有效微生物菌群(EM)對加州鱸池塘養殖水質和水體菌群結構的影響

胡佳雯，聶志娟，鄭兆偉，李士恒，孫 毅，邵乃麟，徐鋼春，徐 跑

(1.中國水產科學研究院淡水漁業研究中心，江蘇無錫 214081；2.南京農業大學無錫漁業學院，江蘇無錫 214081；3.上海海洋大學水產與生命學院，上海 201306)

大口黑鱸(Micropterussalmoides)俗稱加州鱸，源產于北美洲，是一種肉質鮮美、無肌間刺、生長快、適溫廣的淡水肉食性魚類[1]。從我國1983年引進以來，其人工繁育和全程專用配套飼料研發技術不斷突破，現已成為國內重要的優質淡水池塘養殖品種[2]。中國大口黑鱸養殖產量逐年遞增，據2020中國漁業統計，大口黑鱸年產量已達到47.7萬噸，僅次于羅非魚，養殖區域遍布華南、華東、華中、西南等區域[3]。大部分區域主要以中高密度集約化池塘養殖為主[4]，在養殖過程中大量投喂人工配合飼料，50%～80%攝食氮源、60%～75%飼料磷被作為殘餌或排泄物釋放養殖水體中[5-6]，易導致水體富營養化，爆發藍藻，嚴重阻礙了大口黑鱸養殖業的健康發展。

養殖水體和沉積物修復可通過物理、化學和生物方法進行。其中，生物修復因具有綠色環保、生態友好、經濟實惠等特點而被廣泛認可[7]，益生菌在水產養殖系統中的環境修復也受到越來越多的關注和應用[8]。許多研究表明，養殖水體潑灑益生菌，可優化水體菌群結構，從源頭上降低養殖水體中氨氮、亞硝酸鹽等有毒害物質的含量，營造良好的水域生態系統環境[9-13]。而生態環境改善，有利于菌群結構的多樣性和穩定性[14]。EM復合益生菌為一種混合菌，一般包括光合菌、酵母菌、乳酸菌等有益菌類，可調控水體微生物結構，減少病原菌，平衡微生態，提高水產動物免疫力。李士恒等[15]采用EM復合益生菌開展對蟹鱸混養模式下養殖水體菌群結構的影響研究，發現EM復合益生菌能夠優化菌群結構，具有顯著的水體原位修復功能。本實驗以此為基礎進行拓展研究，延長實驗周期，探究EM復合益生菌對大口黑鱸池塘養殖水體原位修復效果，及其對養殖水體菌群結構的影響，以期為益生復合菌合理科學使用提供指導，促進我國大口黑鱸池塘養殖業的長期可持續發展。

1 材料方法

1.1 材料方法

養殖大口黑鱸購自安徽張林漁業有限公司；EM復合益生菌購自江蘇恒泰環保科技發展有限公司，(pH 3.0～4.0；菌種類數>80；總菌數≥107CFU/mL；乳酸菌數1.0×106～107CFU/mL；酵母菌數1.0×104～105CFU/mL；光合菌數(1.0～2.0)×103CFU/mL；放線菌數(1.0～3.0)×103CFU/mL)。

實驗于中國水產科學研究院淡水漁業研究中心揚中基地開展，單個養殖池塘面積為1 666.7 m2，水深2 m。實驗分為EM鱸實驗組(EL)和鱸對照組(L)，每組設三個重復。鱸放養時間為2020年4月2號，放養規格為184 g/尾，放養密度為1 500尾/666.7 m2。養殖實驗期間，每天投喂兩次，投喂量為鱸體質量的3%～5%。實驗開始后，實驗組池塘每10 d按500 g/667 m2比例進行EM潑灑。每個養殖池塘均配備微孔增氧機，夜間開啟增氧設備，溶解氧維持在6～8 mg/L。

1.2 樣品的采集和處理

1.3 樣品DNA提取及PCR擴增

取3 L混勻水樣，在4 ℃、12 000 r/min的條件下離心30 min，取沉淀放于離心管中用于后續DNA提取。根據E.Z.N.A.?soil試劑盒(Omega Bio-tek，Norcross，GA，U.S.)抽提總DNA，通過NanoDrop 2000檢測DNA的濃度和純度，以1%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA提取質量；用338F(5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3′)和806R(5′-GGACTACH VG GG TW TCTAAT-3′)引物[15]對細菌16S rRNA基因的V3-V4可變區進行PCR擴增，擴增程序為：95 ℃預變性3 min；95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共計27個循環；72 ℃延伸10 min。反應體系為(20 μL)：4 μL 5×FastPfu緩沖液、2 μL 2.5 mmol/L dNTPs、0.8 μL引物(5 μmol/L)、0.4 μL FastPfu聚合酶；10 ng DNA模板。

1.4 Illumina Miseq測序

PCR產物用2%的瓊脂糖凝膠回收，利用AxyPrep DNA Gel Extraction Kit(Axygen，U.S.)進行純化，三(羥甲基)氨基甲烷(Tris-HCl)洗脫，2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，并通過QuantiFluorTM-ST(Promega，U.S.)進行定量檢測。根據Illumina MiSeq平臺(Illumina，SanDiego，USA)標準操作規程將純化后的擴增片段構建測序文庫，然后利用Illumina公司的Miseq PE300平臺進行高通量測序(上海美吉生物醫藥科技有限公司)。

1.5 數據分析

原始測序序列用Trimmomatic軟件質控，通過FLASH軟件進行拼接：首先設置50 bp的窗口，當窗口內的平均質量低于20 bp時，從窗口前端位置截去該堿基后端所有序列，再去除質控后長度低于50 bp的序列；根據重疊堿基overlap，將兩端序列拼接，長度要大于10 bp，overlap間的最大錯配率為0.2；根據序列首尾兩端的barcode及引物將序列拆分到每個樣本，barcode匹配需精確，引物可有2 個堿基的容錯，除去模糊堿基序列。使用UPARSE 軟件，以97%的相似度水平對序列進行OTU聚類。使用雙因素方差分析進行統計學檢驗，(P<0.05)認為差異顯著；水體理化指標、微生物多樣性指數及主要菌屬的相對豐度間的差異通過上海美吉云平臺軟件分析。

2 結果

2.1 水質指標

水質測定結果顯示(表2)：Ⅰ期和Ⅱ期亞硝酸氮含量較低，無顯著差異，但在Ⅲ期EL組亞硝酸氮含量顯著低于L組；硝酸氮含量在Ⅰ期和Ⅱ期實驗組顯著高于對照組，但Ⅲ期和Ⅳ期顯著低于對照組；EL組總氮含量在Ⅰ期顯著低于L組，其它時期無顯著差異；EL組總磷含量在Ⅱ期、Ⅲ期、Ⅳ期顯著高于L組，Ⅰ期差異不顯著；氨氮指標在整個測定期無顯著差異。

2.2 菌群多樣性特征

測序結果顯示為24個樣品的有效序列數共1 011 929條，有效序列的平均長度為416 bp，以97%相似水平對測序樣品進行OTU劃分，可分為1 372個OTU，物種注釋結果顯示共26個門，76個綱，190個目，318個科，555個屬，857個種。顯示菌群豐富度的Chao指數在4個采樣期無代表意義的顯著差異，而多樣性pd指數顯示較多顯著差異(圖1)。其中，EL組在Ⅰ期pd指數顯著低于對照組，而在Ⅲ期pd指數極其顯著高于對照組。從Ⅱ期開始，隨著采樣月份的增長，EL組和L組水體pd多樣性指數不斷增加，說明養殖期不同月份溫度氣候差異等因素對養殖水體微生物多樣性組成存在影響。

圖1 樣品中細菌豐富性和多樣性Fig.1 Richness and diversity of becteria in samples A：Chao指數；B：Pd指數；*代表0.01≤P≤0.05；**代表0.001≤P≤0.01；***代表P≤0.001

基于屬水平PCoA分析(圖2)結果顯示，橫軸(PC1)貢獻度為34.2%，縱軸(PC2)貢獻度為20.72%。EL組與L組在不同月份其水體菌群結構組成上存在顯著差異，距離較遠，但在I期和Ⅱ期，同一采樣期實驗組和對照組樣品距離較近，而在Ⅲ期，兩組樣品距離則較遠。

圖2 基于屬水平的主坐標分析結果Fig.2 Result of principal co-ordinates analysis(PCoA)based on the genus level

2.3 菌群結構組成

樣本在門水平的物種組成結構(圖3)結果顯示，在實驗開始(I期)，實驗組與對照組優勢菌門(豐度大于1%)都為擬桿菌、變形菌、放線菌、藍細菌、Verrucomicrobiota。在Ⅱ期，實驗組絕對優勢菌為變形菌(43.98%)，高于對照組(30.76%)，厚壁菌門為對照組的絕對優勢菌豐度為46.22%，高于實驗組(1.56%)。在Ⅲ期和Ⅳ期，實驗組的豐度最高菌為擬桿菌，豐度分別為42.07%、38.52%；而對照組豐度最高菌為放線菌，豐度分別為71.83%%、31.37%；此外，放線菌在實驗組為優勢菌，分別為23.65%、26.34%；而擬桿菌在對照組含量豐度相對低，為2.22%、19.28%。變形菌在養殖水體整個采樣期都為優勢菌，在實驗組(20.25%～43.98%)，對照組(14.77%～30.76%)；綠彎菌僅在養殖后期(Ⅲ期和Ⅳ期)豐度增加，高于1%，實驗組分別為2.18%、2.31%，對照組分別為3.48%、13.21%；藍細菌在實驗組的養殖前期豐度較大，但在后期(Ⅲ期和Ⅳ期)豐度小于1%，而在對照組整個采樣期都為豐度大于1%的優勢菌門出現，說明添加EM菌可以改變影響養殖水體的菌群結構，且對藍藻有一定的控制和抑制效應。

圖3 基于門水平的細菌組成結構Fig.3 The microbiota composition at Phylum level

水體微生物群落豐度大于1%的菌屬如圖4所示，在實驗前期(Ⅰ期和Ⅱ期)，同一月份的實驗組和對照組聚為一類，在實驗后期(Ⅲ期和Ⅳ期)，實驗組聚為一類，這和PCoA分析結果一致。水體中的主要菌屬為Dinghuibacter、norank-f-norank-o-chloroplast、分支桿菌屬(Mycobacterium)、黃桿菌屬(Flavobacterium)等，實驗組Ⅰ期最優勢菌屬為黃桿菌屬(35.57%)，Ⅱ期norank-f-norank-o-chloroplast(37.86%)，Ⅲ期和Ⅳ期皆為Dinghuibacter(40.18%～32.87%)；對照組Ⅰ期最優勢菌屬為黃桿菌屬(8.52%)，Ⅱ期微小桿菌屬(Exiguobacterium40.44%)，Ⅲ期CL500-29-marine-group(26.74%)，Ⅳ期Dinghuibacter(15.06%)。Dinghuibacter主要存在于實驗組Ⅲ期和Ⅳ期，而對照組主要為分支桿菌屬，黃桿菌屬主要存在于實驗組和對照組的Ⅰ期水體中，在其余時期皆低于1%。

圖4 兩種處理下的優勢菌屬熱圖Fig.4 Heatmap of dominant bacteria at the genus level under the two treatments

2.4 菌群差異分析

所有樣品進行菌屬差異分析，顯著差異菌屬主要為Dinghuibacter、分支桿菌屬、黃桿菌屬、微小桿菌屬、酸化菌屬(Acidibacter)(圖5)。將這5種差異菌屬在同一采樣期進行單獨差異分析顯示，Dinghuibacter豐度在實驗開始(Ⅰ期)兩組含量都較低，且實驗組極顯著低于對照組，但在之后實驗期(Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ)實驗組中豐度明顯增加，豐度都顯著高于對照組；黃桿菌屬(Flavobacterium)實驗開始(Ⅰ期)含量高，在實驗組極顯著高于對照組，但在之后實驗期實驗組中豐度明顯降低；微小桿菌屬顯示有差異，但在兩組同一時期單獨分析顯示結果為差異不顯著；實驗前期，分支桿菌屬差異不顯著，但在Ⅲ期和Ⅳ期，對照組水體中分支桿菌屬相對豐度極顯著高于實驗組。

2.5 菌群與水質理化因子相關性

圖6 優勢菌屬與水質理化因子之間的RDA分析Fig.6 RDA bioplot of water environment factors and differential microorganismsB1：Dinghuibacter；B2：Mycobacterium；B3：Flavobacterium；B4：norank_f_norank_o_chloroplast；B5：Exiguobacterium；B6：CL500_29_marine-group；B7：Acidibacter；B8：Norank_f_Rhizobiales_Incertae_Sedis

3 討論

水質的優劣是衡量水產養殖特別是集約化水產養殖成敗的關鍵，加強對池塘養殖水質的凈化，已成為社會和養殖系統本身關注的重要問題，也是池塘養殖可持續發展的迫切需要[14]。微生物修復已被廣泛應用于養殖水體的調控凈化[15]。微生物修復即為有益微生物的凈水生態過程，通過菌群分泌的各種酶將養殖水體中不斷產生的殘余餌料、排泄物等有機物，通過其氧化、氨化、反硝化、解磷、硫化、固氮等作用迅速分解，有效降低水體氨氮和亞硝酸鹽等有害物質的濃度[17]。水質凈化是一系列生物化學反應，單一菌種微生物在控制、凈化水質方面都有一定的局限性[18-19]。趙留群等[20]得出內含芽孢桿菌、釀酒酵母、植物乳桿菌、光合細菌的EM菌改善水質的效果優于單一的芽孢桿菌與海洋紅酵母。陳紅菊等[21]將篩選的氨氮降解菌用于養殖水體水質調控，具有明顯的降氨氮特性，并能有效增加藻類數量，但對亞硝酸鹽降解效果不顯著。因此實際應用中，往往需要多種菌組合的復合有益菌參與共同發揮作用，改善水質，維持水產養殖環境的生態平衡[22]。本研究采用日本比嘉照夫發明的包含乳酸菌、酵母菌、光合菌和放線菌4大類為主的EM復合益生菌，在三個月試驗期，顯著增加水體微生物多樣性，顯著降低水體亞硝酸的含量，而課題組李士恒等[15]研究得出，在一個月四次采樣后期顯著降低氨氮，但是亞硝酸鹽降解效果不顯著，說明養殖水體微生物修復需要一定的效應期，需長期合理使用復合益生菌。

復合益生菌對水體菌群的影響相對復雜，也容易受到外界氣溫等環境條件變化的限制[23-24]。本研究中，加州鱸魚養殖水體的菌群結構在不同月份，同一月份不同處理組都發生變化。I期和Ⅱ期，同一月份采樣樣品距離較近，試驗前期環境的變化對水體菌群相比較EM菌的添加影響更大，但養殖實驗后期(Ⅲ期和Ⅳ期)EM實驗組樣品間相比對照組距離更近，且樣品間重疊，說明合理使用EM菌一段時間可以穩定養殖池溏的菌群結構。菌群結構顯示，在一個月實驗期后(Ⅱ期)，厚壁菌門在實驗組的含量(1.56%)顯著低于對照組(46.22%)。表明復合益生菌中的一些菌或者分泌的產物可能對水體本身的厚壁菌有競爭性或抑制效果，導致厚壁菌顯著變少，這一結果和鄭佳佳[25]研究復合益生菌對草魚養殖水體水質和菌群結構的影響一致，且其厚壁菌減少更多，為91.21%。在Ⅲ期和Ⅳ期，實驗組的豐度最高菌為擬桿菌(42.07%、38.52%)，顯著高于對照組(2.22%、19.28%)，根據WAGNER[26]等關于廢水生物處理反應器中細菌群落結構的研究，擬桿菌一直是廢水處理系統中的最優勢類群。擬桿菌是藻類衍生碳水化合物最主要的分解者，除此之外還可分解蛋白質和脂質等復雜結構營養物質，水體中擬桿菌的存在可積極推動水體碳和營養循環。其中實驗組中擬桿菌主要為Dinghuibacter(40.18%～32.87%)，隸屬于Chitinophagaceae科，李繼兵[27]應用DNA的穩定同位素探針(DNA-SIP)和高通量測序技術首次證實Chitinophagaceae對菲有降解能力。此外，Dinghuibacter也是調節小龍蝦腸道和養殖水體重要的關鍵菌屬[28]。在Ⅲ期和Ⅳ期，復合益生菌的使用極顯著降低了養殖水體中分支桿菌屬相對豐度(P≤0.001)，分支桿菌多數為致病菌，通過浸泡的方式可致條紋鱸、鱘魚、斑馬魚等水生動物感染[29-32]，嚴重可產生爆發性死亡。

4 結論

綜上所述，在傳統養殖池塘長期定期潑灑復合益生菌，可降低水體亞硝酸鹽，改善養殖水體水質，增加水體微生物物種多樣性，調節水體菌群結構，減少致病菌群的豐度，使養殖水體的生態系統穩定性有所提高。復合有效微生物減少池塘養殖的負荷，利于養殖水體的原位修復，應大力推廣，促進池塘養殖可持續綠色發展。