鹽脅迫下寧夏枸杞苯丙烷代謝相關(guān)基因差異表達(dá)分析

宋 繁,胡進(jìn)紅,梁旺利,梁文裕,王玲霞

(寧夏大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院, 銀川 750021)

寧夏枸杞(LyciumbarbarumL.)是主要分布于寧夏、內(nèi)蒙古、新疆等干旱或半干旱地區(qū)的多年生灌木,其果實(shí)具有很高的藥用和營養(yǎng)價值,是當(dāng)?shù)刂匾脑耘嗨幱弥参镔Y源。同時,寧夏枸杞適宜在鹽堿、干旱和沙荒地種植,具有較強(qiáng)的耐鹽性。長期的鹽生環(huán)境使寧夏枸杞進(jìn)化出了一系列適應(yīng)鹽脅迫的機(jī)制,包括離子選擇性吸收[1]、滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)積累[2]、活性氧自由基(ROS)清除[3]和葉片超微結(jié)構(gòu)改變等[4]。目前越來越多的研究表明寧夏枸杞可通過形態(tài)結(jié)構(gòu)、生理生化及分子水平等方面的變化協(xié)同適應(yīng)鹽脅迫。

植物苯丙烷代謝途徑是合成酚類、類黃酮和木質(zhì)素等次生代謝物的主要途徑。這些次生代謝物構(gòu)成植物體內(nèi)重要的非酶抗氧化防御系統(tǒng),可以清除過多的ROS,減緩植物在逆境脅迫下的膜脂過氧化和其他氧化損傷。研究發(fā)現(xiàn)通過改變苯丙烷代謝途徑中相關(guān)基因的表達(dá)水平,進(jìn)而調(diào)控酶活性及代謝物質(zhì)積累是植物應(yīng)對非生物脅迫的一種重要防御機(jī)制[5]。

鹽脅迫下草莓[6]、紅果龍葵[7]、刺柏[8]、鼠尾草[9]和秋茄[10]通過上調(diào)苯丙氨酸解氨酶(PAL)、肉桂酸-4-羥化酶(C4H)、類黃酮-3-羥化酶(F3H)、二氫黃酮醇-4-還原酶(DFR)、黃酮醇合酶(FLS)和查耳酮合成酶(CHS)等苯丙烷代謝途徑相關(guān)基因的表達(dá),促進(jìn)酚類、類黃酮物質(zhì)的積累,使得這些植物的耐鹽性提高。

此外,鹽脅迫可通過誘導(dǎo)類黃酮合成相關(guān)基因F3H和查耳酮異構(gòu)酶基因(CHI)的表達(dá)來提高胡蘿卜對鹽的耐受性[11]。擬南芥鹽馴化過程中與木質(zhì)素合成相關(guān)的7個基因表達(dá)上調(diào),促進(jìn)木質(zhì)素的合成,使擬南芥細(xì)胞壁木質(zhì)化、減少水分蒸騰,維持正常的膨壓[12]。

由此可見植物酚類、類黃酮和木質(zhì)素等的合成與植物耐鹽性具有明顯的相關(guān)性,研究其合成相關(guān)基因的差異表達(dá)有利于闡明植物耐鹽機(jī)制。但是目前對于寧夏枸杞酚類、類黃酮、木質(zhì)素這類化合物合成相關(guān)基因如何表達(dá)以適應(yīng)鹽脅迫還鮮見報道。因此,本研究利用高通量測序技術(shù)和實(shí)時熒光定量技術(shù)對鹽脅迫下寧夏枸杞苯丙烷代謝途徑中相關(guān)基因的表達(dá)規(guī)律進(jìn)行分析,并對該途徑中關(guān)鍵酶的活性及產(chǎn)物含量進(jìn)行測定,為進(jìn)一步研究寧夏枸杞耐鹽機(jī)制提供理論參考。

1 材料和方法

1.1 材 料

試驗(yàn)所用品種‘寧杞1號’種子由寧夏農(nóng)林科學(xué)院枸杞工程技術(shù)研究所惠贈。枸杞種子經(jīng)萌發(fā)1 d后種植于花盆(6.5 cm×7.5 cm)中,以珍珠巖、蛭石與基質(zhì)按 1∶1∶1 比例混合作為培養(yǎng)基質(zhì),用Hoagland營養(yǎng)液進(jìn)行澆灌。在溫度(25 ± 2) ℃、濕度42%、光強(qiáng)60 μmol/(m2·s)、光照時間12 h 的條件下進(jìn)行培養(yǎng)。1個月后,選擇長勢一致且健康的幼苗移栽水培,繼續(xù)培養(yǎng)2個月后,進(jìn)行100,200,300 mmol/L NaCl鹽脅迫處理,以不加NaCl的Hoagland營養(yǎng)液為對照。每個處理設(shè)3個重復(fù)。在鹽處理后第7天采集枸杞葉片,液氮處理后,保存于-80 ℃冰箱備用[13]。

1.2 方 法

1.2.1 RNA提取及cDNA測序文庫構(gòu)建

采用天根生化科技有限公司(中國,北京)生產(chǎn)的RNAprep Pure多糖多酚植物總RNA提取試劑盒提取寧夏枸杞葉片中的總RNA,構(gòu)建cDNA測序文庫。

1.2.2 Illumina HiSeq測序及差異基因篩選

通過高通量Illumina HiSeq PE150測序平臺對已構(gòu)建好的文庫進(jìn)行測序并獲得原始數(shù)據(jù)。去除接頭序列、過濾掉低質(zhì)(low quality,堿基質(zhì)量值小于等于25的堿基數(shù)占整個reads 60%以上)和N(N表示無法確定堿基信息)比例大于5%的reads,獲得可用于后續(xù)分析的參考序列。將參考序列在Nr、Pfam、Swiss-prot、KEGG、GO數(shù)據(jù)庫進(jìn)行blastx比對獲得基因功能注釋。采用DESeq2進(jìn)行基因的差異表達(dá)分析,以|log2(αFC)| >1,且P< 0.05作為標(biāo)準(zhǔn)篩選苯丙烷代謝途徑相關(guān)的差異表達(dá)基因。

1.2.3 苯丙烷代謝途徑相關(guān)基因qRT-PCR分析

為了進(jìn)一步驗(yàn)證轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性,對苯丙烷代謝途徑相關(guān)重要基因進(jìn)行qRT-PCR分析。參考寧夏枸杞轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果,運(yùn)用Primer Premier 5.0設(shè)計(jì)引物(表1),使用諾唯贊生物科技有限公司(中國,南京)生產(chǎn)的試劑盒ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix(Q711-02)進(jìn)行熒光定量檢測。PCR反應(yīng)條件:預(yù)變性95 ℃孵育10 min,95 ℃變性30 s,60 ℃退火1 min,PCR循環(huán)數(shù)為40個,每個樣品重復(fù)3次,采用2-ΔΔCT法計(jì)算基因相對表達(dá)量。

表1 基因功能注釋及引物序列

1.2.4 鹽脅迫下寧夏枸杞苯丙烷代謝途徑關(guān)鍵酶活性測定

采用蘇州夢犀生物醫(yī)藥科技有限公司生產(chǎn)的試劑盒(中國,江蘇)對寧夏枸杞葉片苯丙氨酸解氨酶(PAL)、肉桂酸-4-羥化酶(C4H)、4-香豆酸CoA羧化酶(4CL)、二氫黃酮還原酶(DFR)和肉桂醇脫氫酶(CAD)的活性進(jìn)行測定。

1.2.5 鹽脅迫下寧夏枸杞抗氧化酶活性鑒定

采用蘇州科銘生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)的試劑盒(中國,江蘇)對寧夏枸杞葉片超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化物酶(POD)和過氧化氫酶(CAT)的活性進(jìn)行測定。

1.2.6 酚、類黃酮及木質(zhì)素含量測定

采用蘇州夢犀生物醫(yī)藥科技有限公司生產(chǎn)的試劑盒(中國,江蘇)對寧夏枸杞葉片酚類、類黃酮和木質(zhì)素含量進(jìn)行測定。

1.3 數(shù)據(jù)處理

使用SPSS Statistics 26.0、Origin以及Excel對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析并作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 鹽脅迫對寧夏枸杞幼苗的生長形態(tài)的影響

寧夏枸杞生長形態(tài)在鹽脅迫處理下發(fā)生明顯變化(圖1)。其中,隨著NaCl濃度的增加,寧夏枸杞幼苗株高呈先增加后下降趨勢,在100,200 mmol/L NaCl處理下明顯高于對照組,在300 mmol/L NaCl處理下比對照組顯著下降。同時,與0～200 mmol/L NaCl處理相比,寧夏枸杞幼苗在300 mmol/L NaCl處理下葉片數(shù)量減少,主根長度明顯降低,葉片萎蔫,部分葉片脫落。以上結(jié)果表明,寧夏枸杞生長的最適鹽濃度在100～200 mmol/L NaCl之間,300 mmol/L NaCl 明顯抑制其生長。

Ⅰ～Ⅳ分別為 0,100,200,300 mmol/L NaCl處理。下同。

2.2 鹽脅迫下寧夏枸杞苯丙烷代謝途徑相關(guān)基因差異表達(dá)分析

通過KEGG Pathway 顯著性富集分析對鹽脅迫下寧夏枸杞葉片中所有差異表達(dá)基因進(jìn)行分析,共有58個基因被顯著富集于苯丙烷代謝途徑(P< 0.05);與對照相比,100,200,300 mmol/L NaCl脅迫處理下寧夏枸杞葉片中分別有30,32,29個苯丙烷代謝相關(guān)基因差異表達(dá),其中3個處理組共有顯著差異表達(dá)基因7個(圖2),進(jìn)一步分析表明100 mmol/L NaCl處理組中上調(diào)基因20個,下調(diào)基因10個;200 mmol/L NaCl處理組中上調(diào)基因17個,下調(diào)基因15個;300 mmol/L NaCl處理組中上調(diào)基因11個,下調(diào)基因18個。本研究重點(diǎn)對苯丙烷代謝途徑相關(guān)的15個關(guān)鍵基因的差異表達(dá)及其參與寧夏枸杞對鹽脅迫的響應(yīng)進(jìn)行討論(表2)。

圖2 鹽脅迫下寧夏枸杞葉片苯丙烷代謝途徑相關(guān)差異表達(dá)基因

表2 鹽脅迫下寧夏枸杞葉片苯丙烷代謝途徑主要差異表達(dá)基因

2.3 鹽脅迫下寧夏枸杞葉片苯丙烷代謝途徑相關(guān)基因qRT-PCR分析

運(yùn)用qRT-PCR對寧夏枸杞葉片中酚類、類黃酮和木質(zhì)素合成相關(guān)的5個基因(PAL、C4H、4CL、CCoAOMT和POD12)在不同濃度鹽脅迫下的表達(dá)模式進(jìn)行分析。結(jié)果表明:隨著鹽濃度的增加,PAL表達(dá)量與對照相比均呈下降趨勢,且差異均達(dá)到顯著水平;C4H和4CL表達(dá)量呈先升后降的趨勢,但C4H和4CL表達(dá)量分別以100 mmol/L和200 mmol/L最高,且均顯著高于對照,其余處理均低于對照;POD12和CCoAOMT的表達(dá)量均隨鹽濃度的增加而先升后降,且各濃度處理均比對照顯著上調(diào),并均在200 mmol/L NaCl處理下表達(dá)量最高(圖3,A)。

A. qRT-PCR分析; B. FPKM分析;數(shù)據(jù)以3次生物學(xué)重復(fù)的平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。圖中組間標(biāo)注不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。下同。

進(jìn)一步與轉(zhuǎn)錄組測序得到的FPKM值進(jìn)行比較,發(fā)現(xiàn)上述5個基因在不同鹽濃度下的表達(dá)水平和轉(zhuǎn)錄組測序的結(jié)果基本一致(圖3,B),說明轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果可靠。

2.4 鹽脅迫下寧夏枸杞葉片相關(guān)酶活性及酚、類黃酮和木質(zhì)素含量分析

鹽脅迫下寧夏枸杞葉片抗氧化酶活性測定結(jié)果(圖4)顯示,與對照組相比,葉片SOD和POD活性在各處理組均顯著下調(diào),但隨著鹽脅迫濃度升高,SOD活性逐漸上升,而POD活性逐漸下降,且處理間多差異顯著;同時,葉片CAT活性在200 mmol/L NaCl處理下無顯著變化,在100,300 mmol/L NaCl處理下均顯著低于對照。

圖4 鹽脅迫下寧夏枸杞葉片SOD、POD和CAT活性變化

同時,對不同濃度鹽脅迫下寧夏枸杞葉片苯丙烷代謝途徑中相關(guān)酶的活性進(jìn)行測定。結(jié)果(圖5)顯示,與對照組相比,葉片PAL和CAD活性在100 mmol/L NaCl處理下均顯著上調(diào),在200和300 mmol/L NaCl處理下均無顯著變化;葉片C4H活性在各濃度NaCl處理下均與對照無顯著差異,但100 mmol/L NaCl處理顯著高于200 mmol/L NaCl處理,而與300 mmol/L NaCl處理無顯著差異;葉片4CL和DFR活性均在100,200 mmol/L NaCl處理下均比對照顯著上調(diào),而在300 mmol/L NaCl處理下均無顯著變化。

圖5 鹽脅迫下寧夏枸杞葉片PAL、C4H、4CL、DFR 和CAD活性變化

另外,對不同濃度鹽脅迫下寧夏枸杞葉片中酚類物質(zhì)、類黃酮和木質(zhì)素的含量進(jìn)行測定。結(jié)果 (圖6) 顯示,寧夏枸杞葉片中酚類物質(zhì)含量在100,300 mmol/L NaCl處理下均顯著高于對照,在200 mmol/L NaCl處理下顯著低于對照;而葉片類黃酮的含量在各處理組均顯著高于對照,并以100 mmol/L NaCl處理最高,且與其余處理差異顯著;葉片木質(zhì)素含量在100 mmol/L NaCl處理下達(dá)到8.56 mg/g,并顯著高于對照,而在200和300 mmol/L NaCl處理下與對照組相比未發(fā)生顯著變化。

圖6 鹽脅迫下寧夏枸杞葉片酚、類黃酮和木質(zhì)素含量

3 討 論

本研究通過KEGG pathway顯著性富集分析發(fā)現(xiàn)100～300 mmol/L NaCl脅迫下寧夏枸杞葉片中共有58個苯丙烷代謝相關(guān)基因差異表達(dá)。該途徑合成的酚類、類黃酮和木質(zhì)素等在植物適應(yīng)環(huán)境脅迫中扮演著重要的角色,酚類和類黃酮可通過清除ROS避免膜質(zhì)過氧化從而減少環(huán)境脅迫對植物造成的損傷[14],而木質(zhì)素可通過提高細(xì)胞壁的強(qiáng)度使植物適應(yīng)環(huán)境脅迫[15]。

3.1 寧夏枸杞通過提高酚類和類黃酮含量清除過量ROS適應(yīng)鹽脅迫

酚類物質(zhì)是重要的抗氧化物質(zhì)[16],與植物耐鹽性密切相關(guān)。鹽脅迫下植物中PAL、C4H和4CL等基因的表達(dá)水平與酚類化合物積累相關(guān)[17-19]。本研究發(fā)現(xiàn),寧夏枸杞葉片PAL基因表達(dá)量在鹽脅迫下與對照相比顯著下調(diào),但PAL活性在100 mmol/L NaCl脅迫下顯著上調(diào),這可能是由于PAL屬于多基因家族,不同物種中PAL基因種類和數(shù)目各有不同,因此對脅迫的響應(yīng)也有所不同[20]。例如水稻中有8個PAL基因在鹽脅迫下顯著下調(diào)表達(dá),而只有OsPAL3上調(diào)表達(dá)[21]。因此,寧夏枸杞中PAL家族可能也是由多個PAL基因構(gòu)成的,所以在鹽脅迫下的表達(dá)模式也不同,PAL活性的提高可能是由其他PAL基因控制的。C4H是細(xì)胞色素P450的一種,催化反式肉桂酸生成對香豆酸。鹽脅迫下該基因的過表達(dá)有利于更多酚類物質(zhì)的合成[22]。本研究中C4H表達(dá)量隨NaCl濃度的增加呈現(xiàn)先升后降的變化趨勢,與相應(yīng)酶活性變化趨勢一致,均在100 mmol/L NaCl處理下達(dá)到最高,該基因可能是促進(jìn)寧夏枸杞葉片酚類物質(zhì)積累的重要基因。4CL可以催化香豆酸和CoA合成香豆酰CoA。在煙草中過表達(dá)4CL提高了其酚類物質(zhì)的含量及抗旱性[23]。本研究發(fā)現(xiàn)寧夏枸杞葉片中該基因轉(zhuǎn)錄水平在鹽脅迫下呈先升后降的表達(dá)趨勢,相應(yīng)酶活性也在100,200 mmol/L NaCl脅迫下顯著高于對照。值得注意的是,本研究中寧夏枸杞葉片酚類物質(zhì)含量在100 mmol/L NaCl脅迫下顯著高于對照。以上結(jié)果表明在適度鹽脅迫下(100 mmol/L NaCl)寧夏枸杞可能通過調(diào)控苯丙烷代謝通路酚類合成關(guān)鍵酶基因的表達(dá),積累酚類物質(zhì)來清除過量ROS以適應(yīng)鹽脅迫。

類黃酮可作為植物體內(nèi)二級抗氧化系統(tǒng),當(dāng)減少ROS產(chǎn)生的第一道防線抗氧化酶系統(tǒng)發(fā)生變化時,類黃酮的生物合成會被觸發(fā)[24]。其通過提供電子或氫原子清除ROS[25],進(jìn)而減少氧化脅迫對植物的傷害。在秋茄鹽脅迫研究中發(fā)現(xiàn)CHS基因的表達(dá)有利于類黃酮物質(zhì)的積累[10]。在植物中過表達(dá)CHS、F3H和F3′5′H、DFR顯著提高了類黃酮的含量,增強(qiáng)了植物對鹽、干旱和氧化脅迫的耐受性[26-30]。本研究發(fā)現(xiàn)在100 mmol/L NaCl脅迫下寧夏枸杞葉片中抗氧化酶SOD、POD和CAT的活性均顯著下調(diào),表明此時它們清除ROS的能力下降;此時寧夏枸杞CHS、F3H、F3′5′H、DFR基因轉(zhuǎn)錄水平均呈上調(diào)表達(dá)的趨勢,DFR活性也顯著增加,類黃酮的含量明顯升高,這一結(jié)果表明在適度鹽脅迫下(100 mmol/L NaCl)寧夏枸杞葉片中的二級抗氧化系統(tǒng)類黃酮生物合成途徑被激活,提高了其抗氧化脅迫的能力。而在中高度鹽脅迫(200、300 mmol/L NaCl)下SOD和CAT的活性逐漸上調(diào),類黃酮物質(zhì)的含量相應(yīng)減少,此時抗氧化酶系統(tǒng)和類黃酮物質(zhì)一起協(xié)同清除ROS以適應(yīng)鹽脅迫。

3.2 寧夏枸杞通過木質(zhì)素積累增加細(xì)胞壁強(qiáng)度適應(yīng)鹽脅迫

木質(zhì)素是植物細(xì)胞次生壁的重要成分之一,在植物生長發(fā)育及抗逆性方面發(fā)揮重要作用[31],植物可通過調(diào)節(jié)細(xì)胞壁組分增加細(xì)胞壁強(qiáng)度來應(yīng)對脅迫環(huán)境[32]。本研究發(fā)現(xiàn)在鹽脅迫下寧夏枸杞葉片中與木質(zhì)素合成相關(guān)的基因表達(dá)顯著上調(diào)。CCoAOMT是木質(zhì)素合成過程中的關(guān)鍵酶,參與木質(zhì)素單體合成的甲基化反應(yīng),其基因表達(dá)水平與植物木質(zhì)素含量密切相關(guān)[33]。逆境脅迫下該基因表達(dá)量的提高可能誘導(dǎo)木質(zhì)素的迅速合成[34]。生姜CCoAOMT轉(zhuǎn)錄水平在中度NaCl脅迫下明顯升高,但在較高NaCl濃度下降低,與其木質(zhì)素含量變化趨勢相同[35]。在本研究中,寧夏枸杞葉片中CCoAOMT基因也在100 mmol/L NaCl脅迫下顯著上調(diào),此時木質(zhì)素含量明顯上升,而隨NaCl濃度的增加該基因表達(dá)及木質(zhì)素含量與對照組相比未發(fā)生顯著變化。CAD是催化各種肉桂醛生成木質(zhì)素單體的關(guān)鍵酶。在非生物脅迫下CAD基因表達(dá)水平的增加可促進(jìn)細(xì)胞壁木質(zhì)化過程[36]。本研究發(fā)現(xiàn)鹽脅迫下寧夏枸杞葉片中CAD基因下調(diào)表達(dá),但其酶活性在100 mmol/L NaCl處理下顯著上調(diào),而且木質(zhì)素含量較對照顯著升高。這可能是由于鹽脅迫導(dǎo)致基因發(fā)生翻譯后蛋白修飾,使酶活性與基因表達(dá)量不同步[37]。表明寧夏枸杞可能通過木質(zhì)素合成途徑中關(guān)鍵基因差異表達(dá)以及酶蛋白翻譯后修飾等多種調(diào)控方式應(yīng)答鹽脅迫。

綜上所述,在100 mmol/L適度鹽脅迫下,寧夏枸杞通過調(diào)控苯丙烷代謝途徑中相關(guān)基因的表達(dá)來增加酚類物質(zhì)、類黃酮和木質(zhì)素等次生代謝物質(zhì)的積累,從而啟動非酶促抗氧化系統(tǒng)減緩ROS造成的傷害,并通過合成木質(zhì)素增加細(xì)胞壁強(qiáng)度來協(xié)同適應(yīng)鹽脅迫,這可能是寧夏枸杞適應(yīng)鹽脅迫環(huán)境的一種重要特征。但在200,300 mmol/L的中高度鹽脅迫下,以上3類化合物的合成均明顯減弱,植株耐鹽性降低和生長受到抑制,因此認(rèn)為寧夏枸杞生長最適鹽濃度在100～200 mmol/L NaCl之間,這與鹽脅迫下寧夏枸杞生長形態(tài)變化相一致。本研究結(jié)果為闡明苯丙烷代謝途徑相關(guān)基因、酶以及產(chǎn)物參與提高寧夏枸杞耐鹽性提供了理論依據(jù),同時對寧夏枸杞的栽培生產(chǎn)具有重要指導(dǎo)意義。