兔腰椎間盤嚴(yán)重退變骨水泥成形術(shù)模型建立與鑒定

蔡碰德 顧恩毅 潘偉坤 陳康堯 鄭 忠

廈門大學(xué)附屬福州第二醫(yī)院骨科（福州 350007）

隨著年齡的增加，椎間盤由于老化和機(jī)械損傷而發(fā)生生物力學(xué)和結(jié)構(gòu)變化導(dǎo)致的腰腿疼痛在老年患者中十分常見［1］，尤其是存在腰椎不穩(wěn)定的患者通常需摘除責(zé)任節(jié)段椎間隙髓核、置入椎間融合器并采用椎弓根螺釘內(nèi)固定，手術(shù)創(chuàng)傷大、出血量大、手術(shù)時間長，高齡患者常因存在高血壓、冠心病、糖尿病等基礎(chǔ)疾病不能耐受開放大手術(shù)，且手術(shù)期間容易出現(xiàn)相關(guān)并發(fā)癥［2-3］，嚴(yán)重影響其生活質(zhì)量。針對上述的臨床情況，近年來國外有學(xué)者介紹了經(jīng)皮骨水泥椎間盤成形術(shù)（percutaneous cement discoplasty，PCD），該技術(shù)可經(jīng)皮注射聚甲基丙烯酸甲酯骨水泥（polymethyl methacrylate，PMMA）填充于嚴(yán)重退變的椎間盤中。這一新型手術(shù)方式提供了迅速的節(jié)段穩(wěn)定效果且因椎間孔增大的而達(dá)到神經(jīng)根及硬膜囊間接減壓的效果，具有較為肯定的臨床治療效果［4-5］。然而，將該技術(shù)在臨床上廣泛應(yīng)用還需還大量的動物實(shí)驗(yàn)及臨床隨訪來證明，建立一種可行性強(qiáng)、可重復(fù)性好的實(shí)驗(yàn)動物模型用于后期的研究十分必要。本研究通過采用銳性切開實(shí)驗(yàn)兔纖維環(huán)、破壞髓核并飼養(yǎng)6周的方法首先造成椎間盤嚴(yán)重退變，而后向椎間隙注射骨水泥建立兔腰椎間盤骨水泥成形術(shù)的動物模型，并應(yīng)用X線、MRI進(jìn)行驗(yàn)證。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物及造模前影像學(xué)檢查

選用體質(zhì)量1.5～2.5 kg的清潔級健康雄性5月齡新西蘭大白兔6只（福建中醫(yī)藥大學(xué)動物實(shí)驗(yàn)中心提供并飼養(yǎng)）。適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后在經(jīng)面罩氣體全身麻醉下拍攝X線片并行MRI檢查，步驟如下：首先將實(shí)驗(yàn)動物放置于小動物麻醉誘導(dǎo)箱中，采用濃度99.9%異氟烷（深圳瑞沃德生命科技有限公司提供）進(jìn)行誘導(dǎo)麻醉，流量為4.5～5 L /h。誘導(dǎo)成功后將小動物轉(zhuǎn)移至固定平臺，通過小動物（兔）專用面罩經(jīng)氣道給予全身麻醉，99.9%異氟烷，流量為2.0～2.0 L /h，根據(jù)麻醉的深度及時調(diào)整麻醉劑流量。所用小動物麻醉機(jī)由深圳瑞沃德生命科技有限公司提供，型號為540I。麻醉生效后采用移動式X射線機(jī)（GE OEC Fluorostar Compact，通用電氣OEC醫(yī)療系統(tǒng)公司，美國）拍攝以腰2～3為中心兔腰椎正側(cè)位X線片。而后應(yīng)用小動物磁共振（GE Signa Advantage 115 T，通用電氣OEC醫(yī)療系統(tǒng)公司，美國）對兔腰椎2～3節(jié)段行T2加權(quán)像（T2WI）掃描。掃描參數(shù)如下：序列重復(fù)時間/ 回波時間（TR/ TE）T2WI為5 000/ 128 ms，層厚1 mm，層間距1 mm，所有MRI影像資料由三位資深MRI醫(yī)師在不同的時間盲法閱片并按Pfirrmann分級［6］法進(jìn)行評估分級，共分為Ⅰ～Ⅴ級，意見不一致時通過討論定級。本研究動物實(shí)驗(yàn)方案經(jīng)廈門大學(xué)附屬福州第二醫(yī)院倫理委員會審批通過（倫理批件號：FZEYLL2020010015）。

1.2 椎間盤嚴(yán)重退變模型建立及鑒定

適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后參考課題組前期的手術(shù)造模經(jīng)驗(yàn)［7-8］，誘導(dǎo)成功后將小動物轉(zhuǎn)移至動物手術(shù)臺上固定四肢。采用側(cè)臥位，腰部下方墊一厚度約6.0 cm的軟墊使術(shù)側(cè)腰椎間隙增大，術(shù)側(cè)軀干冠狀面與手術(shù)臺水平面成45°。采用小動物麻醉機(jī)面罩吸入麻醉，所使用麻醉劑及麻醉方法同前所述。

手術(shù)造模步驟具體如下：全身麻醉生效后，剔除手術(shù)區(qū)域毛發(fā)，常規(guī)碘伏消毒并鋪無菌洞巾，觸及實(shí)驗(yàn)兔肋弓，以平肋弓下緣（約平腰2～3椎體間隙平面）后正中旁開約1.5 cm處為做一長約4.0 cm的縱向切口。逐層切開皮膚、皮下組織及筋膜，識別腹外斜肌外側(cè)緣與腰背肌間隙并鈍性分離該間隙，手術(shù)拉鉤前后拉開間隙，觸及肋骨辨別胸12椎體，向下推移2個椎體即為腰2～3椎體間隙。拉鉤牽拉腰2椎體橫突，另一拉鉤下壓腹膜及腹腔臟器，剝離椎體前緣的軟組織顯露腰2～3椎體間隙側(cè)前方。在腰2～3椎體間隙側(cè)前方用20號尖刀片沿脊柱縱軸逐層切開前縱韌帶、纖維環(huán)，用20 mL注射器針頭刺入椎間盤內(nèi)并輕微挑撥直至見部分膠凍樣半透明的髓核組織溢出，用微型牙科用小刮匙剔除大部分髓核組織。沖洗切口，縫合腰背肌及腹外斜肌的筋膜及皮膚，無菌敷料覆蓋手術(shù)切口，終止吸入麻醉，實(shí)驗(yàn)動物送入動物房麻醉復(fù)蘇繼續(xù)飼養(yǎng)。

飼養(yǎng)6周后腰椎手術(shù)節(jié)段行磁共振檢查，具體方法及所用儀器設(shè)備同前所述。影像學(xué)檢查腰椎間盤MRI的Pfirrmann分級為Ⅴ級者的動物進(jìn)入下一個步驟：椎間盤嚴(yán)重退變骨水泥注射模型建立。

1.3 椎間盤嚴(yán)重退變骨水泥注射模型建立及鑒定

1.3.1 椎間盤嚴(yán)重退變骨水泥注射模型建立 上述影像學(xué)表現(xiàn)符合腰椎間盤突出嚴(yán)重退變的實(shí)驗(yàn)兔行第二次手術(shù)，本次手術(shù)麻醉方法、顯露方法同前所述，顯露至腰2～3間隙椎間盤部位。清除手術(shù)節(jié)段周圍的瘢痕組織，利用微型撐開器撐開實(shí)驗(yàn)兔腰2～3間隙，通過注射器往椎間盤注入約0.5 mL骨水泥（PALACOS?，德國），待骨水泥凝固后逐層閉合手術(shù)切口，終止吸入麻醉，實(shí)驗(yàn)動物送入動物房麻醉復(fù)蘇。（手術(shù)操作示意圖見圖1）。

圖1 手術(shù)操作示意圖

1.3.2 椎間盤嚴(yán)重退變骨水泥注射模型鑒定 椎間盤嚴(yán)重退變骨水泥注射模型1周后拍攝手術(shù)節(jié)段X線片并行磁共振檢查及Pfirrmann分級，具體方法及儀器設(shè)備同前。上述影像學(xué)檢查完成后經(jīng)耳緣靜脈注入空氣處死實(shí)驗(yàn)兔，解剖顯露腰2～3椎間隙，探查了解手術(shù)部位的骨水泥有無脫落、松動。

2 結(jié) 果

椎間盤嚴(yán)重退變骨水泥注射模型1周后拍攝手術(shù)節(jié)段X線片，結(jié)果顯示骨水泥較好地填充于腰2～3間隙，椎間隙高度接近正常狀態(tài)（見圖2）。而MRI掃描Pfirrmann分級顯示6例實(shí)驗(yàn)兔椎間盤嚴(yán)重退變模型建立后腰2～3椎間盤信號T2WI椎間盤髓核信號強(qiáng)度Pfirrmann分級均為Ⅴ級，椎間盤內(nèi)注射骨水泥后Pfirrmann分級均為Ⅳ級。終末解剖處實(shí)驗(yàn)動物顯露腰2～3椎間隙，探查了解手術(shù)部位間手術(shù)節(jié)段的骨水泥有無脫落、松動。以上結(jié)果提示本實(shí)驗(yàn)進(jìn)行的腰椎間盤嚴(yán)重退變骨水泥模型切實(shí)可行，可重復(fù)性好。

圖2 腰2～3正側(cè)位X線片（白色箭頭指示為填充的骨水泥）

3 討 論

隨著社會的老齡化，因椎間盤嚴(yán)重退變引起腰腿痛是老年患者較為常見的脊柱脊髓疾病，嚴(yán)重影響老年患者的生活質(zhì)量甚至其壽命，越來越受到眾多脊柱外科醫(yī)師及患者的重視。既往傳統(tǒng)的手術(shù)治療方法常需行腰椎責(zé)任節(jié)段切開椎間隙融合椎弓根內(nèi)固定，然而老年患者常合并高血壓、糖尿病、冠心病等基礎(chǔ)疾病不能耐受而只能接受療效不切確的非手術(shù)治療方法。近幾年內(nèi)國內(nèi)外從事脊柱外科專業(yè)的學(xué)者報道采用經(jīng)皮椎間盤骨水泥成形技術(shù)來解決上述的難題，并取得不錯的臨床近期效果。該項(xiàng)技術(shù)通過類似于經(jīng)皮椎體成形術(shù)通過經(jīng)皮微創(chuàng)往責(zé)任間隙椎間盤（椎間盤嚴(yán)重退變）注入適量骨水泥，使得術(shù)前不穩(wěn)定的責(zé)任間隙迅速達(dá)到穩(wěn)定狀態(tài)。然而這一技術(shù)的推廣還需要大量的動物實(shí)驗(yàn)及臨床病例來證明，本課題研究旨在建立一種可行性強(qiáng)、可重復(fù)性好的實(shí)驗(yàn)動物模型以便用于后期的生物力學(xué)、組織學(xué)等基礎(chǔ)研究。

3.1 實(shí)驗(yàn)動物與手術(shù)干預(yù)節(jié)段的選擇

本課題研究在先前研究的基礎(chǔ)上選取新西蘭大白兔這一實(shí)驗(yàn)動物，相較于中大型動物［9-10］該動物模型飼養(yǎng)容易、來源豐富、價格適中。前期課題實(shí)驗(yàn)已證實(shí)新西蘭大白兔手術(shù)造模采用呼吸道吸入麻醉效果滿意，安全性高。手術(shù)造模發(fā)現(xiàn)其椎間盤大小合適，可通過針刺、切開纖維環(huán)使髓核組織流出人為造成椎間盤退變，后期可進(jìn)行纖維環(huán)縫合、向椎間隙注入骨水泥、生物凝膠等操作，實(shí)驗(yàn)可操作性強(qiáng)。本動物模型之所以選擇兔腰2～3間隙水平作為手術(shù)干預(yù)節(jié)段，原因在于手術(shù)操作時可以胸12的肋骨作為觸摸的解剖標(biāo)志，向下識別腰1、2椎體較為準(zhǔn)確定位手術(shù)節(jié)段，此外選擇在腰2～3椎間隙水平進(jìn)行可盡量減少肋弓遮擋對手術(shù)顯露目標(biāo)椎間盤及后續(xù)操作的影響。

3.2 本實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ偷碾y點(diǎn)

本實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ驮谇捌诘幕A(chǔ)上實(shí)驗(yàn)動物術(shù)前麻醉、手術(shù)部位顯露已較為成熟，造模過程中未出現(xiàn)一例實(shí)驗(yàn)動物意外死亡，課題組成員手術(shù)造模顯露相應(yīng)腰椎節(jié)段時間平均不超過20分鐘。然而，在前期預(yù)實(shí)驗(yàn)造模過程往椎間隙內(nèi)注入骨水泥這一步驟中遇到一定的困難。由于受動物體型大小的影響新西蘭大白兔腰椎間隙較為狹小，而骨水泥具有一定的粘稠度，通過細(xì)小的注射器將骨水泥推入兔腰椎間隙較為困難。后期進(jìn)行了以下改進(jìn)：①切除骨水泥注射部位的部分纖維環(huán)；②使用微小刮匙去除大部分的髓核組織及部分椎間盤終板軟骨；③注射骨水泥時使用微型撐開器撐開椎間隙便于骨水泥更好地進(jìn)入椎間隙。經(jīng)過改進(jìn)后骨水泥能較為順利地注入兔腰2～3椎間隙中。

3.3 模型制備成功的鑒定

本模型制備是否成功主要分為兩部分，第一部分是椎間盤是否發(fā)生嚴(yán)重退變，課題組前期的研究已表明MRI特別是其在T2系列上的信號變化能夠較好地反映腰椎間盤在退變過程中形態(tài)、生物化學(xué)的變化［11-12］。本課題也證實(shí)了手術(shù)干預(yù)椎間盤6周后MRI椎間盤信號Pfirrmann分級由造模前Ⅰ級變?yōu)棰跫墸f明本實(shí)驗(yàn)椎間盤嚴(yán)重退變模型建立成功。第二部分是椎間盤骨水泥注射是否成功，本實(shí)驗(yàn)通過三個方面加以驗(yàn)證：①術(shù)后拍攝實(shí)驗(yàn)兔腰椎正側(cè)位X線片證實(shí)骨水泥位于腰2～3椎間盤內(nèi)，位置良好；②磁共振掃描證實(shí)腰2～3椎間盤T1及T2系列信號改變符合骨水泥填充影像學(xué)改變；③最后動物處死解剖證實(shí)所注射入骨水泥位于椎間盤內(nèi)無松動或者脫落。

3.4 展望

在本課題研究模型建立成功的基礎(chǔ)上，后期研究可針對比較實(shí)驗(yàn)兔腰椎間盤骨水泥注射后生物力學(xué)、影像學(xué)、組織學(xué)等展開相關(guān)研究，進(jìn)一步明確該項(xiàng)新技術(shù)的可行性。此外，本課題采用傳統(tǒng)開放手術(shù)建立動物模型，創(chuàng)傷較大，后期可嘗試以微創(chuàng)通道建立兔椎間盤嚴(yán)重退變模型，并向其椎間隙注射骨水泥。這種微創(chuàng)方式可能為臨床采用類似椎體成形術(shù)微創(chuàng)方式治療老年患者嚴(yán)重椎間盤退變引起的脊柱脊髓疾病提供動物實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。