糜子黃、黑果皮遺傳及轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析

李 強(qiáng),白 璐,郭世華*,高志軍

(1 內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)學(xué)院,呼和浩特010019;2 鄂爾多斯市農(nóng)牧業(yè)科學(xué)研究院,內(nèi)蒙古鄂爾多斯 017200)

糜子(PanicummiliaceumL.)禾本科黍?qū)?一年生禾谷類作物[1],糜子作為短日照C4植物,具有水肥利用率高、耐高溫、抗鹽堿、抗旱等特點(diǎn)[2]。糜子起源于中國,據(jù)考古資料顯示,其在中國的栽培歷史悠久,最早可追溯至距今8 000～10 000年前[3-4],在中國古代的農(nóng)業(yè)體系中具有重要地位,被稱為“五谷之長(zhǎng),百谷之王”[5-6],是干旱半干旱地區(qū)的重要糧食作物,可作為儲(chǔ)備作物或賑災(zāi)糧,是典型性的環(huán)境友好作物[7]。糜子去殼后為黃米或糜米,富含膳食纖維、蛋白質(zhì)、多酚、鈣、鐵、鉀等多種營養(yǎng)元素[8]。

相關(guān)研究表明,糜子具有預(yù)防心血管、糖尿病和治療乳糜瀉等功效[9],可預(yù)防老年高血壓、冠心病、高血脂等疾病[10],是一種藥食同源的作物[11]。糜子果皮顏色常見有黃色、黑(褐)色、紅色、白色、灰色和復(fù)色,以黃、白、紅、褐4種顏色居多。糜子籽粒外殼皮層中含有的大量天然色素,可作為天然著色劑[12]。糜子果皮顏色還與營養(yǎng)、加工品質(zhì)密切相關(guān)。

琦明玉等[13]研究表明,黑色果皮糜子的碳水化合物含量顯著高于白色果皮糜子,氨基酸含量顯著低于白色籽粒糜子和紅色籽粒糜子;柴巖等[14]研究表明,糜子果皮顏色不同,皮的薄厚有所差異,果皮越厚越不易脫落,導(dǎo)致出米率低粒色深的品果皮厚,果皮不易脫落,出米率低,淺色的品果皮薄,果皮極易脫落,出米率高;臧盛等[15]研究表明,糜子品種的果皮顏色越深,糜子殼粉中的總黃酮、總酚、結(jié)合黃酮、自由黃酮和自由酚含量就越高。 黃酮類化合物是造成植物種子、葉、果實(shí)和花顏色變化的主要物質(zhì)[16]。呂丹[17]通過測(cè)定不同粒色苦蕎籽粒中黃酮含量,發(fā)現(xiàn)黃色苦蕎籽粒的黃酮含量明顯低于灰色、褐色和黑色。劉靖崧等[18]研究表明,綠色籽粒小豆總黃酮含量明顯高于紅色籽粒,亮色種皮小豆總黃酮含量明顯高于暗色。曲存民等[19]研究表明,基因BnTT3和BnTT18可能是導(dǎo)致甘藍(lán)型油菜種皮黃黑籽差異的形成原因。Jiang等[20]研究表明,轉(zhuǎn)錄因子TaPpb1和TaPpm1通過形成復(fù)合體調(diào)節(jié)花青素合成,從而影響小麥種皮顏色。蔣寶鑫等[21]研究表明,DFR基因與比利時(shí)杜鵑花花瓣的顏色有關(guān)。

綜上所述,果皮顏色對(duì)作物的品質(zhì)密切相關(guān),除此之外,可作為田間雜交育種的重要農(nóng)藝性狀標(biāo)記,可作為雜種F1代田間真假雜種鑒定的指示性狀,極大減少田間工作量,可有效提高育種效率,研究其顏色形成的機(jī)理,對(duì)田間育種具有重要指導(dǎo)意義?；诖?本研究以黃粒糜I和2016106I 2個(gè)不同顏色的親本配制遺傳群體,利用雜種F1、F2代分析糜子籽粒顏色的遺傳規(guī)律,以F3代不同果皮顏色糜子籽粒為材料,通過轉(zhuǎn)錄組測(cè)序挖掘調(diào)控糜子籽粒顏色形成的相關(guān)基因,為明確糜子果皮顏色形成的機(jī)理和糜子新品種的選育提供理論基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

研究所用材料為鄂爾多斯市農(nóng)牧業(yè)科學(xué)研究院提供的黃粒糜Ⅰ和2016106Ⅰ(表1、圖1),雜交后所獲得的F1、F2和F3籽粒。

圖1 親本‘黃粒糜Ⅰ’和‘2016016 Ⅰ’果皮顏色

表1 供試材料

1.2 材料種植、取樣與指標(biāo)測(cè)定

將課題組前期雜交的糜子組合“黃粒糜Ⅰ×2016106Ⅰ”種植于試驗(yàn)田,試驗(yàn)行長(zhǎng)6 m,行距0.4 m,株距0.15 m,在生育后期進(jìn)行田間真假雜種鑒定,待成熟后,收獲真雜種(F1)。次年將上年收獲的真交種和親本同時(shí)播種,待成熟后,共獲得196個(gè)F2單株;第3年將第2年選擇的單株種植成株行,選擇與第2年顏色一致且果皮顏色未分離的穗行進(jìn)行標(biāo)記,黃色果皮和黑色果皮各選3個(gè)穗行,剝?nèi)」ぱb入凍存管中,編寫對(duì)應(yīng)編號(hào),黃籽標(biāo)為Y1、Y2、Y3,黑籽標(biāo)為B1、B2、B3,液氮速凍后轉(zhuǎn)移至-80 ℃保存。

使用目測(cè)法對(duì)F1代和F2代收獲的種子進(jìn)行表型鑒定,觀察其果皮顏色并記錄。統(tǒng)計(jì)F2果皮顏色,并根據(jù)孟德爾遺傳定律預(yù)測(cè)相對(duì)應(yīng)的基因型,使用SPSS 24.0對(duì)各F2果皮顏色表型的實(shí)際值和預(yù)測(cè)值進(jìn)行卡方檢驗(yàn)。χ2公式為:

χ2=∑(|A-T|)2/T

1.3 文庫構(gòu)建及數(shù)據(jù)分析

提取6個(gè)參試樣本的總RNA,構(gòu)建文庫,經(jīng)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序,將下機(jī)數(shù)據(jù)進(jìn)行過濾后與參考基因組進(jìn)行比對(duì)(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/?term=Panicum+miliaceum),根據(jù)比對(duì)結(jié)果進(jìn)行基因表達(dá)水平定量、差異顯著性分析、功能富集分析。

1.4 實(shí)時(shí)熒光定量(qRT-PCR)驗(yàn)證

為驗(yàn)證轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的可靠性,選擇10個(gè)候選基因用于驗(yàn)證糜子籽粒RNA-seq數(shù)據(jù),用Primer 6.0軟件設(shè)計(jì)特異性引物如表2所示,用SYBR GREEN染料法。兩步法熒光定量PCR擴(kuò)增條件的設(shè)置:擴(kuò)增曲線:95 ℃ 5 min,循環(huán)1次;95 ℃ 10 s,60 ℃ 30 s,循環(huán)40次,72 ℃單點(diǎn)檢測(cè)信號(hào)。溶解曲線:95 ℃ 15 s,60 ℃ 60 s,95 ℃ 15 s,連續(xù)檢測(cè)。以Actin為內(nèi)參基因,基因相對(duì)表達(dá)量用2-ΔΔCT計(jì)算。

表2 qRT-PCR引物

2 結(jié)果與分析

2.1 糜子果皮顏色的遺傳分析

通過對(duì)糜子果皮顏色進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,F1代糜子雜交種籽粒的果皮顏色均呈現(xiàn)為黑色。F2代群體籽粒的果皮顏色發(fā)生明顯分離(表3),黑色果皮糜子與黃色果皮糜子的分離比例約為3∶1。

表3 糜子F2代籽粒果皮顏色分離表現(xiàn)

2.2 糜子果皮顏色轉(zhuǎn)錄組分析

2.2.1 測(cè)序數(shù)據(jù)質(zhì)控

所有樣本經(jīng)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序后,對(duì)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)控,結(jié)果(表4)如下:測(cè)序共獲得264 240 538條原始數(shù)據(jù)的reads,過濾后最終獲得260 993 226條clean reads和39.13 G的clean bases。

表4 6個(gè)樣品的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序情況

Q20比例在97.38%～97.92%之間,Q30比例在93.4%～94.27%之間,將過濾后的樣本與參考基因組的序列進(jìn)行比對(duì)(表5),結(jié)果表明,6個(gè)樣本比對(duì)率在94.98%～95.70%之間,比對(duì)率較高。數(shù)據(jù)整體測(cè)序質(zhì)量合格,可以滿足后續(xù)轉(zhuǎn)錄組分析。

表5 樣品與基因組比對(duì)統(tǒng)計(jì)

以P≤0.05且差異基因閾值。差異比較組合差異基因數(shù)目統(tǒng)計(jì)(圖2)黃粒糜子與黑粒糜子相比,差異基因共有1 493個(gè),其中,顯著上調(diào)的差異基因數(shù)為495個(gè),顯著下調(diào)的差異基因數(shù)為998個(gè)。

圖2 比較組合差異基因數(shù)目統(tǒng)計(jì)

2.2.2 不同果皮顏色糜子GO功能注釋和富集分析

以P<0.05為閾值,共篩選出166條顯著性富集GO Term,其中差異最顯著的為煙酰胺核苷酸生物合成過程、吡啶核苷酸生物合成過程和一元羧酸代謝過程;差異基因最多的功能為一元羧酸代謝過程、水化合物分解代謝過程和核苷二磷酸代謝過程(圖3)。

圖3 差異表達(dá)基因的GO富集分析

2.2.3 不同果皮顏色糜子KEGG功能富集分析

對(duì)差異基因進(jìn)行KEGG富集分析,共富集到101條通路,選取顯著的前20條KEGG通路繪制散點(diǎn)(圖4),富集的通路主要為脂肪酸生物合成,糖酵解/糖異生,脂肪酸代謝,光合生物中的碳固定,生物素固定,光合作用—天線蛋白,二萜生物合成,亞油酸代謝,丙酮酸代謝,果糖和甘露糖代謝,氨基酸的生物合成,甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸代謝,磷酸戊糖途徑,乙醛酸鹽和二羧酸鹽代謝,AGE-RAGE 信號(hào)通路在糖尿病并發(fā)癥中的作用,檸檬酸鹽循環(huán),脂肪酸降解,嘌呤代謝,吞噬體、精氨酸和脯氨酸代謝。其中差異最顯著的代謝通路為脂肪酸降解,嘌呤代謝,吞噬體、精氨酸和脯氨酸代謝;富集到差異基因最多的途徑為脂肪酸生物合成、糖酵解/糖異生、脂肪酸代謝、光合生物中的碳固定。

圖4 差異表達(dá)基因的 KEGG 富集分析

2.2.4 不同果皮顏色糜子差異表達(dá)基因篩選與分析

根據(jù)KEGG分析可知,通路中與類黃酮生物合成相關(guān)的代謝途徑包括苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸生物合成,苯丙烷類和類黃酮生物合成等途徑中富集到的基因進(jìn)行篩選,以P≤0.05且|log2(αFC)|≥1為閾值,共篩選到13個(gè)差異較大可能與糜子果皮顏色有關(guān)的差異顯著基因(表6),其中C2845_PM02G08740等3個(gè)基因顯著上調(diào),C2845_PM06G12530等10個(gè)基因呈顯著下調(diào)。

表6 差異表達(dá)基因

2.2.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析

為確認(rèn)RNA-seq結(jié)果的可靠性,從篩選出的13個(gè)差異表達(dá)基因中隨機(jī)選取10個(gè)進(jìn)行qRT-PCR驗(yàn)證分析。qRT-PCR結(jié)果(表7)顯示,這10個(gè)基因的表達(dá)趨勢(shì)與測(cè)序結(jié)果一致,說明 轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)真實(shí)可靠。

表7 候選基因的qRT-PCR驗(yàn)證

3 討 論

糜子的果皮顏色繁多,目前,生產(chǎn)上常用的糜子果皮顏色主要以黑色、黃色、紅色、白色為主[22]。本研究以黃色果皮的糜子品種黃粒糜Ⅰ為母本,以黑色果皮的糜子品種2016106Ⅰ為父本進(jìn)行雜交,對(duì)獲得的雜交組合表型進(jìn)行分析,F1果皮顏色均為黑色,F2代群體中黑色果皮∶黃色果皮約為3∶1,說明糜子黑色與黃色果皮受1對(duì)等位基因控制,黑色相對(duì)于黃色為顯性性狀。

果皮顏色不僅是重要的形態(tài)學(xué)標(biāo)記,還與籽粒的營養(yǎng)品質(zhì)有關(guān)。張慧等[23]研究發(fā)現(xiàn),不同粒色小麥間的可溶性蛋白、氨基酸、微量元素、花青素、葉綠素和黃酮等含量差異顯著,彩色小麥相比于普通小麥抗逆性更強(qiáng)、營養(yǎng)價(jià)值更高。楊希娟等[24]研究發(fā)現(xiàn),不同粒色青稞的抗氧化活性和酚類化合物含量與籽粒顏色有關(guān)。Tang等[25]研究表明,黑色籽粒藜麥中維生素、葉黃酸以及不飽和脂肪酸等含量顯著高于其他顏色。本研究以雜交組合黃粒糜Ⅰ×2016106Ⅰ的F3代中同一時(shí)期的黑色果皮和黃色果皮的糜子籽粒作為試驗(yàn)材料,進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序,通過GO和KEGG功能富集分析,共篩選到13個(gè)可能與糜子果皮顏色調(diào)控有關(guān)的的候選基因。

POD是植物體內(nèi)參與花青素氧化的候選酶,與花青素代謝密切相關(guān),富含花青素較多的組織中POD含量均較高,植物體內(nèi)花青素主要為天竺葵素-3-葡糖苷及其衍生物,合成POD的底物阿魏酸、香豆酸和咖啡酸等有機(jī)酸在POD活性下降時(shí)降解速度也相應(yīng)減慢,有利于形成酰化天竺葵苷,抑制POD可以增加?；ㄇ嘬盏姆e累量,從而調(diào)控花青素的合成[26]。本研究中C2845_PM06G12530、C2845_PM08G08990、C2845_PM07G05720、C2845_PM16G22550、C2845_PM08G21450、C2845_PM04G29280和C2845_PM09G22680等基因編碼過氧化物酶(POD),其中差異表達(dá)基因僅有2個(gè)上調(diào),其他差異表達(dá)基因均下調(diào),說明在黃色果皮糜子中編碼該酶的差異表達(dá)基因低于黑色果皮糜子,即過氧化物酶含量較高的品種,果皮中花青素含量也較高,粒色較深與王麗等[27]的研究結(jié)果基本一致。

C2845_PM11G22290基因編碼肉桂酰CoA還原酶(CCR),在植物體內(nèi),苯丙烷代謝的中間產(chǎn)物對(duì)-香豆酸在4-香豆酸輔酶A連接酶(4CL)的催化下形成對(duì)-香豆酸CoA,經(jīng)過羥基化可轉(zhuǎn)化為木質(zhì)素和類黃酮素等前體物質(zhì)阿魏酰CoA和咖啡酰CoA,在CCR1等酶催化作用下形成木質(zhì)素單體,木質(zhì)素含量升高,類黃酮素前體物質(zhì)減少,從而抑制類黃酮素合成。在本研究中基因C2845_PM11G22290呈顯著下調(diào),導(dǎo)致糜子果皮顏色的差異。C2845_PM15G04300基因編碼肉桂醇脫氫酶(CAD),CAD作用于黃酮類化合物發(fā)生苯丙烷代謝途徑之后,是木質(zhì)素單體形成最后一步,通過氧化還原反應(yīng)催化香豆醛、芥子醛、松柏醛等3種肉桂醛變成相對(duì)應(yīng)的肉桂醇,即木質(zhì)素單體,由于木質(zhì)素形成與類黃酮素形成需要共同的前體物質(zhì),所以CAD活性降低,木質(zhì)素合成減少,有利于類黃酮素的合成[28],本研究中該基因在黃色果皮中表達(dá)量高于黑色果皮糜子材料,可能間接導(dǎo)致糜子果皮顏色改變。C2845_PM02G08740基因編碼4-香豆酸輔酶A連接酶(4CL),類黃酮生物合成的最初前體苯丙氨酸通過4CL催化生成類黃酮前體物質(zhì)4-香豆酰CoA,本研究篩選出的編碼4CL基因的表達(dá)上調(diào)有利于類黃酮物質(zhì)生成,與李文建等[29]的研究一致。C2845_PM16G00040基因編碼細(xì)胞色素P450(CYP450),CYP450是一大類位于膜上的血紅素蛋白,廣泛參與植物中許多天然代謝產(chǎn)物苯丙烷類、脂肪酸及生物堿的生物合成,在植物苯丙烷途徑中起著重要作用,CYP450可通過催化苯丙烷生物合成途徑,從而調(diào)控類黃酮類化合物的形成[30-31]。C2845_PM16G20900基因編碼花青素合成酶(ANS),ANS是原花青素特異合成途徑的關(guān)鍵酶,在NADPH協(xié)助下,可催化花青素如飛燕草素、花葵素和矢車菊素等還原為表沒食子兒茶素EGC和表兒茶素EC,推測(cè)由于ANS含量的升高,可降低花青素含量[32]。

綜上,本研究分析了糜子顏色的遺傳規(guī)律,初步篩選出影響糜子果皮顏色的候選基因,為深入研究糜子果皮顏色奠定理論基礎(chǔ)。