新羌防劑抗流感退熱的藥效機制探索

賈丹， 張梓佳， 馮毅凡， 李衛民， 周欣欣

（1.廣州醫藥研究總院有限公司，廣東廣州 510000；2.廣州中醫藥大學，廣東廣州 510060；3.廣東藥科大學，廣東廣州 510060）

流行性感冒（簡稱“流感”）是由流感病毒（甲型流感病毒、乙型流感病毒等）所引起，以發熱、頭痛、咳嗽、鼻塞、噴嚏、咽痛、無力等癥狀為主要臨床表現[1]，具有傳染性強、病程較長且發熱癥狀重的特點。本病當歸屬于中醫學“外感熱病”“疫病”范疇。新羌防劑處方是北京中醫藥大學史利卿教授針對“外感熱病”，以中醫起效迅速、療效顯著的“汗法”為治療法則[2-4]，在羌防劑如九味羌活丸、荊防敗毒散等基礎上篩選、合并，組成的中藥復方制劑，包括野菊花、青蒿、荊芥穗、香薷、羌活、防風、蒼術、胡椒、桂枝、知母、青風藤和甘草等12 味藥材，具有祛邪透毒、辛散解表、祛邪解表功效[5-6]。傳統水煎方法對中藥內親脂性的芳香揮發有效成分提取不完全，且揮發性成分遇高溫易被分解破壞，而采用超臨界CO2萃取的優勢主要是根據CO2超臨界狀態的低溫、親脂性特點將組方的芳香揮發有效成分充分提取[7]。本課題組相關新羌防劑的研究已取得國家藥監局臨床研究受理（受理號：CXL230005）并申請了處方及工藝專利（申請號：202110862668.7）。本研究是依據臨床有效處方進行的創新中藥新藥研究，主要針對流感的核心癥狀，開展新羌防劑抗病毒、解熱功效[8-9]解析，進行超臨界CO2萃取工藝與水煎工藝的藥效對比研究，以期為新羌防劑治療流感的新藥開發提供藥效證據支持，現將研究結果報道如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物210 只SPF 級BALB/c 小鼠，雌雄各半，體質量14～16 g，購自湖南斯萊克景達實驗動物有限公司[生產許可證號：SCXK（湘）2019-0004]，飼養于湖南省普瑞瑪藥物研究中心有限公司病原微生物實驗室（BSL-Ⅱ），實驗室備案編號：長衛計實備字（2021）第B010 號，實驗動物使用許可證號：SYXK（湘）2020-0015。276 只SD 大鼠，雌雄各半（雄性：170.0 ～210.0 g；雌性：140.0～180.0 g），購自湖南斯萊克景達實驗動物有限公司[生產許可證號：SCXK（湘）2019-0004]，飼養于廣州醫藥研究總院有限公司SPF級動物房[SYXK（粵）2018-0003]。動物倫理審批單位：廣州醫藥研究總院有限公司，倫理編號：IA-PD2020034。

1.2 病毒株H3N2 甲型流感病毒（A/Cakifornia/2/2014），由美國ATCC 提供；乙型流感病毒（ATCCVR-1938），由美國ATCC 提供。以上病毒均在病原微生物實驗室[BSL-Ⅱ，實驗室備案編號：長衛計實備字（2021）第B010 號]培養和擴增。

1.3 藥物、試劑與儀器連花清瘟顆粒（北京以嶺藥業有限公司，批號：2010027）；磷酸奧司他韋膠囊（宜昌東陽光長江藥業股份有限公司，批號：0222001054）；對乙酰氨基酚片（中美天津史克制藥有限公司，批號：19080525）；布洛芬顆粒（湖北亨迪藥業股份有限公司，批號：20210104）。脂多糖（LPS，美國Sigma 公司，批號：DH183-1）；干酵母（安琪酵母股份有限公司， 批號：154A202007）。血氣生化多項測試卡片（CG4+Cartridge）、i-STAT 300G 血氣檢測儀（ABBOTT 公司）；MC-3B 電子體溫計[歐姆龍（大連）有限公司]；URIT-910Cplus 電解質分析儀（桂林優利特公司）。

1.4 超臨界CO2萃取工藝制備新羌防劑將12 g青風藤粉碎為粗粉后與9 g 知母和9 g 甘草混合用70%乙醇回流提取2 次，第1 次為1 h，第2 次為40 min，合并提取物。將野菊花12 g、青蒿12 g、荊芥穗9 g、香薷9 g、羌活9 g、防風9 g、蒼術9 g、胡椒6 g 和桂枝6 g 共9 味藥材混合研磨為20 ～60目粗粉，進行超臨界CO2萃取后加入0.35倍95%乙醇作為改性劑，繼續采用超臨界CO2萃取工藝提取其中的芳香揮發性成分，55 ～60 ℃低溫濃縮后合并2 次萃取提取物。超臨界CO2萃取工藝參數為：萃取壓力29 MPa，萃取溫度45 ℃；分離Ⅰ壓力9 MPa，溫度50 ℃；分離Ⅱ壓力5 MPa，溫度35 ℃。萃取1 h。然后將乙醇提取物與萃取提取物混合為新羌防劑。另外，將新羌防劑采用水煎煮方法提取設置為水煎工藝（CGSN-01）組。

1.5 流感病毒感染小鼠模型實驗方法

1.5.1 分組與給藥 BALB/c 小鼠210 只，按性別和體質量隨機分為8組，分別為正常對照組，模型對照組，磷酸奧司他韋膠囊組（0.02 g·kg-1·d-1），連花清瘟顆粒組（0.5 g·kg-1·d-1），新羌防劑低、中、高劑量組[3.6（相當于臨床等效劑量）、7.2、14.4 g（生藥）·kg-1·d-1]，CGSN-01對照組[14.4 g（生藥）·kg-1·d-1]，每組26 只。小鼠給藥劑量均按成人平均體質量60 kg 計，根據人-小鼠體表面積法換算。各組小鼠按20 mL·kg-1經口灌胃給予相應濃度的藥液，正常對照組和模型對照組給予等體積的純水，每日1次，連續灌胃7 d。

1.5.2 甲型流感病毒或乙型流感病毒感染小鼠模型構建 于首次給藥前2 h 采用乙醚輕微麻醉各組小鼠，除正常對照組外，其他各組小鼠經鼻滴入H3N2 甲型流感病毒液含5 個半數致死量（5LD50）或乙型流感病毒原液5LD50，100 μL/只，正常對照組經鼻滴入等體積的空白培養基。

1.5.3 樣本采集與檢測方法 ①自感染造模當日開始，連續觀察7 d，記錄各組動物體質量；②于給藥后24、48 h及給藥后第7天，分別從各組中隨機選取8、8、10只動物，雌雄各半，頸椎脫臼安樂死，解剖取肺臟后稱質量，按肺指數（mg·g-1）=肺濕質量（mg）/體質量（g），計算肺指數；③于給藥后24、48 h，分別從各組中隨機選取8只動物，雌雄各半，取肺組織進行血凝滴度檢測；④末次給藥后頸椎脫臼安樂死各組剩余小鼠，解剖取肺臟，經10%中性福爾馬林灌注固定后，石蠟包埋、切片、蘇木素-伊紅（HE）染色，置于光鏡下觀察肺臟組織病理學變化，從炎性、血性滲出，肺泡上皮細胞破壞及肺支架塌陷、肺泡炎癥細胞浸潤方面進行評分。具體評分標準[10]如下：無異常，計為0 分；輕度，計為1 分；中度，計為2 分；重度，計為3分。將每只動物各項評分累加進行統計。

1.6 發熱大鼠模型實驗方法

1.6.1 LPS 誘發大鼠發熱模型 將檢疫合格SD 大鼠進行體溫測定，剔除連續2次體溫均值偏差較大的動物。將篩選后的動物按體溫、性別，隨機均衡分為正常對照組，模型對照組，新羌防劑低、中、高劑量組[0.40（相當于臨床等效劑量）、0.80、1.60 g（浸膏）·kg-1·d-1]，連花清瘟顆粒組（1.62 g·kg-1·d-1），對乙酰氨基酚片組（0.045 g·kg-1·d-1）、CGSN-01 對照組[1.83 g（浸膏）·kg-1·d-1]，每組10 只，雌雄各半。大鼠給藥劑量均按成人平均體質量60 kg 計，根據人-大鼠體表面積法換算。實驗當日進行肛溫測定，每只SD 大鼠測定體溫2 次，取其平均值作為基礎體溫。測量完成后，除正常對照組外，其余各組大鼠于頸背部皮下注射LPS 溶液（劑量150 μg·kg-1，注射體積2 mL·kg-1）；正常對照組注射等體積生理鹽水。LPS注射造模后即刻灌胃給藥。正常對照組和模型對照組給予等體積純水灌胃。于給藥后1、2、3、4、5、6、7、8 h 測量各組大鼠的肛溫，以基礎體溫為基線，計算給藥后1 ～8 h各組大鼠體溫的變化值[11-13]。

1.6.2 干酵母誘發大鼠發熱模型 將檢疫合格的SD 大鼠進行體溫測定，剔除連續2 次體溫均值偏差較大的動物，隨機分為正常對照組和造模組。正常對照組皮下注射冰凍無菌生理鹽水，造模組皮下注射20%干酵母生理鹽水混懸液10 mL·kg-1，造模后每小時測量體溫，直腸溫度上升1 ℃以上為造模成功[10-12]。將造模組大鼠根據肛溫均衡隨機分為模型對照組，新羌防劑低、中、高劑量組[0.40（相當于臨床等效劑量）、0.80、1.60 g（浸膏）·kg-1·d-1]，連花清瘟顆粒組（1.62 g·kg-1·d-1），對乙酰氨基酚片組（45 mg·kg-1·d-1）以及CGSN-01 對照組[1.83 g（浸膏）·kg-1·d-1]，每組14 只，雌雄各半。分組后立即灌胃給藥，正常對照組和模型對照組給予等體積純水灌胃。給藥后1、2、3、4、5、6 h 測量大鼠肛溫，以基礎體溫為基線，計算各時間點每組大鼠的體溫變化值。末次體溫測量后，將大鼠深度麻醉，腹主動脈采血，應用血氣分析儀檢測動脈血液pH、動脈血二氧化碳分壓（PCO2）、動脈血氧分壓（PO2）、動脈血氧飽和度（SO2）。

1.7 對大鼠腸系膜微循環作用影響的實驗方法

1.7.1 分組與給藥 將84只檢疫合格SD 大鼠（雌雄各半）按體質量、性別隨機分為正常對照組，新羌防劑低、中、高劑量組[0.40（相當于臨床等效劑量）、0.80、1.60 g（浸膏）·kg-1·d-1]，連花清瘟顆粒組（1.62 g·kg-1·d-1），布洛芬顆粒組（0.054 g·kg-1·d-1），CGSN-01 對照組[1.83 g（浸膏）·kg-1·d-1]。每組12 只，雌雄各半。

1.7.2 檢測方法 各組大鼠根據實驗分組設定進行灌胃給藥，連續給藥3 d。末次灌胃給藥1 h 后，迅速腹腔注射大鼠體質量5%體積的熒光素鈉注射液，2 s 內快速推入，于注射后5、15、30、45、60 min頸總靜脈取血。血液樣本以3 000 r/min離心（離心半徑100 mm）15 min，低溫避光環境下分離血漿，590 nm 波長處測定吸光度（OD）值。繪制熒光素鈉標準曲線，根據曲線公式計算各組大鼠靜脈中的熒光劑含量，分析熒光素鈉的濃度變化以反映血液體微循環速度[14-15]。

1.8 統計學方法采用GraphPad Prism 8.0 軟件進行統計分析和繪圖，所有數據結果以均數± 標準差（x±s）表示。先進行組間方差分析（F-test），符合正態分布與方差齊，多組間比較進行單因素方差分析（One-way ANOVA）或雙因素方差分析（Twoway ANOVA）分析。以P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 新羌防劑改善流感病毒感染模型小鼠的感染癥狀

2.1.1 體質量 表1 結果顯示：于給藥后第2 ～5 天，與正常對照組比較，H3N2 甲型流感病毒感染的模型對照組小鼠體質量顯著下降（P＜0.05 或P＜0.01）。與模型對照組比較，連花清瘟顆粒組給藥后第2 天體質量顯著升高（P＜0.05），新羌防劑中劑量組給藥后第3 ～5 天體質量顯著升高（P＜0.05 或P＜0.01）。提示H3N2 甲型流感病毒感染造成小鼠體質量下降，新羌防劑可緩解小鼠感染后的體質量下降。

表1 新羌防劑對H3N2甲型流感病毒感染小鼠體質量的影響Table 1 Effect of Xinqiangfang Agent on body mass in mice infected with H3N2 influenza A virus（±s，鼠數=26只）

表1 新羌防劑對H3N2甲型流感病毒感染小鼠體質量的影響Table 1 Effect of Xinqiangfang Agent on body mass in mice infected with H3N2 influenza A virus（±s，鼠數=26只）

注：①P＜0.05，②P＜0.01，與正常對照組比較；③P＜0.05，④P＜0.01，與模型對照組比較

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表2結果顯示：于給藥后第2 天，乙型流感病毒感染的模型對照組小鼠體質量較正常對照組顯著下降（P＜0.01）。與模型對照組比較，各給藥組小鼠給藥第1 ～7 天體質量均無顯著改善（P＞0.05）。

表2 新羌防劑對乙型流感病毒感染小鼠體質量的影響Table 2 Effect of Xinqiangfang Agent on body mass in mice infected with influenza B virus（±s，鼠數=26只）

表2 新羌防劑對乙型流感病毒感染小鼠體質量的影響Table 2 Effect of Xinqiangfang Agent on body mass in mice infected with influenza B virus（±s，鼠數=26只）

注：①P＜0.01，與正常對照組比較

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2.1.2 肺指數 表3 結果顯示：與正常對照組比較，模型對照組小鼠感染H3N2 甲型流感病毒后24 h、48 h、7 d 肺指數均顯著增大（P＜0.05 或P＜0.01）。與模型對照組比較，磷酸奧司他韋膠囊組、連花清瘟顆粒組和新羌防劑低、中、高劑量組小鼠給藥后48 h 肺指數均顯著降低（P＜0.05 或P＜0.01），至給藥后第7 天，磷酸奧司他韋膠囊組、連花清瘟顆粒組和新羌防劑中、高劑量組小鼠肺指數仍顯著降低（P＜0.05或P＜0.01）。

表3 新羌防劑對H3N2甲型流感病毒感染小鼠肺臟指數的影響Table 3 Effect of Xinqiangfang Agent on indexes of lungs in mice infected with H3N2 influenza A virus（±s）

表3 新羌防劑對H3N2甲型流感病毒感染小鼠肺臟指數的影響Table 3 Effect of Xinqiangfang Agent on indexes of lungs in mice infected with H3N2 influenza A virus（±s）

注：①P＜0.05，②P＜0.01，與正常對照組比較；③P＜0.05，④P＜0.01，與模型對照組比較；⑤P＜0.01，與CGSN-01對照組比較

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表4結果顯示：與正常對照組比較，模型對照組小鼠感染乙型流感病毒后24 h、48 h、7 d 肺指數均顯著增大（P＜0.01）。給藥后24 h，磷酸奧司他韋膠囊組、連花清瘟顆粒組和新羌防劑低、高劑量組肺指數較模型對照組均顯著減小（P＜0.05或P＜0.01）；給藥后48 h，磷酸奧司他韋膠囊組肺指數較模型對照組顯著減小（P＜0.05）；給藥后第7 天，與模型對照組比較，磷酸奧司他韋膠囊組，連花清瘟顆粒組，新羌防劑低、中、高劑量組，CGSN-01 對照組肺指數均顯著減小（P＜0.01）。提示新羌防劑能顯著抑制小鼠感染H3N2甲型流感病毒后的肺部病變，且在同等劑量下，新羌防劑藥效優于CGSN-01。

表4 新羌防劑對乙型流感病毒感染小鼠肺臟指數的影響Table 4 Effect of Xinqiangfang Agent on indexes of lungs in mice infected with influenza B virus （±s）

表4 新羌防劑對乙型流感病毒感染小鼠肺臟指數的影響Table 4 Effect of Xinqiangfang Agent on indexes of lungs in mice infected with influenza B virus （±s）

注：①P＜0.01，與正常對照組比較；②P＜0.05，③P＜0.01，與模型對照組比較；④P＜0.01，與CGSN-01對照組比較

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2.1.3 肺內血凝效價 表5 結果顯示：與正常對照組比較，模型對照組H3N2 甲型流感病毒感染后24、48 h 血凝效價顯著增加（P＜0.01）。給藥后24 h，磷酸奧司他韋膠囊組，連花清瘟顆粒組，新羌防劑中、高劑量組，CGSN-01 對照組血凝效價均顯著降低，與模型對照組比較，差異有統計學意義（P＜0.05或P＜0.01）；給藥后48 h，磷酸奧司他韋膠囊組，連花清瘟顆粒組，新羌防劑低、中及高劑量組血凝效價均顯著降低，與模型對照組比較，差異有統計學意義（P＜0.05或P＜0.01）。

表5 新羌防劑對H3N2甲型流感病毒感染小鼠肺內血凝效價的影響Table 5 Effect of Xinqiangfang Agent on Hemagglutination titer in mice infected with H3N2 influenza A virus（±s，鼠數=8只）

表5 新羌防劑對H3N2甲型流感病毒感染小鼠肺內血凝效價的影響Table 5 Effect of Xinqiangfang Agent on Hemagglutination titer in mice infected with H3N2 influenza A virus（±s，鼠數=8只）

注：①P＜0.01，與正常對照組比較；②P＜0.05，③P＜0.01，與模型對照組比較；④P＜0.05，與連花清瘟顆粒組比較；⑤P＜0.05，⑥P＜0.01，與CGSN-01對照組比較

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表6結果顯示：與正常對照組比較，模型對照組乙型流感病毒感染24、48 h 后血凝效價顯著增加（P＜0.01）。與模型對照組比較，給藥后24、48 h，磷酸奧司他韋膠囊組，連花清瘟顆粒組，新羌防劑低、中、高劑量組，CGSN-01 對照組血凝效價均顯著減小（P＜0.05 或P＜0.01）。提示新羌防劑能顯著抑制小鼠感染H3N2 甲型流感病毒和乙型流感病毒后的肺中病毒效價。

表6 新羌防劑對乙型流感病毒感染小鼠肺內血凝效價的影響Table 6 Effect of Xinqiangfang Agent on Hemagglutination titer in mice infected with influenza B virus（±s，鼠數=8只）

表6 新羌防劑對乙型流感病毒感染小鼠肺內血凝效價的影響Table 6 Effect of Xinqiangfang Agent on Hemagglutination titer in mice infected with influenza B virus（±s，鼠數=8只）

注：①P＜0.01，與正常對照組比較；②P＜0.05，③P＜0.01，與模型對照組比較

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2.1.4 肺組織病理學 表7、圖1結果顯示：正常對照組肺泡結構清晰、排列整齊；模型對照組可見肺泡間隔增寬，并伴有炎癥細胞浸潤。與正常對照組比較，模型小鼠H3N2 甲型流感病毒感染第7 天肺組織評分顯著增加（P＜0.05）。于給藥后第7 天，磷酸奧司他韋膠囊組，連花清瘟顆粒組和新羌防劑中、高劑量組肺組織病變較模型對照組均有不同程度的減輕。

圖1 新羌防劑給藥后第7天對H3N2甲型流感病毒感染小鼠肺臟組織病理學形態的影響（HE染色，×100）Figure 1 Effect of Xinqiangfang Agent on histopathologic features of lung tissue in mice infected with H3N2 influenza A virus on day 7 after administration（HE staining，×100）

表7 新羌防劑給藥后第7天對H3N2甲型流感病毒感染小鼠肺臟病理變化評分的影響Table 7 Effect of Xinqiangfang Agent on histopathologic scores of lungs in mice infected with H3N2 influenza A virus on day 7 after administration（±s，鼠數=8只）

表7 新羌防劑給藥后第7天對H3N2甲型流感病毒感染小鼠肺臟病理變化評分的影響Table 7 Effect of Xinqiangfang Agent on histopathologic scores of lungs in mice infected with H3N2 influenza A virus on day 7 after administration（±s，鼠數=8只）

注：①P＜0.01，與正常對照組比較；②P＜0.05，與模型對照組比較

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表8、圖2 結果顯示：與正常對照組比較，模型對照組小鼠乙流病毒感染第7天肺臟病變評分顯著增加（P＜0.05）；于給藥后第7 天，磷酸奧司他韋膠囊組、連花清瘟顆粒組和新羌防劑低、中、高劑量組肺部病變評分均顯著降低，與模型對照組比較，差異有統計學意義（P＜0.05）。

圖2 新羌防劑給藥后第7天對乙型流感病毒感染小鼠組織病理學形態的影響（HE染色，×100）Figure 2 Effect of Xinqiangfang Agent on histopathology of lungs in mice infected with influenza B virus on D7 after administration（HE staining，×100）

表8 新羌防劑給藥后第7天對乙型流感病毒感染小鼠肺臟病理變化評分的影響Table 8 Effect of Xinqiangfang Agent on histopathologic scores of lungs in mice infected with influenza A virus on day 7 after administration（±s，鼠數=8只）

表8 新羌防劑給藥后第7天對乙型流感病毒感染小鼠肺臟病理變化評分的影響Table 8 Effect of Xinqiangfang Agent on histopathologic scores of lungs in mice infected with influenza A virus on day 7 after administration（±s，鼠數=8只）

注：①P＜0.01，與正常對照組比較；②P＜0.05，與模型對照組比較

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2.2 新羌防劑具有顯著的解熱藥效

2.2.1 LPS 誘導發熱的大鼠模型 圖3 結果顯示：與正常對照組比較，LPS 造模后1 h 動物體溫開始上升，造模2 h 后與空白對照組比較有顯著差異（P＜0.05），5 h 到達發熱高峰（P＜0.01），并穩定持續至造模后8 h。與模型對照組比較，對乙酰氨基酚片組給藥后2 ～8 h、連花清瘟顆粒組給藥后4 ～8 h，新羌防劑低劑量組給藥后3 ～7 h、新羌防劑中劑量和高劑量組給藥后1 ～8 h、CGSN-01對照組給藥4 ～5 h 體溫均顯著降低。新羌防劑解熱藥效呈顯著的量-效關系。同時，在同等臨床擬用劑量的等效劑量下，新羌防劑低劑量解熱藥效的起效時間早于連花清瘟顆粒；同等臨床擬用劑量4 倍劑量下，超臨界CO2萃取的新羌防劑解熱效果優于水煎新羌防劑。

圖3 各組大鼠肛溫與造模前比較結果熱圖（±s，℃；鼠數=10只）Figure 3 Heat map of anal temperature results for each group of rats compared to pre-modelling（±s，℃；10 mice）

2.2.2 干酵母感染誘導發熱的大鼠模型 圖4、表9結果顯示：與正常對照組比較，干酵母誘發發熱造模后5 h 模型對照組大鼠平均體溫上升超過1.2 ℃，并穩定維持發熱狀態至造模后11 h，pH、PCO2、PO2、SO2值均無顯著性差異（P＞0.05）。連花清瘟顆粒組給藥后6 h 體溫顯著低于模型對照組，血液SO2（%）水平高于模型對照組（P＜0.05）。對乙酰氨基酚片組于給藥后1 h 體溫即顯著降低，血液pH 值升高、血液PCO2（%）水平降低（P＜0.01）。新羌防劑低劑量組給藥后4、6 h 體溫顯著低于模型對照組，血液PO2和SO2（%）含量高于模型對照組（P＜0.05）；新羌防劑中、高劑量組給藥后1 ～6 h 體溫均顯著低于模型對照組，且藥效穩定；新羌防劑高劑量組血液PCO2含量顯著降低，血液pH 值升高，與模型對照組比較，差異有統計學意義（P＜0.05）。結果表明新羌防劑解熱藥效呈顯著的量-效關系，同等臨床擬用量等效劑量下，新羌防劑解熱起效時間、藥效持久性以及對血氧的改善作用均優于連花清瘟顆粒組。新羌防劑解熱藥效持久性優于對乙酰氨基酚片。同等臨床擬用量4 倍給藥劑量下，超臨界CO2萃取的新羌防劑解熱效果優于水煎新羌防劑。

圖4 各組大鼠肛溫與造模前比較結果熱圖（±s，℃；鼠數=14只）Figure 4 Heat map of anal temperature results for each group of rats compared to pre-modelling（±s，℃；14 mice）

表9 干酵母感染誘導動物發熱模型血氧檢測結果Table 9 Blood oxygen assay results in a dried yeast infection-induced fever model（±s，鼠數=10只）

表9 干酵母感染誘導動物發熱模型血氧檢測結果Table 9 Blood oxygen assay results in a dried yeast infection-induced fever model（±s，鼠數=10只）

注：①P＜0.05，②P＜0.01，與模型對照組比較

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2.3 新羌防劑具有顯著促進大鼠腸系膜微循環速度的藥效圖5 結果顯示：與正常對照組比較，新羌防劑加速大鼠腸系膜微循環系統對腹腔內熒光素鈉注射液的吸收速率。正常對照組熒光素鈉檢測峰值在注射后60 min，新羌防劑低、中、高劑量組熒光素鈉檢測峰值分別出現在45 min、15 min、15 ～30 min，以此推測新羌防劑具有加速腸系膜微循環速度的功效，其藥效強度與給藥劑量呈現出較好的量-效關系。陽性對照藥布洛芬顆粒給藥后熒光素鈉檢測峰值提前至15 min。同等臨床擬用劑量的4 倍劑量下，超臨界CO2萃取的新羌防劑加速腸系膜微循環系統吸收速率的功效優于水煎新羌防劑。

圖5 各時間點靜脈血中熒光素鈉含量檢測結果熱圖（±s，鼠數=12只）Figure 5 Heat map of sodium fluorescein results in venous blood at various time points（±s，12 mice）

3 討論

新羌防劑是北京中醫藥大學史利卿教授總結多年臨床經驗確定的處方，并經多年的臨床驗證對流感有效后進行的復方中藥新藥開發。有研究按照流感處方組成進行藥材提取工藝設計，采用超臨界CO2萃取提取處方中藥材的有效物質芳香揮發性成分，經對10 個關鍵指標性成分如胡薄荷酮、麝香草酚、香荊芥酚、桂皮醛、胡椒堿、異歐前胡素、蒼術素等進行分析，指出超臨界CO2萃取提取效率明顯優于水煎工藝[16]。超臨界的低溫、親脂性特點較適合于解表中藥復方中芳香揮發有效成分的提取。本研究采用超臨界CO2萃取工藝，將新羌防劑的有效成分（芳香揮發性成分）充分提取，加強對風寒濕之邪的“透”和“解”，達到快速解除風寒濕之邪所致的高熱、惡寒等癥狀[17]，類似中醫“汗法”。

本研究分別采用H3N2 甲型流感病毒和乙型流感病毒感染BALB/c 小鼠，建立小鼠呼吸道感染模型，通過觀察模型小鼠的一般生理狀態、肺指數、肺內血凝效價及肺組織炎癥狀態，發現新羌防劑提取物具有顯著抗呼吸道病毒性感染的藥效。解熱實驗分別采用了體內注射脂多糖（LPS）、干酵母建立發熱動物模型[12]。在此研究的基礎上確認了新羌防劑具有快速且顯著的解熱效果，并在抗病毒感染、解熱藥效方面具有顯著的量效關系。

在對腸系膜微循環系統的研究中，通過分析腹腔熒光素鈉吸收速率，發現新羌防劑可顯著改善流感病毒引發的肺部感染及LPS和干酵母感染誘發的動物發熱癥狀，改善干酵母發熱模型血氧濃度的降低，明顯加速腸系膜對熒光素鈉的吸收速度，其藥效強度與給藥劑量呈現出良好的量效關系。結果亦提示羌防劑類抗流感中藥快速透毒、退熱的內在作用機制與其加速機體血液微循環、促“發汗”的功效密切相關。

新羌防劑的特點是采用了超臨界CO2萃取工藝。本研究采用超臨界CO2萃取工藝提取的新羌防劑的藥效實驗結果優于傳統水煎提取物。傳統水煎提取物雖有明確的臨床療效，但其整體療效不如超臨界CO2萃取物。對新羌防劑、中藥對照藥、化藥對照藥進行藥效對比，結果表明：采用超臨界CO2萃取工藝同等劑量（或低于臨床所需用量）的新羌防劑的抗病毒感染、解熱、加速微循環速度等作用顯著優于常規水煎工藝、已上市中成藥和化藥。

綜上所述，新羌防劑對流感病毒感染引發的相關癥狀如發熱等臨床核心癥狀具有快速退熱作用，顯著優于常規水煎工藝、已上市中成藥和化藥，其顯著的起效迅速的藥效與應用超臨界CO2萃取工藝密切相關。