骨質疏松癥環境下髕下脂肪墊源間充質干細胞成骨成脂分化及淫羊藿苷的干預機制

葉梓軒， 秦佳佳， 劉海全

[1.廣州中醫藥大學第三臨床醫學院，廣東廣州 510006；2.暨南大學中醫學院，廣東廣州 510632；3.廣州中醫藥大學惠州醫院（惠州市中醫醫院），廣東惠州 516001]

目前，隨著老齡化的加劇，骨質疏松癥（osteoporosis，OP）的治療逐漸成為研究熱點。唑來膦酸、特立帕肽、地舒單抗等藥物[1]在治療OP方面雖已取得了顯著療效，但其副作用及藥物依賴性仍是OP 治療過程中需要解決的問題。自從Zuk 等[2]發現脂肪源性干細胞（adipose-derived stem cells，ADSCs），諸多研究證明，其在傷口愈合[3-4]、促進周圍神經生長[5]、治療骨關節炎[6]等方面均可發揮巨大作用。研究者們隨后對其獲取部位、方式等[7-8]進行了不斷的探索。另外，中醫藥因在提高骨質量方面具有療效顯著、副作用小的優勢，被廣泛應用于臨床OP 的治療[9]。淫羊藿為小檗科植物淫羊藿Epimedium brevicornuMaxim.、箭葉淫羊藿Epimedium sagittatum（Sieb.et Zucc.）Maxim.、柔毛淫羊藿Epimedium pubescensMaxim.或朝鮮淫羊藿Epimedium koreanumNakai 的干燥葉，具有補腎壯陽、祛風濕、強筋骨之功效，常被用于治療腎陽虛衰、筋骨痿軟、風濕痹痛等證[10]。而淫羊藿苷（icariin，ICA）作為淫羊藿的主要生物活性物質之一，具有調節內分泌、改善心腦血管功能、抗腫瘤等多重藥理作用[11]。已有諸多研究證明，淫羊藿苷可有效促進骨髓干細胞向成骨細胞分化[12-14]。本實驗擬通過取骨質疏松癥患者脂肪組織，獲得培養髕下脂肪墊-脂肪源性干細胞（infrapatellar fat pad adipose- derived stem cells，IPFP-ADSCs），探究OP 環境下ADSCs 的成骨成脂分化趨勢及淫羊藿苷的干預機制，以期為淫羊藿苷協同ADSCs 臨床治療OP 提供相關理論支持，現將研究結果報道如下。

1 材料與方法

1.1 藥物與試劑淫羊藿苷（分子式C33H40O15，分子量676.66，純度99%，中國食品藥品檢定研究院，批號：110737-201516）。Ⅰ型膠原酶（美國Sigma-Aldrich 公司）；DMEM 培養基（美國Hyclone公司）；胎牛血清（美國Invitrogen 公司）；人單克隆抗體CD34 PE（美國Biolegend 公司）；人單克隆抗體CD90（Thy1）FITC（美國Biolegend公司）；成脂分化試劑盒（美國Gibco 公司）；成骨分化試劑盒（美國Gibco 公司）；Taq 聚合酶（日本TaKaRa 公司）；miScript 逆轉錄試劑盒（德國Qiagen 公司）；堿性磷酸酶（ALP）抗體、Runt 相關轉錄因子2（Runx2）抗體、過氧化物酶體增殖物激活受體γ（PPARγ）抗體（美國Boster公司）。

1.2 儀器HERAcell150i 細胞恒溫培養箱（美國Thermo Scientific 公司）；CKX41 倒置光學顯微鏡（日本Olympus 株式會社）；FACSDiva 流式細胞儀（美國BD 公司）；Alpha 個人型凝膠成像系統red（美國ProteinSimple 公司）；CFX96 熒光定量PCR儀、Bio-Rad Power PAC 200 電泳儀（美國Bio-Rad公司）。

1.3 IPFP-ADSCs的分離、培養和傳代

1.3.1 脂肪組織來源 所有OP 患者均來自廣州中醫藥大學第三附屬醫院關節中心，納入標準[15-16]：①女性，年齡在45 歲以上，80 歲以下；②自上次月經停經以來至少36 個月；③患者腰椎雙能X 線檢查，骨密度低于正常值2.5個標準差以上（T 值＜-2.5）；④行人工全膝關節置換術的患者；⑤患者了解本次研究內容并簽署知情同意書。本研究方案經廣州中醫藥大學第三附屬醫院倫理委員會審核通過（批號：PJ-KY-20220523-008）。

1.3.2 髕下脂肪墊的獲取 剔除髕下脂肪組織內的血管、滑膜及其他非脂肪組織，剪碎至約1 mm3大小。PBS 清洗后加入0.075%I 型膠原酶，振蕩消化1 h。加入基礎培養基（低糖DMEM 培養基，10%胎牛血清，100 U/mL 青霉素，100 U/mL 鏈霉素，pH7.2）中和消化液并稀釋細胞，以140×g離心10 min，棄上清和殘留脂肪，加基礎培養液重懸后將細胞接種于培養皿內，于37 ℃、5%CO2的細胞培養箱中培養。2 ～3 d 視情況進行換液。待細胞匯集率達到約80%以上時，通過0.25%胰酶消化并進行傳代培養，倒置顯微鏡下觀察細胞形態。

1.3.3 流式鑒定 取第3 代ADSCs，經PBS 清洗后，取細胞濃度為1×107個/mL的細胞懸液100 μL，分別加入CD34 抗體、CD90 抗體，空白對照組不加抗體。室溫下，避光孵育20 min。PBS 清洗，流式細胞儀檢測細胞各表面標志物的表達情況。

1.3.4 成骨、成脂能力檢測 將第3 代ADSCs 對數生長期的融合度達到60%～80%時分為2 組，吸棄培養基，加胰蛋白酶使細胞脫落，離心后接種于培養皿中，于37 ℃、5% CO2培養2 h 至4 d，分別換成成骨誘導培養基和成脂誘導培養基，每3 ～4 d 換液1 次。于誘導的第7、14、21 天觀察干細胞分化情況。成骨分化組進行茜素紅37 ℃染色30 min，成脂分化組進行油紅O 37 ℃染色30 min，PBS 清洗3 次后進行顯微鏡下觀察。

1.4 淫羊藿苷誘導ADSCs 將第3代ADSCs以1 ×104個/孔的密度接入6孔板，并分為3組，即對照組、成骨誘導培養基組、成骨誘導培養基+100 μmol/L淫羊藿苷組。培養21 d后，進行后續實驗。

1.5 觀察指標與方法

1.5.1 實時定量聚合酶鏈反應（RT-qPCR）法檢測細胞ALP、Runx2 及PPARγ mRNA 的表達 采用TRIzol 法提取各組細胞總RNA，嚴格遵照反轉錄試劑盒的說明，將總RNA逆轉錄合成cDNA，設計堿性磷酸酶（ALP）、Runt 相關轉錄因子2（Runx2）、過氧化物酶體增殖體激動受體γ（PPARγ）以及內參甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）的引物序列（見表1）。擴增程序為：94 ℃、3 min，循環1 次；94 ℃、30 s，60 ℃、30 s，72 ℃、30 s，循環30次；72 ℃、10 min 循環1 次。擴增結束后，用2-△△CT法計算目的基因相對表達量，并進行分析。

表1 PCR引物序列Table 1 Primer sequences of PCR

1.5.2 Western Blot 法檢測細胞Runx2、ALP 及PPARγ 蛋白表達 取各組的IPFP-ADSCs，用PBS清洗2次，加全蛋白裂解液進行裂解，提取總蛋白并定量。10%SDS-PAGE 電泳后，進行轉膜、封閉，加入Runx2、ALP 及PPARγ一抗（1∶3 000）4 ℃搖床孵育過夜。次日，用TBST 洗膜，加二抗（1∶6 000），室溫孵育2 h，洗膜后ECL 顯色，拍攝蛋白條帶，以ImageJ 軟件進行灰度定量分析。以α微管蛋白（α-Tubulin）為內參。

1.6 統計方法采用SPSS 25.0 軟件進行數據分析，以GraphPad Prism 8.0 軟件繪制相關統計圖。實驗計量數據以均數±標準差（±s）表示，多組之間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 IPFP-ADSCs 形態觀察與鑒定倒置顯微鏡下觀察細胞，原代IPFP-ADSCs 培養至第5 天，細胞貼壁生長，并逐漸變成長梭形生長，清晰可見較大的細胞核，見圖1-A。傳至第3 代后，可見ADSCs 呈長梭型或多邊形，增殖速度較快，密集生長，呈旋渦狀排列，見圖1-B。流式細胞技術檢測第3 代ADSCs 的表面標志物CD34 和CD90 表達，結果顯示，CD34 的表達率為0.23%，CD90 的表達率為91.73%，見圖2。由此說明，成功從OP 患者的髕下脂肪墊中分離得到ADSCs。

圖1 鏡下觀察IPFP-ADSCs形態（10×20）Figure 1 Observation of morphological features of IPFP-ADSCs under microscope（10×20）

圖2 流式細胞技術檢測IPFP-ADSCs表面標志物CD34和CD90Figure 2 Detection of surface markers CD34 and CD90 on IPFP-ADSCs by flow cytometry

2.2 IPFP-ADSCs成骨分化能力鑒定第3 代IPFP-ADSCs 加入成骨誘導培養基后，分別在第7、14、21 天進行茜素紅染色，光鏡下觀察。結果顯示：在成骨誘導第7 天時僅可見少量鈣化點出現，見圖3-a；誘導第14天，鈣化點較前增大，并有部分鈣化點被染成鮮紅色，見圖3-b；誘導第21 天時，可見大面積鮮紅色細鈣化斑出現，見圖3-c。由此可見，源自OP 患者的IPFP-ADSCs 可被誘導分化為成骨細胞。

圖3 成骨誘導培養后的IPFP-ADSCs（茜素紅染色，10×20）Figure 3 IPFP-ADSCs after osteogenic induction（alizarin red staining，10×20）

2.3 IPFP-ADSCs 成脂分化能力鑒定第3 代IPFP-ADSCs 加入成脂誘導培養基后，分別在第7、14、21 天進行油紅O 染色并鏡下觀察。結果顯示：成脂誘導第7 天時可見有部分脂滴出現，見圖4-a；誘導第14天，細胞團較前增大，并有部分細胞內呈現紅色脂滴，見圖4-b；誘導第21 天，可見細胞團內含有大量深紅色脂滴，見圖4-c。由此可見，源自OP 患者的IPFP-ADSCs 可被誘導分化為成脂細胞。

圖4 成脂誘導培養后的IPFP-ADSCs（油紅O染色，10×20）Figure 4 IPFP-ADSCs after adipogenic induction（oil red O staining，10×20）

2.4 各組細胞Runx2、ALP 和PPARγ 的mRNA表達比較表2 結果顯示：與空白對照組比較，Runx2與ALP mRNA 在單純成骨誘導培養基組和成骨誘導培養基+100 μmol/L 淫羊藿苷組內的表達均上升（P＜0.01），且成骨誘導培養基+100 μmol/L 淫羊藿苷組內Runx2與ALP mRNA表達水平顯著高于單純成骨誘導培養基組（P＜0.01）。而PPARγ mRNA在空白對照組內的表達顯著高于其在單純成骨誘導培養基組和成骨誘導培養基+100 μmol/L 淫羊藿苷組內的表達（P＜0.01），且成骨誘導培養基+100 μmol/L 淫羊藿苷組內PPARγ mRNA 的表達顯著低于成骨誘導培養基組（P＜0.01）。

表2 各組細胞中Runx2、ALP及PPARγ 的mRNA相對表達量比較Table 2 Comparison of the relative mRNA expressions of Runx2，ALP and PPARγ among each group of cells（±s；n=3）

表2 各組細胞中Runx2、ALP及PPARγ 的mRNA相對表達量比較Table 2 Comparison of the relative mRNA expressions of Runx2，ALP and PPARγ among each group of cells（±s；n=3）

注：①P＜0.01，與空白對照組比較；②P＜0.01，與成骨誘導培養基組比較

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2.5 各組細胞Runx2、ALP 和PPARγ 的蛋白表達比較表3、圖5 結果顯示：與空白對照組比較，成骨誘導培養基組和成骨誘導培養基+100 μmol/L淫羊藿苷組中Runx2 與ALP 蛋白表達水平升高（P＜0.01），且成骨誘導培養基+100 μmol/L 淫羊藿苷組蛋白表達水平高于成骨誘導培養基組（P＜0.01）。相反，與空白對照組比較，PPARγ 蛋白表達水平在該兩組均降低（P＜0.01），且成骨誘導培養基+100μmol/L 淫羊藿苷組PPARγ 蛋白表達水平低于成骨誘導培養基組（P＜0.01）。

圖5 Runx2、ALP及PPARγ蛋白的Western Blot結果Figure 5 Western Blot results of Runx2，ALP and PPARγ proteins

表3 各組細胞Runx2、ALP和PPARγ的蛋白相對表達量比較Table 3 Comparison of the relative protein expressions of Runx2，ALP and PPARγ among each group of cells（±s；n=3）

表3 各組細胞Runx2、ALP和PPARγ的蛋白相對表達量比較Table 3 Comparison of the relative protein expressions of Runx2，ALP and PPARγ among each group of cells（±s；n=3）

注：①P＜0.01，與空白對照組比較；②P＜0.01，與成骨誘導培養基組比較

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3 討論

作為人體主要干細胞之一的脂肪源性干細胞（ADSCs），在特定培養條件的誘導下，同其他來源的干細胞一樣具有可以向成骨細胞、成軟骨細胞、成脂細胞等方向分化的能力。與骨髓和臍帶血等來源的間充質干細胞相比，ADSCs 不僅具有單位體積獲取量大，且分離過程簡單等諸多優點[17]，還具有較強的增殖能力和較弱的免疫排斥反應，也是自體或者異體干細胞移植過程中良好的種子細胞[18]。本研究將ADSCs 作為研究對象。ADSCs 臨床常用的獲取部位包括腹部、大腿、上肢及腰部等，臨床常用的脂肪組織采集有多種方式，如吸脂手術、直接切除、局部穿刺等技術直接獲取[19-20]。在取材過程中供體的年齡、性別、部位、取材方式以及體質量指數（BMI）等均是影響所獲取的ADSCs 數量、質量、增殖和分化的重要因素[21-23]。本研究采用直接切除髕下脂肪墊的方式，并盡量控制供體年齡、BMI 指數相近，性別相同，僅存在是否患有骨質疏松癥這唯一變量來減少不利因素對本實驗的影響。

髕下脂肪墊（IPFP）作為ADSCs 的重要儲存區，可以在多種膝關節手術中較容易地獲得，如全膝關節置換術、膝關節鏡手術等。在此類手術中為充分暴露術野，均會去除部分髕下脂肪墊，但不會影響手術正常進程。雖然部分研究認為在人工全膝關節置換術中去除髕下脂肪墊可能會增加其術后的疼痛[24-25]，但仍有研究認為在人工全膝關節置換術中去除髕下脂肪墊不會增加創傷和出血，甚至會有效改善髕骨高度[26-27]。有研究[28-30]表明，從髕下脂肪墊分離的ADSCs 可以通過多次傳代純化顯示出穩定的分化潛能，且具有更強的向成骨細胞、成軟骨細胞方向分化的能力。已有部分研究通過關節腔注射IPFP-ADSCs 的方式，改善了兔和大鼠膝關節的軟骨損傷[7，31]。還有研究應用人IPFP-ADSCs 治療大鼠骨關節炎也取得了較好的療效[32]。

本研究從全膝關節置換術切除的髕下脂肪墊中成功地分離ADSCs，并進行傳代培養。ADSCs經培養傳代后，呈長梭形，良好的貼壁狀態。就ADSCs 表型，國際脂肪應用技術協會認為經體外培養的ADSCs 表型為CD31-/CD34-/CD44+/CD45-/CD73+/CD90+/CD105+[33-35]。因此，本實驗選擇CD34和CD90 指標對ADSCs 進行細胞表型鑒定，流式分析顯示，OP環境下的ADSCs高表達CD90，且不表達CD34，結果符合ADSCs 細胞表型特征。李聰聰等[15]研究對IPFP-ADSCs 細胞表面標志物CD44、CD45、CD105 進行檢測，結果顯示，從髕下脂肪墊分離的ADSCs 表面抗原與其他間充質干細胞具有相似性。

在已有的相關研究中關于OP 環境對ADSCs 的成骨分化能力是否有影響方面缺乏一致性。Park等[36]研究顯示，OP 環境對ADSCs 的成骨能力無明顯影響，但可能通過調節旁分泌作用降低ADSCs的活性，影響其免疫應答。而Wang 等[37]研究認為，OP 環境下小鼠ADSCs 增殖能力和成骨潛能受損。Zhang 和Peng 等[38-39]也認為，糖尿病骨質疏松癥環境下ADSCs 成骨分化能力減弱。本研究對OP環境下ADSCs 進行成骨誘導和成脂誘導，觀察ADSCs 分化趨勢的變化，結果顯示OP 環境下ADSCs 同樣具有向成骨細胞和成脂細胞分化的能力。本實驗雖未進一步探究ADSCs 在OP 環境下，其成骨分化能力是否會降低，但本實驗結果說明ADSCs 在OP 環境下仍具有向成骨細胞和成脂細胞分化的能力。

淫羊藿苷對干細胞的影響已有諸多學者進行了探索。既往通過對不同濃度淫羊藿苷干預ADSCs成骨分化的研究[40]，結果顯示濃度為100 μmol/L 的淫羊藿苷可以更好地促進ADSCs 向成骨細胞方向分化。故本實驗在此基礎上對研究方法進行補充調整，直接選取濃度100 μmol/L 的淫羊藿苷加入成骨誘導培養基，對OP 環境下的ADSCs 進行干預，并設置對照組和單純成骨誘導培養基組。在培養至第21 天，對干細胞成骨分化和成脂分化相關的基因蛋白進行檢測。ALP是成骨細胞分化時分泌的一種糖蛋白酶，其主要作用是在堿性條件下被激活，可水解多種磷酸酯并轉磷酸基，是成骨細胞分化特異性因子[41]。Runx2能通過Wnt和Notch等信號通路調節骨代謝，是重要的成骨轉錄因子，是早期成骨分化的標志物[42]。PPARγ對脂肪細胞分化和脂質代謝有重要的調節作用，是控制間充質干細胞向脂肪細胞分化的關鍵基因[43]。Wei等[13]通過淫羊藿苷對BMSCs 干預的研究證明，淫羊藿苷可上調成骨相關蛋白中的Runx2、ALP 表達；劉海全等[44]應用淫羊藿含藥血清對絕經后骨質疏松癥大鼠BMSCs 成脂分化進行干預，結果表明淫羊藿含藥血清可抑制成脂相關蛋白中PPARγ 的mRNA 表達，抑制BMSCs 成脂分化。因此，本研究以Runx2、ALP及PPARγ作為檢測細胞成骨和成脂分化的相關指標，觀察淫羊藿苷對OP 環境下ADSCs成骨分化趨勢的影響，結果顯示，100 μmol/L的淫羊藿苷可顯著提高細胞內Runx2和ALP基因及蛋白表達，可抑制PPARγ 基因及蛋白表達。表明淫羊藿苷可有效抑制OP 環境下ADSCs 向成脂細胞方向分化的趨勢，并促進其向成骨細胞方向分化。

綜上所述，ADSCs 具有易于獲取、體內儲量大及增殖能力強等優勢，可為臨床干細胞治療疾病提供有利的基礎。但由于ADSCs 多向分化能力使其被臨床應用時不能達到穩定的趨向性分化，且OP 環境可能影響ADSCs 的分化能力，而本研究通過體外實驗已證明，淫羊藿苷具備促進OP 環境下IPFP-ADSCs 向成骨細胞分化以及抑制其向成脂細胞分化的能力。