負載紫杉醇的溫敏水凝膠對鼻咽癌的抑制作用

孫海力， 葉紀拓， 李紹霄， 吳秀

（溫州醫科大學附屬平陽醫院耳鼻喉科，浙江平陽 325400）

鼻咽癌是一種好發于中國南部省份、東南亞國家和北非地區的惡性腫瘤，近20%的鼻咽癌患者在確診時出現遠處臟器轉移[1]。癌癥復發和轉移是當前鼻咽癌患者死亡的主要影響因素。化療是鼻咽癌的重要治療手段，但鼻咽癌患者對化療藥物多存在一定的毒性反應和耐藥現象，鼻咽癌患者總體生存率提高緩慢[2]。因此，亟需一種安全而有效的治療方式以改善鼻咽癌患者的預后。腫瘤內注射抗癌藥物作為一種有前途的惡性腫瘤治療方法，具有給藥部位精準、持續的藥物釋放時間和較高的患者依從性等優點[3-4]，故藥物的負載系統成為研究熱點。

水凝膠是由交聯聚合物制備的高含水量材料，由于其特殊的三維網狀結構、良好的生物相容性和生物降解性，已被廣泛地應用于藥物的緩釋控釋技術中[5-6]。智能可注射水凝膠在生物醫學中的應用引起了極大的關注，這在很大程度上歸因其位點特異性藥物釋放行為和副作用小等優點[7]。熱敏水凝膠在室溫或更低溫度下是溶液狀態，能非常方便地裝載活細胞、蛋白質、酶或其他治療藥物用于注射治療[8]。隨著溫度升高至體溫附近時，水凝膠溶液可以轉變為非流動水凝膠，困在其中的藥物可以在目標部位釋放[9]。

殼聚糖（CS）作為一種天然聚合物，具有生物降解性、生物相容性、黏膜粘附性、無毒和特定的生物活性等獨特優勢，常用于水凝膠的制備。CS 上豐富的氨基和羥基官能團使其與交聯劑反應成為可能，從而原位形成特定的水凝膠[10]。β-甘油磷酸鈉（β-GP）是一種天然存在的磷酸鹽分子，作為FDA 美國食品藥品監督管理局批準的化合物，β-GP 可在生理環境中催化CS 溶液中的溶膠/凝膠轉變[11]。CS/β-GP 復合材料作為一種溫敏水凝膠，可延長藥物的釋放時間，顯示其作為藥物緩釋載體的巨大潛力[12]。除了用于裝載藥物/生物活性分子的可注射水凝膠外，CS/β-GP水凝膠還適用于組織工程領域[13]。本研究旨在將紫杉醇（PTX）與CS/β-GP 混合，以實現具有熱敏感性、生物相容性和生物降解性等綜合特性的可注射水凝膠，再將制備好的PTX/CS/β-GP 溫敏水凝膠用于體內外鼻咽癌的治療，探索該治療方式的療效和生物安全性，現將研究結果報道如下。

1 材料與方法

1.1 藥物、試劑與儀器紫杉醇注射液（規格：6 mg/mL，江蘇恒瑞醫藥股份有限公司生產，批號：H10980069）。脫乙酰度＞95%的中等分子量CS 和β-GP（浙江金殼生物化學有限公司，批號分別為：20140318C 和20150475C）；偶氮二異丁腈（AIBN）和乙酸（阿拉丁公司，批號分別為：A104255 和A433219）；所有培養基和細胞培養成分均購自美國Gibco 公司；四甲基偶氮唑鹽（MTT）試劑盒（上海碧云天生物公司，批號：C0009S）；Ki-67 抗體（美國Thermo Fisher 公司，批號：13-5699-82）；末端脫氧核苷酸轉移酶介導的dUTP 缺口末端標記（TUNEL）凋亡試劑盒（北京百奧萊博科技公司，批號：7E521C1）。紫外分光光度計（上海元析儀器有限公司）；S-3400I 型掃描電子顯微鏡（日本Hitachi 公司）。

1.2 水凝膠制備制備溶解在乙酸（0.1 mol/L）中的2%（m/V）CS 溶液和溶解在蒸餾水中的40%（m/V）β-GP溶液。將CS溶液和β-GP 溶液均冷卻至4 ℃，在攪拌下將β-GP 溶液滴加到CS 溶液中，并調節復合物的pH 值至7.4 左右，再將溫度升高到37 ℃制備水凝膠。將PTX 與CS/β-GP 水凝膠混合并攪拌1 h，制備負載PTX的水凝膠制劑（每毫升水凝膠含有2 mg PTX）。

1.3 水凝膠的低臨界轉變溫度（LCST）測定水凝膠的LCST 由紫外分光光度計測定。在540 nm 波長處檢測2%（m/V）的水凝膠在磷酸鹽緩沖液（PBS，pH=7.4）中的共聚物溶液在25 ～40 ℃之間的吸光度。LCST 定義為與初始吸光度相比，吸光度增加約50%時的溫度。

1.4 水凝膠的掃描電子顯微鏡（SEM）分析水凝膠經真空冷凍干燥，取干品斷面真空噴金后使用掃描電子顯微鏡進行水凝膠的表面結構分析。

1.5 體外藥物釋放研究在37 ℃條件下溫和搖動，將PTX/CS/β-GP 水凝膠轉移到PBS（pH=7.4）溶液中。在預定的時間間隔，收集2 mL 釋放介質并用2 mL 新鮮PBS（pH=7.4）補償。釋放介質中PTX 的含量通過紫外分光光度計在480 nm 波長處測定。根據“A= 0.024 26c+ 0.000 40”即可計算得到此時釋放介質中PTX 的質量濃度，進而計算得到累積釋放的PTX 質量。某一時刻PTX 的累積釋放率（cumulative release rate，CRR）按照以下公式計算：。式中：Mt代表t時刻PTX 的累積釋放質量，M0代表水凝膠中PTX 的總質量。

1.6 體外實驗

1.6.1 細胞培養 人鼻咽癌細胞系HNE1，購自美國模式培養物保藏所（American Type Culture Collection，ATCC）。HNE1 細胞用完全培養基（RPMI 培養基中添加10%胎牛血清、100 U/mL 青霉素和100 μg/mL 鏈霉素）于37 ℃的CO2培養箱中孵育，2 d傳代1次。

1.6.2 細胞毒性評估 采用MTT 法測定水凝膠對HNE1 細胞的毒性。按照“1.2”項制備水凝膠溶液，并將其添加到6孔培養板（1 mL/孔）中，37 ℃孵育過夜。凝膠形成后，用完全培養基（5 mL/孔）37 ℃浸泡凝膠24 h，用0.22 μm 過濾器過濾獲得的浸泡液。在96 孔培養板中以5×103個/孔的密度培養處于對數生長期HNE1 細胞，37 ℃、5% CO2條件下孵育24、48 h。待細胞生長至40%～50%底面積時，去除培養基并用200 μL 水凝膠滲濾液替換，再孵育24 h。之后去除培養基并用150 μL 新鮮培養基和50 μL MTT 溶液替換，孵育4 h 后去除培養基，加入200 μL DMSO 以溶解形成的甲臜晶體，培養板搖動15 min。使用酶標儀在570 nm 波長處讀取吸光度。

1.6.3 4’，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）染色法檢測細胞凋亡實驗 將載有PTX 的CS/β-GP 水凝膠溶液添加到6 孔培養板（1 mL/孔）中，37 ℃孵育以形成凝膠。在凝膠表面培養密度為5×105個/孔的HNE1細胞并孵育48 h，水凝膠用PBS洗滌3次，附著的HNE1 細胞用4%多聚甲醛固定10 min。水凝膠用PBS 洗滌3 次，然后將DAPI 添加到培養板上的細胞上并孵育5 min。通過熒光顯微鏡記錄熒光圖像。

1.7 體內抗癌實驗

1.7.1 動物 20 只無特定病原體（SPF）級雌性BALB/c 裸鼠，7周齡，體質量18～20 g，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司實驗動物生產許可證號：SCXK（京）2016-0011。所有動物實驗均已通過溫州醫科大學附屬平陽醫院倫理委員會審核（審批號：20220009），所有實驗程序均遵循《赫爾辛基宣言》。

1.7.2 分組、造模與干預 將2 × 106個HNE1 細胞皮下接種到裸鼠右前肢腋下，當腫瘤生長到大約100 mm3時，將荷瘤裸鼠隨機分為4 組，每組5 只裸鼠在腫瘤部位給藥如下：（1）空白組：BALB/c裸鼠皮下注射生理鹽水5 μL/g體質量；（2）CS/β-GP組：裸鼠皮下注射CS/β-GP 水凝膠5 μL/g 體質量；（3）PTX 組：裸鼠皮下注射PTX 混懸液5 μL/g 體質量，PTX 劑量為0.01 mg/g 體質量[14]；（4）PTX/CS/β-GP 組：裸鼠皮下注射PTX/CS/β-GP 水凝膠5 μL/g 體質量，PTX 劑量為0.01 mg/g 體質量。在給藥后第0、2、4、6、8 和10 天測量荷瘤裸鼠的體質量和腫瘤體積。第10 天處死裸鼠，測量腫瘤質量，然后收集腫瘤組織用于后續的實驗。

1.7.3 免疫組織化學實驗 腫瘤組織用5%甲醛固定過夜，采用梯度乙醇脫水法將腫瘤組織脫水后包埋在石蠟中，切片。采用SP 染色法進行免疫組織化學染色。Ki-67 陽性少數表達于細胞質中，大部分表達于細胞核中。隨機選擇20 個視野并在低倍鏡下拍照，采用Image-Pro Plus 6.0 圖像處理軟件分析Ki-67 在腫瘤組織中的積分光密度（IOD）值。

1.7.4 TUNEL法檢測移植瘤細胞凋亡 按TUNEL試劑盒說明書操作。細胞核固縮、染色體凝集成塊或邊集、呈棕褐色染色者為凋亡細胞，采用Image-Pro Plus 6.0 圖像處理軟件分析TUNEL 在腫瘤組織中的積分光密度（IOD）值。

1.8 統計方法采用SPSS 13.0統計軟件，計量資料以均數±標準差（±s）表示，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 水凝膠的LCST CS/β-GP 水凝膠的LCST 通過紫外分光光度法進行測量：在LCST 以下，水凝膠因為氫鍵作用而處于親水狀態，表現為透明的液體狀態（見圖1-a），其吸光度幾乎為0%；而隨著溫度的升高，在LCST 之上，疏水部分發生聚集并從聚合物鏈中擠出水分子從而形成凝膠狀態（見圖1-b），溶液變得不透明，同時觀察到吸光度急劇增加，溶液在35 ℃左右變得渾濁。

圖1 不同溫度CS/β-GP水凝膠宏觀形態Figure 1 Macroscopic morphology of CS/β-GP hydrogel at different temperatures

2.2 水凝膠表面結構使用SEM 評估水凝膠的表面微觀結構形態（見圖2）。CS/β-GP 水凝膠在不同溫度時表現出不同的形態。25 ℃時的CS/β-GP 水凝膠呈現疏松多孔結構，水凝膠在35 ℃時具有較小的孔徑，結構也變得更加緊湊。進一步證實了所得CS/β-GP水凝膠的熱響應性。

圖2 不同溫度CS/β-GP水凝膠表面形態（SEM）Figure 2 The surface morphology of CS/β-GP hydrogel at different temperatures（SEM）

2.3 水凝膠對PTX釋放的影響如圖3 所示，游離PTX 的釋放速度較快，不到24 h 就全部釋放。將PTX 引入CS/β-GP 水凝膠中制備PTX/CS/β-GP水凝膠，觀察到水凝膠中的PTX 持續釋放速度明顯延緩，PTX 的釋放維持了15 d，表明合成的PTX/CS/β-GP水凝膠具有良好的緩釋效果。

圖3 游離PTX和PTX/CS/β-GP水凝膠的體外釋放曲線Figure 3 In vitro release curves of free PTX and PTX/CS/β-GP hydrogel

2.4 體外細胞毒性研究結果使用提取的水凝膠滲濾液分別處理HNE1 細胞24 h 和48 h 后，采用MTT 法評估水凝膠的細胞毒性。結果如圖4 所示，CS/β-GP水凝膠滲濾液處理HNE1細胞24 h和48 h 后的細胞存活率保持在90%以上，與陰性對照組比較，差異無統計學意義（P＞0.05），這表明制備的CS/β-GP 水凝膠具有細胞相容性。PTX/CS/β-GP 水凝膠處理HNE1 細胞24 h 和48 h 后的細胞存活率分別為64.5%和48.9%，與陰性對照組比較，差異有統計學意義（P＜0.05）。

圖4 HNE1細胞在水凝膠中培養24 h和48 h后的活性Figure 4 The viability of HNE1 cells cultured in hydrogel for 24 hours and 48 hours

2.5 體外細胞凋亡研究結果DAPI 染色后HNE1細胞核呈圓形，凋亡細胞呈現核濃縮，染色加深，或核染色質呈新月形聚集于核膜一邊。取5 個視野，計數凋亡細胞數量，結果顯示：陰性對照組、CS/β-GP 組和PTX/CS/β-GP 組細胞凋亡數分別為（1.4 ± 0.2）、（2.8 ± 0.4）、（4.2 ± 0.6）個。使用CS/β-GP 水凝膠處理的細胞核基本完整，見圖5，結果表明，CS/β-GP 水凝膠作為藥物輸送載體具有良好的細胞相容性。PTX/CS/β-GP 水凝膠處理后，HNE1 細胞數量顯著低于陰性對照組和CS/β-GP水凝膠組，同時觀察到較多碎片化的細胞核（P＜0.05），表明PTX/CS/β-GP 水凝膠可有效促進HNE1 細胞凋亡，進一步證實負載PTX 的水凝膠的抗HNE1細胞增殖作用。

圖5 DAPI染色法觀察CS/β-GP水凝膠和PTX/CS/β-GP水凝膠對HNE1細胞凋亡的影響（×200）Figure 5 Effect of CS/β-GP hydrogel and PTX/CS/β-GP hydrogel on apoptosis of HNE1 cells observed by DAPI staining（×200）

2.6 體內抗腫瘤研究結果圖6-A 結果顯示，荷瘤裸鼠皮下注射生理鹽水或CS/β-GP 水凝膠后，裸鼠體質量均有不同程度上升，2 組比較無顯著性差異（P＞0.05），表明體內使用CS/β-GP 水凝膠具有較好的生物相容性。荷瘤裸鼠皮下注射PTX 混懸液后2 d，裸鼠體質量開始逐漸下降，8 d內平均體質量從17.91 g 下降到16.32 g，在一定程度上說明PTX對裸鼠有一定的毒副作用。但PTX/CS/β-GP水凝膠組裸鼠的體質量變化與空白組基本相同，在給藥后10 d 內，2 組體質量無顯著性差異（P＞0.05），而PTX/CS/β-GP 水凝膠組裸鼠體質量明顯高于PTX 組（P＜0.05），表明PTX 被包裹在CS/β-GP 水凝膠中，釋放速度較緩慢，從而對實驗動物的毒副作用較小。

圖6 負載紫杉醇（PTX）的CS/β-GP水凝膠對荷瘤裸鼠體質量（A）和腫瘤體積（B）的影響Figure 6 Effect of PTX-loaded CS/β-GP hydrogel on body mass（A）and tumor volume（B）of tumor-bearing nude mice

各組裸鼠腫瘤的變化情況如圖6-B所示。空白組的腫瘤體積從112.49 mm3增加到1 285.37 mm3；CS/β-GP水凝膠組裸鼠腫瘤的平均體積從107.65 mm3增加到1 157.82 mm3，與空白組比較，無顯著性差異（P＞0.05），表明CS/β-GP 水凝膠不能發揮抗腫瘤作用；PTX 組荷瘤裸鼠的腫瘤生長受到明顯抑制，腫瘤體積也明顯減小（P＜0.05），10 d 后的腫瘤抑制率為81.72%；PTX/CS/β-GP 水凝膠對裸鼠體內腫瘤的抑制作用明顯強于PTX（P＜0.05），10 d后的腫瘤抑制率為92.64%。

實驗結束后，切除的腫瘤組織經過清洗、干燥和稱定質量。空白組、CS/β-GP 組、PTX 組和PTX/CS/β-GP 組裸鼠腫瘤組織平均質量分別為1.25、1.18、0.25 和0.11 g。各組移植瘤大體形態見圖7。PTX 組和PTX/CS/β-GP 組裸鼠腫瘤組織平均質量低于空白組（P＜0.05），PTX/CS/β-GP 組裸鼠腫瘤組織平均質量低于PTX組（P＜0.05）。可見，游離PTX 和PTX/CS/β-GP 水凝膠均可有效抑制體內鼻咽癌生長，負載PTX 的CS/β-GP 水凝膠的抗癌效果優于游離PTX。這表明PTX/CS/β-GP 水凝膠可以緩慢釋放抗腫瘤活性藥物PTX，不僅可以減少PTX 的毒副作用，還可以延長PTX 的作用時間，是一種相對理想的藥物載體材料。

圖7 各組鼻咽癌裸鼠移植瘤大體形態比較Figure 7 Comparison of the gross morphology of nude mice xenograft tumors among various groups of nasopharyngeal carcinoma

如圖8 的免疫組織化學結果所示，Ki-67 在各組腫瘤組織中均有不同程度的表達，空白組、CS/β-GP 組、PTX 組和PTX/CS/β-GP 組Ki-67 的IOD值分別為（145.6 ± 18.9）（168.3 ± 20.1）（58.7 ± 4.5）和（41.9±3.6）。與空白組比較，PTX 組和PTX/CS/β-GP 組腫瘤組織中Ki-67 的陽性表達水平均明顯下降（P＜0.05）；PTX 組腫瘤組織中Ki-67 的陽性表達水平高于PTX/CS/β-GP 組（P＜0.05）。TUNEL法檢測腫瘤組織細胞凋亡結果如圖8 所示，空白組、CS/β-GP組、PTX組和PTX/CS/β-GP組TUNEL陽性細胞的IOD 值分別為（62.4 ± 8.5）（71.3 ± 6.6）（147.2±18.8）和（197.5±16.3）。PTX 組和PTX/CS/β-GP 組腫瘤組織細胞凋亡率均高于空白組（P＜0.05），PTX/CS/β-GP 組細胞凋亡率較PTX 組更高（P＜0.05）。免疫組織化學和TUNEL 實驗結果表明，負載PTX的CS/β-GP水凝膠具有良好的抗腫瘤性能，與體外實驗結果相一致。

圖8 各組荷瘤裸鼠腫瘤組織中Ki-67的表達（免疫組織化學法）及細胞凋亡（TUNEL法）比較（×200）Figure 8 Comparison of Ki-67 expression（immunohistochemical method）and apoptosis（TUNEL method）in tumor tissue of tumor-bearing nude mice among each group（×200）

3 討論

本研究通過分析CS/β-GP 水凝膠的理化特性，如結構、形態和LCST，證實CS/β-GP 水凝膠具有疏松多孔結構和溫敏性；通過MTT 實驗和體內注射實驗證明了CS/β-GP 水凝膠的生物相容性；通過MTT 實驗、DAPI 染色、體內抗腫瘤實驗和TUNEL 實驗證實負載PTX 的水凝膠的優異抗癌效果。基于這項研究，CS/β-GP 水凝膠作為紫杉醇（PTX）的合適載體應用于鼻咽癌治療顯示出巨大的潛力。

化療是鼻咽癌的主要治療方式，傳統化療藥物多伴隨較為嚴重的毒副反應。當前，改善藥物利用率和降低毒副反應是提高化療藥物療效的主要策略。作為一種細胞有絲分裂抑制劑，PTX可有效抑制包括鼻咽癌在內的多種惡性腫瘤生長，但PTX具有一定的血液毒性和肝毒性。臨床注射PTX的主流給藥方式是靜脈滴注（每日1次），但這種給藥方式導致血藥濃度波動較大，PTX的血藥濃度過高，容易導致毒副作用，過低的血藥濃度難以維持較長時間的抗癌效應，如何維持PTX 較為穩定的血藥濃度是臨床亟待解決的難題。除此以外，目前應用于臨床的PTX 注射液需添加一定量的低極性溶劑來增加PTX 的溶解度，不僅容易導致患者過敏，而且靶向性不夠，極大地影響了PTX 的臨床治療效果[15-16]。倘若將PTX直接注射到鼻咽癌組織中，由于鼻咽部腫瘤組織的質地較為疏松且彈性不足，PTX注射液容易從腫瘤組織中溢出，不僅難以在腫瘤組織中保持相對恒定的藥物濃度，而且對周圍正常組織產生毒副作用。中人氟安作為一種氟尿嘧啶緩釋顆粒植入劑，將中人氟安直接注射到腫瘤組織后，可維持氟尿嘧啶藥效達15 d之久，同時降低了藥物的毒性[17]；但其缺點也非常明顯，這種植入劑是固體顆粒，不利于注射治療，這也是限制中人氟安使用的主要原因[18]。因此，目前需要開發一種全新的不僅能較為方便地給藥，同時能控制PTX 釋放的速度，從而實現增效減毒效應的藥物負載系統。

隨著材料技術的發展，將聚合物及納米材料制成新型載藥系統應用于醫學領域，已經成為目前研究的熱點。本研究所應用到的CS 和β-GP 作為無毒材料已被批準用于生物醫學應用。CS 作為口腔、鼻腔和眼睛的黏合劑或滲透促進劑，目前已被用于口腔黏膜給藥、基因治療給藥系統等[10]；β-GP 作為一種磷元素補充藥物已廣泛應用于早產兒骨代謝和體格發育不良的治療[11]。已有研究證明，合成的CS/β-GP 水凝膠是一種可注射的溫敏性生物材料，毒性較低，具有良好的生物安全性，是一種安全的藥物負載系統[12-14]。但迄今為止，尚未有將CS/β-GP 水凝膠應用于臨床的實例。本研究將PTX 與CS/β-GP 水凝膠結合，成功制備負載PTX 的溫敏性CS/β-GP 水凝膠。這種新型溫敏感性凝膠藥物在室溫下為液態，液態水凝膠可以較為方便地注射到腫瘤組織附近，液態水凝膠在體溫的作用下轉變為凝膠狀態，可在注射部位形成一個藥物緩釋中心，可在較長時期內維持穩定有效的PTX 濃度，提高其抗腫瘤效應，并減少毒副作用的發生，最終改善化療藥物的治療效果。本研究體外實驗結果顯示：PTX/CS/β-GP 水凝膠呈現出良好的緩釋性能，可以持續釋放PTX 超過16 d；PTX/CS/β-GP 水凝膠可有效抑制體外鼻咽癌細胞生長，并誘導細胞凋亡。在體內實驗中，將PTX/CS/β-GP 水凝膠應用于鼻咽癌動物模型，以觀察其抗腫瘤效應。考慮到鼻咽癌的生物學特性主要表現為局部浸潤生長，同時鼻咽部的所在位置也較為適合注射這種水凝膠藥物。結果顯示，單獨應用PTX 對裸鼠體質量具有明顯抑制作用，而應用PTX/CS/β-GP 的實驗動物的體質量不降反增，從而表明CS/β-GP 水凝膠可明顯緩解PTX 對實驗動物的毒副作用。除此以外，在腫瘤組織注射PTX/CS/β-GP 水凝膠還可明顯抑制裸鼠體內腫瘤生長，且其抗癌效果優于相同劑量的游離PTX，這可能是由于PTX 被封裝在CS/β-GP 水凝膠載體中，通過緩慢地釋放，長時間地在移植瘤組織中維持穩定的濃度，實現長時間抑制腫瘤細胞生長和誘導腫瘤細胞凋亡的效果，從而提高PTX 的抗腫瘤療效，同時減少了PTX 對正常組織的毒性作用。

綜上所述，負載PTX 的CS/β-GP 水凝膠具有理想的藥物緩釋性能和生物相容性，可以明顯提高PTX 的細胞毒作用，是一種極具鼻咽癌臨床治療應用前景的候選藥物負載系統。