獸用疫苗生產中支原體污染檢測及預防

文│康一嵐 徐慧琳 楊代蓉 魏嘉 劉玉靜 申茂欣 趙同淵 夏娜*（青島易邦生物工程有限公司）

在獸用疫苗生產的過程中，特別是對細胞培養過程中，極易被支原體污染，嚴重地影響了疫苗的質量及安全，對于普通疫苗和細胞生產活毒疫苗的污染，會給疫苗生產商或使用不合格疫苗的養殖戶帶來極大的經濟損失，同時也不利于畜禽疾病防控工作的順利開展。其中支原體是疫苗生產過程中比較常見的微生物，而造成支原體污染的原因也較多，工作環境、培養基、被污染的細胞、試驗器材等都可能造成支原體的污染，從而使疫苗質量下降，安全性及免疫效果難以達到標準。因此，建立快速有效的支原體檢測方法，可以有效地檢測出支原體污染，避免給后續過程帶來更嚴重的損失，如今檢測支原體污染的方法很多，培養法、DNA熒光染色法、酶聯免疫吸附試驗（EILSA）方法、聚合酶鏈式反應（PCR）等方法，都被廣泛運用于檢測支原體污染或進行初步篩選，保證后續疫苗的生產過程。同時要結合生產實際，針對獸用疫苗支原體污染的主要來源制定出科學有效的預防措施，確保獸用疫苗無支原體污染，從源頭杜絕支原體污染給獸用疫苗生產帶來的嚴重影響，保證獸用疫苗的質量、安全及效果。

一、支原體的特點

支原體屬于原核微生物，是能夠進行自我復制的最小原核生物，沒有細胞壁，結構簡單，大小在細菌和病毒之間，可以通過細菌過濾器。對熱十分敏感，在偏堿環境中生存且對酸性環境抵抗力差，一般抗生素不敏感。若動物感染后，其毒株通過特殊結構黏附在細胞膜上，引起結構改變，導致宿主細胞免疫反應異常，會引起疾病的發生。

二、支原體污染來源

1.生產用原材料污染源。在疫苗生產過程中所用原材料污染源要十分注意，盡可能減少疫苗污染支原體的風險，在獸用疫苗生產中，若是用到動物或雞胚時，不能因節省成本隨意購買動物或雞胚，這樣難以保證疫苗的質量及安全，其次在使用動物的臟器或組織制備原代細胞或是組織時，也要對來源進行規范及嚴格要求，否則支原體污染則難以控制。

2 .細胞和種毒支原體污染。細胞及種毒在獸用疫苗生產中十分關鍵，是疫苗質量及效果的決定因素。其中細胞的支原體污染非常嚴重，據統計，在細胞培養過程中被支原體污染的風險高達50%～60%，也是細胞培養中的一大難題，常見的污染細胞的支原體主要有口腔支原體、唾液支原體、萊氏無膽甾支原體等人源、豬源和牛源三類，而且已有的細胞系也有30%～50%已被支原體污染，雖然在細胞培養中難以發現，但因支原體傳染性高，易發生交叉污染，若是細胞株來源不純或運輸保存過程中被污染極易將支原體引入，而引入支原體污染源后，會造成細胞株被感染的現象，對疫苗的生產產生極大影響；其次若是在種毒過程中感染了支原體，則會出現逐級放大的效果，會嚴重影響疫苗的質量。

3.培養血清及胰酶支原體污染。使用疫苗的生產中，血清和胰酶作為其中不可缺少的培養細胞的主要材料，而在疫苗生產過程中常用的是動物血清，也是細胞培養中不可或缺的天然培養基，動物血清也是潛在支原體污染的來源，而且極易被支原體污染，被污染后不能用除菌過濾膜過濾支原體。而且如今血清的規范及要求還沒有相應的標準，不同廠家的血清來源不同，工藝及質量也就有差別，特別是血清中的有效成分及支原體狀況存在較大差距，因此培養血清也是支原體污染的重要來源；其次胰酶也是用于疫苗生產過程中細胞培養時傳代、消化所需，一般從羊、牛等動物胰腺取得，也非常容易污染支原體，而后會污染細胞，對疫苗的質量及安全也存在較大支原體污染風險。

4.培養基支原體污染。培養基是細胞培養過程中重要的原材料，培養基的很多成分其來源都是動物性產品，對此培養基中成分的優劣影響著培養基的好壞，進一步對細胞培養產生影響，而培養基也極易被支原體污染或是在培養過程中被污染或是在生產過程中被污染，對此在購買培養基時就不能因節約成本購買來源不清、說明不清的培養基，要杜絕培養基產品的支原體污染風險，減少疫苗生產過程中支原體感染的風險。

5.器材及人員支原體污染。在獸用疫苗生產過程中用到的器材及生產人員支原體污染在疫苗生產中要尤為重視，特別是在細胞培養過程中用到培養器皿及培養箱的會對細胞的培養產生影響，特別是氣體、溫濕度、pH值和生長密度等都會給支原體生長繁殖的空間，進而更容易污染細胞。器材生產人員在培養細胞或在進行疫苗生產的其他步驟中沒有注意環境及試驗操作，導致細胞被污染，造成疫苗的質量及安全不達標。

6.環境支原體污染。在疫苗生產的過程中對環境的要求尤為重要，需要在無菌的環境中進行細胞培養，而超凈工作臺就是培養細胞時試驗的區域，對于沒有滅菌完全的超凈工作臺，支原體可以在其表面存活4～6天，在進行細胞培養操作過程中進行感染。被感染后的細胞難以通過傳代或過濾去除支原體，對此在環境中要在試驗前后進行消毒滅菌，保證環境的無菌。

三、支原體檢測的方法

在疫苗生產過程中受到較多因素影響，易導致支原體污染，對此就要對其進行支原體檢測，排除被污染的可能，就需要借助相關的檢測技術進行支原體檢測，常用的方法是直接培養法、DNA熒光染色法，酶聯免疫吸附試驗，PCR檢測法等方法進行檢測。

1.直接培養法。直接培養法是檢測支原體的標準方法。是把樣品接種到支原體培養基上進行培養，并通過觀察液體培養基的顏色變化或是固體培養基上是否生長支原體菌落進行判斷，但培養法所需培養時間較長，要3～4周左右的時間，其次用培養法不能在同一培養基中檢測出所有的支原體類型，該方法常用于對種毒或疫苗成品的支原體檢測。

2.DNA熒光染色法。DNA熒光染色法，是把要檢測的樣品接種在指示細胞中進行培養，然后用特異性熒光染料進行染色，再用熒光顯微鏡進行觀察，通過附著在細胞表面的支原體DNA的著色情況判斷該樣品是否被支原體污染。該方法用時短，可進行多個樣品檢測，還能檢測出使用直接培養法難以檢測出的支原體類型，對此可以用該方法在配苗前初步篩選，去除污染樣品，進一步減少疫苗生產中產生的損失，保證疫苗的質量及安全。根據研究發現DNA熒光染色法比直接培養法更為敏感、方便，耗時短、準確穩定。但使用DNA熒光染色法要注意對細胞源疫苗或細胞培養過程中的檢測，因細胞核酸碎片會對檢測產生影響。

3.酶聯免疫吸附試驗。酶聯免疫吸附試驗即ELISA檢測法，對診斷支原體是較方便和準確的方法之一，常見的ELISA檢測法有間接法和抗原競爭法等，檢測支原體都有較好的特異性及敏感性，并且可以一次性進行多樣品檢測，目前ELISA檢測法已經被廣泛用在獸醫學領域，并且成為檢測支原體的常規方法之一，一般是通過比色法得出相應的結果進一步來判定是否有支原體污染的情況。

4.聚合酶鏈式反應（PCR）檢測法。PCR方法是一種DNA復制的體外擴增方法，由于支原體生長緩慢對營養環境要求較高，對支原體直接培養法檢測還有一定局限性，而PCR檢測法相對于直接培養法更為快速、敏感，并且在獸用疫苗的生產過程中推廣及應用。其中的巢式PCR檢測法是在普通PCR檢測方法上進行優化改進的，通過巢式PCR引物擴增后存在的目的片段情況進行合理判斷，并可以對支原體類型進行準確的分析及判斷，進一步對污染源進行判斷。而實時熒光定量PCR技術已經在多個領域進行運用，通過熒光信號變化對PCR擴增反應的Ct值和標準曲線進行定量分析，該方法靈敏、重復性高，但標準品難以獲得、檢測成本較高等因素影響，限制了該方法的應用。

四、支原體污染預防

在獸用疫苗生產過程中的各個環節都有被支原體污染的可能，對此就需要在疫苗生產的各個環節把好質量，并進行檢測，排除支原體污染的風險。

1.把好材料關。在疫苗生產過程中所運用到的材料，有雞胚、動物、細胞及培養細胞所用的血清、胰酶、培養基等都有存在支原體污染的可能，對此在疫苗生產過程中就需要保證材料的純凈，同時要對動物、雞胚、細胞進行檢測，排除支原體污染的可能，如果條件允許可以使用無支原體污染的SPF動物及雞胚，保證試驗用動物及雞胚無污染；其次在細胞培養過程中對細胞進行檢測及培養細胞所用的試劑儀器要進行無菌配制或高壓蒸汽滅菌，減少支原體污染的可能，同時也要保證血清和培養液等試劑的成分及來源，從源頭減少支原體污染風險。

2.優化環境關。在疫苗生產過程，生產環境尤為重要，要對生產環境定期消毒滅菌，并對生產環節中可能帶來污染來源的路徑進行嚴格把控，避免交叉感染。其次要對使用的儀器進行高壓蒸汽滅菌或紫外消毒滅菌，確保生產環境得到充分徹底的消毒滅菌，并保證進入生產空間的所有物品進行消毒或紫外照射，保證生產環境不會被支原體污染。

3.嚴格把控生產關。獸醫疫苗的生產中，嚴把生產關對支原體污染的防控非常重要。首先在生產中要加強對人員的管理，嚴格要求所有人員按照規范進行操作，減少支原體污染的可能；其次要強化在生產中的消毒滅菌，并進行檢測，防止支原體通過器具、物品進行污染；同時要合理地使用抗生素，選擇對支原體有抑制作用的抗生素，可添加在細胞培養基或胰酶中，減少支原體污染細胞，給疫苗生產帶來更大的風險。

五、結語