梭鱸ghrh基因序列特征及其在大小個體間差異表達分析

周 佳，孫志鵬，吉宇丹，呂偉華，曹頂臣，魯翠云，劉天奇，鄭先虎

(1.中國水產科學研究院黑龍江水產研究所，淡水魚類育種國家地方聯合工程實驗室，農業農村部淡水水產生物技術與遺傳育種重點實驗室，哈爾濱 150070；2.上海海洋大學，農業農村部淡水水產種質資源重點實驗室，上海 201306)

生長激素釋放激素(growth hormone releasing hormone，ghrh)是由下丘腦神經元分泌的一種多肽類激素，是目前已知促進生長激素合成和分泌的主要激素之一，在脊椎動物的生長、代謝、繁殖、免疫調節等生物學過程發揮著重要作用[1-3]。有研究表明向動物體內注射ghrh或ghrh類似物，可以加快其生長速率，提高生產性能[4]。近些年，國內外學者對水產動物進行了ghrh基因表達特征的研究，結果表明，該基因在各組織的調控模式因物種的不同而存在差異，但ghrh基因一般在腦中高表達[5-8]，其基因表達量的高低影響著魚類生長的快慢[9-10]。此外，ghrh基因水平變化也受溫度[11]、性別[12]、外源激素[13]、光譜[14]等因素的調控，進而影響魚類的生長性能。

梭鱸(Sanderlucioperca)屬于鱸形目(Perciformes)鱸科(Percidae)梭鱸屬(Sander)，在國外主要分布于黑海、咸海、里海及波羅的水系，中國則主要分布于新疆的伊犁河、額爾齊斯河和黑龍江水系。梭鱸具有營養豐富，肉質優良、抗病力強、生長速度快等特點，是我國重要的淡水名優養殖魚類[15]。近幾年，國內外對梭鱸的研究主要在群體遺傳多樣性[16]、增養殖[17]、飼料與營養[18-19]、病害[20]等方面。但關于梭鱸生長性狀遺傳研究的文章較少，韓曉飛[21]驗證了8個微衛星位點與梭鱸生長性狀呈顯著相關；TENG等[22]克隆了胰島素樣生長因子Ⅰ/Ⅱ(insulin-like growth factors，IGF-Ⅰ，IGF-Ⅱ)和生長激素受體(growth hormone receptor，GHR)基因，并在IGF-Ⅱ中獲得1個與體重顯著相關的SNP位點。由于未經過系統選育，梭鱸養殖過程中出現個體大小差異顯著，導致出塘規格懸殊，一定程度上影響了梭鱸養殖業的發展。因此，開展梭鱸生長性狀調控機制及遺傳改良研究具有重要的實踐意義。本研究以生長軸ghrh基因入手，克隆獲得了ghrh基因cDNA全長序列并分析了序列特征，研究了其在梭鱸各組織的表達分布，分析了其表達量與梭鱸生長之間的相關性，旨在為梭鱸生長性狀的分子選育研究提供候選基因資源。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

實驗梭鱸取自黑龍江水產研究所呼蘭試驗場，選取同池塘養殖條件下的5尾1齡魚，體質量為210～240 g，取心、肝、脾、腦、垂體、肌肉、腸、胃、皮膚、鰓組織，置于液氮中速凍保存。隨機選取同批次繁殖、同池塘養殖環境下5月齡梭鱸500尾，挑選體質量極大和極小個體各10尾，極小組[體長(98.42±3.81)mm，體質量(8.28±1.12)g]和極大組[體長(171.6±10.6)mm，體質量(49.36±7.61)g]，將取得的組織(腦、肌肉、肝)置于液氮中冷凍保存。總RNA提取按照ThermoFisher公司提供的TRIzol Reagent試劑盒說明書進行操作；利用NanoDropTM 8000分光光度計和1.2%的瓊脂糖電泳對RNA樣品進行濃度和純度檢測。

1.2 基因克隆

以腦RNA為模板，根據PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser(Perfect Real Time)試劑盒說明書反轉錄為cDNA第一鏈(Takara，日本)。參照GenBank中已登錄的親緣關系較近的硬骨魚類ghrh基因序列，選擇保守區域和NCBI中發布的梭鱸轉錄組數據(登錄號：XM_036002601)進行序列比對，獲得梭鱸ghrh基因的部分cDNA序列并設計引物進行序列驗證(表1)。根據已獲得梭鱸ghrh基因的保守區域的序列設計RACE擴增引物(表1)，按照SMARTer?RACE5′/3′試劑盒(Takara，日本)說明書構建RACE文庫，SeqAmpTM DNA Polymerase(Takara，日本)試劑盒進行巢式PCR擴增。RACE第一輪：反應體系為10 μL，5′-GSP或3′-GSP 1 μL，10×UPM 1.0 μL，SeqAmp DNA Polymerase 0.2 μL，2×SeqAmp Buffer 5.0 μL，PCR-Grade H2O 3.1 μL，模板0.5 μL。反應程序為：94 ℃，30 s；72 ℃，2 min；5 cycles。94 ℃，30 s；70 ℃，30 s；72 ℃，2 min；5 cycles。94 ℃，30 s；68 ℃，30 s；72 ℃，2 min；25 cycles。RACE第二輪：取第一輪產物5.0 μL加入245.0 μL EDTA Buffer稀釋，作為二輪反應模板。反應體系為50.0 μL：SeqAmp DNA Polymerase 1.0 μL，2×SeqAmp Buffer 25.0 μL，PCR-Grade H2O 19.5 μL，UPMs 1.0 μL，nGSP1.0 μL，模板為2.5 μL。反應程序為：94 ℃，30 s；68 ℃，30 s；72 ℃ 2 min；25 cycles。

表1 引物序列Tab.1 Primer sequence in this study

PCR產物使用1.2%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，對目的條帶切膠后按照瓊脂糖膠回收試劑盒回收純化目的產物(康為世紀，上海)，將純化后的PCR產物連接至pMDTM19-T載體，轉化至大腸桿菌感受態DH5α，涂板，篩選陽性克隆送到蘇州金唯智生物科技有限公司完成測序。將測序結果使用BLAST(https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/)比對，DNAMAN軟件分析，Staden 1.7軟件進行拼接，最終獲得ghrh基因的全長cDNA序列。

1.3 蛋白質生物信息學分析及系統進化樹構建

使用DNAMAN軟件查找基因的開放閱讀框；使用在線軟件ExPASy-Protparam Tool(https：//web.expasy.org/protparam/)預測蛋白理化性質；TMHMM(http：//www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)軟件預測蛋白質是否跨膜；Signalp-4.1(http：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP-4.1/)預測蛋白質信號肽；Simple Modular Architecture Research Tool(http：//smart.embl-heidelberg.de/smart)工具預測蛋白結構域特征；SOMAP(https：//npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/secpred_sopma.pl)蛋白質二級結構預測。DNAMAN軟件進行氨基酸序列比對分析；利用MEG-A 7.0和Clustal 2.1軟件，采用鄰接法(Neighbor-Joining method，NJ)構建系統進化樹，B-ootsrap(1 000次)得出各分支置信度。

1.4 基因表達特征分析

2 結果與分析

2.1 ghrh基因的克隆和序列分析

梭鱸ghrh基因cDNA全長為1 100 bp(GenBank登錄號：MZ313192)，5′端非編碼區(5′-UTR)和3′端非編碼區(3′-UTR)序列分別為494 bp和180 bp，開放閱讀框為426 bp，編碼141個氨基酸，帶有典型的多聚腺苷酸化信號序列(ATTAAA)和多聚ploy(A)尾巴(圖1)；推導的ghrh蛋白質分子式為C701H1139N211O213S7，分子質量16.15 kDa，理論PI值為9.82，蛋白質的不穩定系數和親水系數分別為46.34、-0.637，是不穩定且親水性蛋白質；該蛋白無跨膜結構域，屬于胞外分泌蛋白；ghrh氨基酸序列N端含有1個18個氨基酸組成的信號肽序列(1～18 aa)和一個GLUCA保守結構域(65～91 aa)(圖1)；梭鱸ghrh蛋白質的二級結構由α螺旋、無規則卷曲和延伸鏈構成，α螺旋占比44.68%，無規則卷曲占比47.52%，延伸鏈占比7.8%(圖2)。

圖1 梭鱸ghrh 基因cDNA序列及其推導氨基酸序列Fig.1 cDNA sequence of S.lucioperca ghrh gene and deduced amino acid sequence下劃線表示ghrh前體蛋白信號肽，灰色陰影為GLUCA結構域；黃色陰影表示加尾信號，“*”表示終止密碼子。

圖2 梭鱸ghrh蛋白二級結構預測Fig.2 The second structure of S.lucioperca ghrh protein藍色：α螺旋，紅色：延伸鏈；黃色：無規則卷曲。

2.2 ghrh氨基酸序列比對及系統進化樹分析

梭鱸ghrh同其他脊椎動物ghrh氨基酸序列比對結果顯示，梭鱸與同為鱸科魚類的河鱸、黃金鱸同源性最高，相似性分別為95.04%、94.33%，親緣關系較近，同模式生物斑馬魚(Daniorerio)、小鼠(Musmusculus)的相似性分別為74%、41.54%，親緣關系較遠，且N端均有一個保守的結構域(圖3)。

圖3 梭鱸ghrh與其他物種氨基酸序列的同源性多重比較Fig.3 Multiple alignment of deduced amino acid sequences of S.lucioperca ghrh with the corresponding sequence from other species序列中相同氨基酸殘基用黑色背景表示，同源性超過75%用粉紅色背景表示，同源性超過50% 用淺藍色背景表示。

系統發育樹結果顯示，可分為魚類、哺乳類兩大支，其中梭鱸先與同為鱸科魚類的黃金鱸(Percaflavescens)、河鱸(P.fluviatilis)聚為一小支，后與橙胸鏢鱸(Etheostomaspectabile)、尖吻鱸(Latescalcarifer)、尼羅羅非魚(Oreochromisniloticus)、點帶石斑魚(Epinepheluscoioides)等鱸形目聚為一個分支，最后與鮭形目的虹鱒(Oncorhynchusmykiss)和大西洋鮭(Salmosalar)、鯉形目的斑馬魚和鯉魚(Cyprinuscarpio)聚為一大支，而小鼠和人(Homosapiens)等哺乳動物則聚為另一大支(圖4)。

圖4 不同物種間ghrh蛋白序列N-J系統進化樹Fig.4 N-J phylogenetic tree of ghrh protein sequence in different species

2.3 ghrh基因組DNA序列結構分析

根據NCBI數據庫梭鱸ghrh基因組序列可知，ghrh基因組DNA全長4 279 bp(GenBank登錄號：116037223)。通過比較研究斑馬魚、小鼠和人的基因組DNA結構，結合已克隆獲得的ghrh基因CDS區序列，發現梭鱸ghrh基因組包含5個外顯子和4個內含子，而斑馬魚、人和小鼠有4個外顯子和3個內含子。斑馬魚、小鼠和人的ghrh基因組長度分別是梭鱸的21倍、4.5倍和2.5倍(圖5)。梭鱸ghrh基因外顯子長度分別77、105、105、126、13 bp，內含子分別為740、528、115、134 bp。

圖5 ghrh基因組結構分析Fig.5 Genomic organization of ghrh

2.4 ghrh基因在不同組織中表達特征分析

本研究采用實時熒光定量PCR技術檢測了ghrh基因在梭鱸10個組織中的表達情況。ghrh基因在所有檢測組織中均有表達，表達量從高到低依次是腦、垂體、鰓、脾、胃、肝、腸、心、皮膚、肌肉。腦和垂體中的表達量顯著高于其他組織且差異顯著。皮膚和肌肉中表達量相當，差異不顯著(圖6)。

圖6 ghrh基因在梭鱸各組織的表達特征Fig.6 The expression of ghrh in different tissues of S.lucioperca.小寫字母不同表示差異顯著(P<0.05)。以肌肉為參考樣本，

2.5 ghrh基因在生長差異個體間表達分析

通過對梭鱸極端個體體長、體質量等生長數據進行比較分析，顯示梭鱸極大組個體的體長、體質量均極顯著高于極小組(圖7)；采用實時熒光定量PCR技術對比分析了ghrh基因在梭鱸生長極端差異兩組間的腦、肝和肌肉組織中表達情況，結果表明ghrh基因表達量均為極大組高于極小組，與生長性狀差異比較結果相符；其中該基因在腦組織中的表達量為極大組顯著高于極小組，但在肝、肌肉組織中差異不顯著(圖8)。

圖7 梭鱸大小個體間生長性狀比較分析Fig.7 Analysis of extreme individual growth traits of S.lucioperca**：極顯著性差異(P<0.

圖8 ghrh 基因在梭鱸大小個體間的差異表達分析Fig.8 The different expression level of ghrh in extreme individuals of S.lucioperca.*：顯著性差異(P<0.05)；ns：無顯著差異。以極大組肝為參考樣本，

3 討論

3.1 ghrh基因序列特征的生物信息學分析

ghrh最主要的生物學功能是促進垂體中生長激素的合成和釋放[23]。本研究中梭鱸ghrh基因N端存在一個保守的GLUCA結構域(65～91aa)，具有典型的胰高血糖素類似激素的特征，該結構域是發揮生物學活性的重要位點。多重氨基酸序列比對結果顯示，哺乳動物和魚類都存在GLUCA結構域，這表明該結構域在不同物種間具有高度保守性。系統進化樹分析顯示，梭鱸ghrh的氨基酸序列在進化上與同為鱸科魚類的黃金鱸、河鱸親緣關系最近且聚為一支，這表明該基因在進化的過程中較為保守；而其他的鯉形目、鮭形目、哺乳動物各聚為一支，推測與它們核苷酸變異大且親緣關系較遠有關[24]。這與傳統形態學分類較為一致，該發育系統進化樹較真實地反映了該物種進化的關系。基因結構比較分析顯示，梭鱸ghrh基因有5個外顯子和4個內含子，這與大口黑鱸(Micropterussalmoides)[25]、草魚(Ctenopharyngodonidella)[26]的外顯子和內含子數目一致。斑馬魚、人和小鼠有4個外顯子和3個內含子，這與梭鱸外顯子數目不一致，這表明ghrh基因結構組成具有物種特異性，可能與物種進化速率不同有關。

3.2 ghrh基因在不同組織中的表達分析

ghrh基因作為生長軸上的關鍵生長調控因子，其在組織中的分布已有一些在不同物種間的研究。如在哺乳動物中，ghrh基因主要在下丘腦和大腦中高表達，在后腦中低表達[27]。金魚(Carassiusauratus)[28]、大口黑鱸[25]中ghrh表達模式與哺乳動物相似，主要在大腦中高表達。這與本研究中梭鱸ghrh在腦中表達水平最高的結果一致，這表明ghrh對魚類神經內分泌系統有重要調節作用。除腦以外，ghrh基因在梭鱸的垂體、心、肝、肌肉、皮膚、鰓、腸等其他組織中均有表達且具有組織表達差異性，而布氏鯧鲹(Trachinotusblochii)[5]、大刺鰍(Mastacembelusarmatus)[6]、露斯塔野鯪(Labeorohita)[29]等魚類在腦、肌肉、肝、鰓等少數組織中有表達，可能是物種間的差異導致表達模式不同。本研究ghrh基因在梭鱸垂體中表達量較高，然而在點帶石斑魚[8]垂體中不表達，本研究結果與這不一致，推測本研究一齡梭鱸正處于生長旺盛時期，需通過垂體中ghrh表達產物刺激垂體釋放大量的gh來維持魚類的生長需要。本研究中梭鱸ghrh基因在鰓中表達量也較高，這與牙鲆(Paralichthysolivaceus)[7]的研究結果一致，推測ghrh基因可能通過參與滲透壓調節等生理功能從而調控魚類生長，具體機理還需進一步深入研究。

3.3 ghrh基因在生長差異個體間表達分析

魚類的生長主要依賴體內的生長激素，而生長激素的產生受下丘腦分泌的ghrh影響，研究表明注射外源ghrh6 h后可顯著提高大刺鰍垂體中gh的表達水平，ghrh對魚類生長發育起正向調控作用[6]。RAM等[9]研究發現極大組鯰(Clariasmagur)腦中ghrh基因表達量高于極小組，林明德等[10]研究發現快速生長的褐點石斑魚(E.fuscoguttatus)F1子代腦中ghrh基因表達量高于生長慢速的親本。這與本研究中梭鱸極大組腦中ghrh基因表達量顯著高于極小組的結果相一致(P<0.05)，推測ghrh通過神經內分泌系統影響魚類的生長速度。與之相反的是，JI等[12]研究發現9～12月齡半滑舌鰨(Cynoglossussemilaevis)在生長慢的雄魚腦中ghrh的表達量顯著高于生長快的雌魚(P<0.05)，JIANG等[30]研究發現金錢魚(Scatophagusargus)生長慢的雄魚下丘腦中ghrh基因表達量顯著高于生長快的雌魚(P<0.05)，這一結果的出現可能是gh的缺乏導致雄魚中產生負反饋而調節ghrh的高表達。以上研究說明了生長發育是復雜的生物學過程，需要更多相關基因共同的調節。

肝是促進魚類生長重要的靶器官，ghrh通過刺激垂體釋放gh，gh通過與肝細胞表面生長激素受體結合，直接促進細胞生長，或通過啟動細胞內信號傳導機制誘導igfs表達間接促進組織細胞生長，進而促進魚類生長[23]。RAM等[31]研究發現極大組鯰魚肝中ghrh基因表達量高于極小組，這與本研究中梭鱸極大組肝中ghrh基因表達量顯著高于極小組的結果相一致，這表明肝中ghrh的表達水平也可影響魚類的生長速度。魚類的生長主要依賴肌肉質量的增加，ghrh基因可以促進肌肉組織的增殖與分化，從而促進動物自身的生長與發育。戴建威等[31]研究發現將慢病毒載體介導的ghrh基因注射到小鼠肌肉組織，促進體內gh釋放，小鼠的日增重得到了顯著性的提高。在本研究中，ghrh基因在極大組肌肉組織中的表達量要顯著高于極小組，這表明ghrh基因在梭鱸肌肉生長發育過程中發揮重要作用。綜上所述，梭鱸極端個體間各組織ghrh基因表達水平與梭鱸的生長性狀呈正相關，ghrh對梭鱸的生長發育發揮著重要作用。因此，ghrh基因在梭鱸的分子育種中可作為生長性狀研究的候選基因進行應用。