單寧酸與不同配比頭孢哌酮鈉/舒巴坦鈉對耐碳青霉烯鮑曼不動桿菌的體外抑菌作用研究

歐陽龍, 肖亞雄

(1. 川北醫學院 醫學檢驗系, 四川 南充, 637000; 2. 四川省宜賓市第一人民醫院, 四川 宜賓, 644000;3. 四川省宜賓市中醫醫院, 四川 宜賓, 644000)

鮑曼不動桿菌屬于非發酵革蘭氏陰性桿菌,是一種廣泛分布于臨床的機會致病菌。中國細菌耐藥監測網發布數據顯示,鮑曼不動桿菌在2010年就已超過銅綠假單胞菌,成為醫院感染最主要的非發酵菌。隨著碳青霉烯類抗菌藥物的廣泛使用,鮑曼不動桿菌對亞胺培南和美羅培南的耐藥率從2005年的31.0%和39.0%上升到2021年的71.5%和72.3%[1]。目前臨床尚無明確針對耐碳青霉烯鮑曼不動桿菌(CRAB)感染的“標準抗菌藥物方案”,美國傳染病學會專家小組建議盡可能使用至少2種活性抗菌藥物聯合治療中重度CRAB感染[2]。近年來研究[3]表明,很多中藥活性成分具有良好的抗菌作用,與臨床常見抗生素聯用能起到減量增效的作用,具有巨大的開發潛力。

單寧酸是一種多酚化合物,廣泛存在于五倍子、石榴、茶葉等天然植物中。研究[4]表明,單寧酸對金黃色葡萄球菌、鮑曼不動桿菌等9種臨床常見分離菌株有一定抗菌作用,對多重耐藥菌株和非多重耐藥菌株的抗菌活性無顯著差異,提示或可使用單寧酸治療臨床多重耐藥細菌感染?！吨袊U曼不動桿菌感染診治與防控專家共識》[5]認為,頭孢哌酮與舒巴坦在體外對不動桿菌存在協同抗菌活性,敏感性優于氨芐西林/舒巴坦,可作為不動桿菌感染的主要治療藥物。頭孢哌酮鈉/舒巴坦鈉為頭孢哌酮和舒巴坦的復方制劑,臨床中有頭孢哌酮鈉/舒巴坦鈉(1∶ 1)和頭孢哌酮鈉/舒巴坦鈉(2∶ 1)這2種不同配比的制劑。本研究通過體外試驗比較不同配比的頭孢哌酮鈉/舒巴坦鈉對CRAB的抑菌作用,并對單寧酸與頭孢哌酮鈉/舒巴坦鈉進行聯合藥敏試驗觀察抑菌作用,以期為單寧酸與頭孢哌酮鈉/舒巴坦鈉聯合治療CRAB感染提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 主要材料

1.1.1 菌株來源: 收集2022年宜賓市第一人民醫院檢驗科微生物室分離的6株CRAB,標本類型分別為血液、尿液、膿液、分泌物、痰液、腦脊液。鮑曼不動桿菌對任何一種碳青霉烯類藥物耐藥,即判定為CRAB菌株。質控菌株為銅綠假單胞菌ATCC27853, 購自廣東環凱微生物科技有限公司。

1.1.2 試劑與材料: 單寧酸(西格瑪奧德里奇貿易有限公司),頭孢哌酮鈉/舒巴坦鈉(1∶ 1)(輝瑞制藥有限公司),頭孢哌酮鈉/舒巴坦鈉(2∶ 1)(輝瑞制藥有限公司), MH瓊脂平板(鄭州安圖生物工程股份有限公司), MH肉湯(青島海博生物技術有限公司),無菌96孔板(比克曼生物科技有限公司)。

1.1.3 儀器: 生物安全柜(青島海爾特種電器有限公司),超低溫醫用冰箱(青島海爾特種電器有限公司),電熱恒溫培養箱(上海力新儀器有限公司)。

1.2 試驗方法

1.2.1 菌液配置: 將所有CRAB菌株接種于MH瓊脂平板,35 ℃培養20 h,挑取數個分離純化后的菌落置于生理鹽水試管中,使用比濁儀校正濃度至0.5麥氏單位(1.0×108cfu/mL)。

1.2.2 微量肉湯法測定最低抑菌濃度(MIC): 用MH肉湯配制頭孢哌酮鈉/舒巴坦鈉和單寧酸儲存液,濃度為1 024 μg/mL。對以上濃度藥物進行一系列的倍比稀釋,終濃度分別為1 024、512、256、128、64、32、16、8 μg/mL,再將稀釋至不同濃度的藥液100 μL加入96孔板中,最后加入已配制菌液100 μL。將MH肉湯作為空白對照,不含抗菌藥物的菌懸液作為陽性對照。35 ℃培養24 h后,觀察單寧酸與不同配比頭孢哌酮鈉/舒巴坦鈉對6株CRAB的MIC,并記錄結果。

1.2.3 聯合用藥的部分抑菌濃度指數(FICI)測定: 選取抑菌效果更好的頭孢哌酮鈉/舒巴坦鈉(1∶ 1)與單寧酸進行聯合抑菌試驗。取無菌96孔板,橫排標為A～H,縱列標為1～8,將單寧酸與頭孢哌酮鈉/舒巴坦鈉(1∶ 1)分別倍比稀釋至受試菌4 MIC、2 MIC、1 MIC、1/2 MIC、1/4 MIC、1/8 MIC、1/16 MIC、1/32 MIC這8個稀釋度,以棋盤微量肉湯法測定2種藥物聯用的MIC。A～H橫排依次為單寧酸MIC的4、2、1、1/2、1/4、1/8、1/16、1/32倍, 1～8縱列依次為頭孢哌酮鈉/舒巴坦鈉(1∶ 1)MIC的4、2、1、1/2、1/4、1/8、1/16、1/32倍。每種藥物各取50 μL, 兩兩組合加入96孔板指定孔內,各孔內加入100 μL用MH肉湯稀釋至濃度為1×106cfu/mL的菌懸液,使得體系內單寧酸與頭孢哌酮鈉/舒巴坦鈉(1∶ 1)的藥物濃度分別為1 MIC、1/2 MIC、1/4 MIC、1/8 MIC、1/16 MIC、1/32 MIC、1/64 MIC、1/128 MIC。使體系內菌懸液濃度為5×105cfu/mL, 加樣完成后振蕩混勻,每批進行空白對照、生長對照。將96孔板置于35 ℃恒溫培養箱內靜置培養24 h后觀察結果,觀察各孔渾濁度并記錄2種藥物聯用時的MIC值。

1.2.4 結果判定: 根據藥物單用和聯用的MIC, 參照文獻[6] 計算FICI。FICI=甲藥聯用MIC/甲藥單用MIC+乙藥聯用MIC/乙藥單用MIC。FICI≤0.5時,2種藥為協同作用; FICI>0.5～1.0時, 2種藥為相加作用; FICI>1.0～4.0時, 2種藥為無關作用; FICI>4.0時, 2種藥為拮抗作用。

1.3 統計學分析

2 結 果

2.1 MIC測定結果

單寧酸對6株CRAB的MIC范圍為128～256 μg/mL, 平均MIC為(213.3±66.1) μg/mL; 頭孢哌酮鈉/舒巴坦鈉(1∶ 1)對6株CRAB的MIC范圍為32～128 μg/mL,平均MIC為(90.7±42.5) μg/mL; 頭孢哌酮鈉/舒巴坦鈉(2∶ 1)對6株CRAB的MIC范圍為64～256 μg/mL, 平均MIC為(181.3±85.1) μg/mL, 高于頭孢哌酮鈉/舒巴坦鈉(1∶ 1),差異有統計學意義(P<0.05), 見表1。由此提示,頭孢哌酮鈉/舒巴坦鈉(1∶ 1)的抑菌效果更好,故后續選用頭孢哌酮鈉/舒巴坦鈉(1∶ 1)與單寧酸進行聯合抑菌試驗。

表1 3種抗菌藥物對6株CRAB的MIC結果(n=3)

2.2 單寧酸與頭孢哌酮鈉/舒巴坦鈉(1∶ 1)聯合抑菌效果

單寧酸與頭孢哌酮鈉/舒巴坦鈉(1∶ 1)聯合用藥對6株CRAB的FICI范圍為0.375～0.750, 除AB04菌株表現為協同作用,其余菌株均表現為相加作用,見表2。由此表明,單寧酸可增強頭孢哌酮鈉/舒巴坦鈉對CRAB的抑菌作用。

表2 單寧酸與頭孢哌酮鈉/舒巴坦鈉聯用對6株CRAB的抑菌效果(n=3)

3 討 論

鮑曼不動桿菌是醫院感染較為常見的條件致病菌,是最常見的多重耐藥病原菌"ESKAPE"成員之一。隨著CRAB感染率的不斷增高,患者的治療費用和病死率顯著增加[7-8]。目前, CRAB的治療方案多為基于舒巴坦、多黏菌素、替加環素的聯合用藥[5]。注射用多黏菌素價格昂貴,且具有明顯的腎毒性[9]和神經毒性[10]。相對于多黏菌素而言,替加環素腎毒性較低,但其在微生物清除方面效果較差[11-12]。舒巴坦復合制劑是目前使用較為廣泛的抗CRAB藥物,其中頭孢哌酮鈉/舒巴坦鈉是一種廣譜抗生素,主要被用于治療CRAB等革蘭氏陰性菌引起的感染。頭孢哌酮鈉/舒巴坦鈉的主要成分是頭孢哌酮和舒巴坦,其中頭孢哌酮屬于第3代頭孢菌素類藥物,具有廣譜抗菌作用,而舒巴坦屬于β-內酰胺酶抑制劑,能夠增強頭孢哌酮的抗菌活性。該復方制劑已被廣泛應用于臨床,且在治療醫院感染方面表現出顯著的抗菌效果。

目前,市場上有頭孢哌酮鈉/舒巴坦鈉(1∶1)和頭孢哌酮鈉/舒巴坦鈉(2∶1)這2種配比的制劑可供選用,為探究不同配比頭孢哌酮鈉/舒巴坦鈉對CRAB的體外抗菌活性,本研究挑選6株具有代表性的臨床菌株進行體外試驗。本研究發現,頭孢哌酮鈉/舒巴坦鈉(2∶1)對6株CRAB臨床菌株的MIC值均是頭孢哌酮鈉/舒巴坦鈉(1∶1)的2倍。由此推測,舒巴坦的濃度可能在頭孢哌酮鈉/舒巴坦鈉復方制劑對CRAB的抗菌作用中起主導作用,即舒巴坦濃度越高,復方制劑對CRAB的抗菌作用越強。LAI C C等[13]也發現,在頭孢哌酮中加入舒巴坦可提高頭孢哌酮對CRAB的體外抗菌活性,頭孢哌酮鈉/舒巴坦鈉(1∶1)的半數抑菌濃度(MIC50)和90%抑菌濃度(MIC90)均低于頭孢哌酮鈉/舒巴坦鈉(2∶1)。盡管上述試驗提示頭孢哌酮鈉/舒巴坦鈉(1∶1)對CRAB的體外抗菌活性優于頭孢哌酮鈉/舒巴坦鈉(2∶1), 但根據中國細菌耐藥監測網技術方案中頭孢哌酮鈉/舒巴坦鈉對不動桿菌屬折點判定標準,本實驗中6株試驗菌株對頭孢哌酮鈉/舒巴坦鈉(1∶1)依然均應判定為耐藥。因此,本研究根據中西藥聯用可增強藥物抑菌效果并逆轉細菌耐藥性的思路[14], 對單寧酸和頭孢哌酮鈉/舒巴坦鈉進行聯合用藥試驗,觀察其對CRAB的抑菌作用。本研究結果顯示,與單藥相比,兩者聯合用藥的抑菌效果明顯增強,其中5株菌株表現為相加作用, AB04菌株則表現為協同作用[聯合用藥后頭孢哌酮鈉/舒巴坦鈉(1∶1)的MIC由原來的64 μg/mL降至16 μg/mL, MIC降到敏感水平]。

綜上所述,頭孢哌酮鈉/舒巴坦鈉(1∶1)在體外對CRAB的抗菌活性優于頭孢哌酮鈉/舒巴坦鈉(2∶1), 單寧酸與頭孢哌酮鈉/舒巴坦鈉(1∶1)聯用具有協同和相加作用,能夠降低頭孢哌酮鈉/舒巴坦鈉對CRAB的MIC。但本研究納入菌株數量較少,且僅納入對碳青霉烯耐藥的鮑曼不動桿菌,不能證明藥物對不同耐藥性的鮑曼不動桿菌均有良好抗菌作用,后續將擴大樣本量開展更深入的研究。此外,本研究僅觀察到單寧酸與頭孢哌酮鈉/舒巴坦鈉聯合干預下頭孢哌酮鈉/舒巴坦鈉對CRAB的MIC明顯下降,但未深入研究其作用機制,未來應進一步探索聯合用藥的抑菌作用機制,從而為抗CRAB感染提供更全面的理論基礎。