方法，以識別血液涂片圖像中的惡性瘧原蟲，該方法使用VGG 19 CNN 模型進行特征提取，然后使用SVM 對VGG 19 的最后三層微調以進行分類。Loh 等[53]使用了一種Mask R-CNN 的深度學習模型，該模型針對未感染和惡性瘧原蟲感染的紅細胞進行訓練，預測模型生成報告的速度比手動計數快15 倍，同時不影響準確性，并且能夠在邊界框分類之上生成分割掩碼，以便立即可視化，這使其優于現有模型。此外，隨著標準化程度的提高，其有很大潛力可減少人工計數產生的錯誤，并節省大量人力資源、時間和成本。Li 等[54]開發了一種基于深度學習的高度可配置的儀器，使用深度轉移圖卷積網絡（Deep Transfer Graph Convolutional Network，DTGCN）識別血液涂片圖像中不同階段的瘧原蟲識別，該血液涂片圖像通過放大倍數為1000 倍的顯微鏡采集獲得，與VGGNet、GoogleNet和ResNet 等先進方法相比，該方法在公開的多階段瘧原蟲顯微圖像中顯示出更高的準確性和有效性。表3 對上述基于AI 寄生蟲檢測方法的研究進行了總結和分析。

表3 基于AI寄生蟲檢測方法的總結和分析

2.4 AI技術在真菌檢測中的應用

真菌是微生物和生態系統中必不可少的真核生物，大多數真菌沒有致病性。但有些真菌會釋放毒素并導致人類、植物和動物患病，如曲霉菌是一種產生黃曲霉毒素和次級代謝產物的病原真菌，可導致人和動物的嚴重疾病。曲霉病原體被視為全世界免疫抑制個體的重要威脅，如會使器官移植、癌癥和HIV 患者導致侵襲性曲霉病并產生致命后果[55-56]。臨床上如果能及時檢測病原真菌，可以提高此類真菌感染類疾病的治愈率。但傳統的鑒定真菌方法，如PCR、核酸探針法、形態學檢測法等，多數都需要專業的檢驗人員且檢驗時間較長。研究人員通過深度學習算法用于真菌顯微圖像的快速診斷。

Ma 等[57]使用深度CNN 來研究對各種曲霉物種進行分類的能力，使用立體顯微鏡采集平板上的菌落，生成足夠的分辨率圖像并對其進行分類，其中收集了在富集培養基中培養的7 種曲霉菌的8995 個原始菌落圖像，并自動切割生成17142 個圖像，作為包含每個菌株分生孢子或菌落典型代表形態的訓練和測試數據集，結果顯示出了較高的分類精度和檢測準確率，該研究展示出了一種基于AI 且具有成本效益的曲霉菌檢測方法。Liu 等[58]開發了一種自動真菌檢測系統，該系統能夠在復雜環境下自動識別含有其他細胞和雜質的微生物糞便圖像，采用人工神經網絡（Artificial Neural Network，ANN）對真菌進行識別，可分為兩個階段，第一階段用于處理不同焦距圖像的特征，第二階段使用第一階段的輸出值識別真菌，該系統可以準確檢測出圖像中是否有真菌，并統計不同真菌類型的數量。Zhang 等[59]提出了一種用于白帶圖像中真菌檢測的機器學習技術，該方法涉及圖像分割、特征提取、降維和分類。Tahir 等[60]使用CNN對5 種類型的真菌孢子進行分類，CNN 的模型如圖4所示，該模型實現了94.8%的分類準確率，此外還提出了一種由40800 個標記真菌孢子圖像組成的新數據集。Hao 等[61]提出了另一種基于CNN 的方法，用于在顯微鏡白帶圖像中檢測白色念球菌，將最大類間方差的閾值技術應用于圖像分割，使用CNN 將分割的真菌子圖像分類。表4 對上述基于AI 真菌檢測方法的研究進行了總結和分析。

表4 基于AI寄生蟲檢測方法的總結和分析

圖4 檢測不同種類真菌的CNN模型[60]

2.5 AI在病原微生物檢測應用的發展趨勢和挑戰

AI 技術已經有效地應用于病毒、細菌、寄生蟲和真菌4 種類型的病原微生物形態學檢測。最初SVM、ANN 等機器學習算法用于部分微生物的圖像識別，這些技術即使在小數據集的情況下，也能實現良好的分類性能。但這些機器學習技術通常是半自動的，特征提取的過程仍然是手動的。越來越多的研究人員采用CNN等深度學習算法進行自動特征提取和分類，CNN 在沒有人為指導的情況下提取特征，優于其他特征提取技術。由于病原微生物種類的獨特特性，不同病原微生物對基于AI 形態學檢測的研究可能面臨不同的挑戰。例如，基于病毒的形態學檢測大多都在電子顯微鏡下完成，電子顯微鏡設備昂貴，病毒相較其他微生物樣本獲取困難，同時樣本制備復雜且耗時，這些因素極大地限制了AI在病毒檢測方面的應用。另外一個挑戰是寄生蟲和真菌等病原微生物物種的形態相似，傳統的機器學習算法對此類物種的效率低，而深度學習算法需要大量的數據用于訓練以產生最佳的結果。

3 總結與展望

本文對近年來國內外基于AI 在病原微生物檢測方法研究的最新進展進行了綜述和分析，并得出以下結論。

目前多數相關研究都致力于提出或引入更加高效的分類、特征提取、圖像分割的方法來提升病原微生物鑒定的結果。但大多數深度學習研究使用有監督學習方法，在建立病原微生物診斷模型前，往往需要進行耗時耗力的數據標注。對于病原微生物的研究，其樣本獲取困難、標注成本高等問題限制了AI 技術在病原微生物診斷領域的發展。只有部分病原微生物建立了學習模型，實現自動閱片，如結核分枝桿菌、瘧原蟲、真菌等，對于大多數病原微生物都處于人工觀測和建模狀態，自動識別尚處于空白。目前基于AI 的病原微生物形態學檢測技術仍有很大的潛力，其重點將會圍繞半監督學習以及無監督學習展開，從而使深度學習算法設計方向向“小樣本、標注少”的低成本進行改進，以實現病原微生物的自動檢測。

研究利用AI 技術實現顯微鏡下細菌形態自動識別，能夠實現高效精準的高致病微生物過篩，減少專家依賴。利用微型化技術、自動控制技術、互聯網技術實現全自動便攜化設備，從而提高效率、突破地域限制、實現災地和預防地廣泛性普查，對防災控災具有重要意義。在未來的工作中，將利用AI 技術實現病原微生物形態學便攜化快速檢測，完成醫工結合，具體表現為：① 利用深度學習技術，實現病原微生物的智慧檢驗，提高檢驗精度；② 利用高清數字采圖裝置技術，實現病原微生物圖像高速高清掃描保存，實現檢驗數字化和可視化，并可溯源；③ 利用自動控制技術，實現標本處理、檢驗流程自動化，可大大提高效率，減輕醫生工作強度，降低感染風險；④ 利用微型化和網絡化技術實現便攜式病原微生物檢驗，以及移動化篩查檢驗，突破地域和時域限制。此外，在更多的病原微生物研究中，對于一些高致病病原微生物特別是細菌如炭疽桿菌、鼠疫耶爾森菌、霍亂弧菌等，需要在高級別的生物安全實驗室開展，而大多數研究機構都無法滿足，導致這類病原微生物圖像樣本稀缺。因此，虛擬高致病病原微生物樣本庫的建立，應是未來一項重要的工作，值得進一步關注。