基于表型及經濟性狀構建蒜頭果初選核心種質

李洪果,段潤梅,覃 堅,曾 冠,周炳江,勞慶祥

(1 中國林業科學研究院熱帶林業實驗中心,廣西憑祥 532600;2 藤縣國有共青林場, 廣西藤縣 543300;3 岑溪市七坪林場, 廣西岑溪 543200)

核心種質是以提高種質資源管理和利用水平為目的,在對整個遺傳資源科學評價的基礎上,以最少的資源數量,代表整個遺傳資源多樣性的樣本集[1-2],自提出至今,已在小麥(Triticumaestivum)、水稻(Oryzasativa)和棉花(Gossypiumhirsutum)等眾多物種上取得了良好的應用效果[3-5]。核心種質通?；诒硇突蚍肿訕擞洈祿a生,表型數據側重反映不同材料對環境的適應性和育種潛力[6],分子標記數據側重反映材料間的遺傳差異。研究表明,基于2種標記的遺傳距離僅存在微弱的相關性(0.01)[7],遵循的變異模式也不同[8]。通常認為,數量性狀估計的個體或群體間差異一般大于等于用分子標記估計的差異,基于分子標記對群體分類相對保守[8-10]。因此,表型性狀是構建核心種質不可或缺的對象。

蒜頭果(Malaniaoleifera)是中國狹域分布(云、桂、黔三省交界的石漠化地帶)的特有單種,屬(鐵青樹科、蒜頭果屬)極小種群古老植物,也是國家二級保護植物,僅廣西的巴馬、鳳山、凌云、樂業、田林、隆林,以及云南的廣南和富寧有少量種群分布,且以石山立地為主。蒜頭果種仁富含油脂及神經酸,神經酸對修復神經纖維、防止腦神經衰老、腦萎縮和抑郁癥等有很大作用[11]。蒜頭果的葉、果、種仁及其內含物均存在豐富的遺傳變異,經濟性狀指標油脂和神經酸含量,相差可達1倍以上,存在種源和家系選擇的基礎[12]。隨著中國老齡人口增多,老年癡呆、記憶力減退等腦疾病相關的問題也日益突出,記憶力維持和腦疾病治療等對神經酸類藥品的需求量將十分可觀[11]。然而,蒜頭果資源數量稀少,分布區域狹小,繁殖困難,僅存的天然林資源已長期處于不可逆的持續減少狀態[13],為盡快明確天然林中蒜頭果保存和良種選育的目標種源及單株,本研究基于21個表型及經濟性狀,構建蒜頭果核心種質,明確建立蒜頭果育種和保存群體的目標材料,為其資源保育提供依據。

1 材料和方法

1.1 試驗材料及取樣和測量方法

2021年9-10月,從廣西巴馬、鳳山、凌云、樂業和田林,云南富寧和廣南共7個蒜頭果天然群體中采集的97個蒜頭果單株的葉片、枝條、果實及種仁,采樣單株的樹齡均在20年以上。采樣區域覆蓋了8個有蒜頭果種群分布縣市中的7個,基本涵蓋了蒜頭果中心分布區的變異類型。

1.2 試驗方法

1.2.1 核心種質構建

取樣方法:按縣域分組,基于聚類,優先選擇有極值表型的個體。聚類單元內的材料均無極值時隨機選取;只有1個材料時直接入選,每種取樣策略下至少1份材料入選。

構建方法:在分組及多次聚類優先取樣的基礎上,分別采用遺傳多樣性法(G)、比例法(P)和對數法(L)構建,除L法外,G法和P法分別設定10%、20%和30%的取樣比例,共7種取樣策略(G1、G2、G3、P1、P2、P3和L),見表1。其中,遺傳多樣性法是以各地理分組的遺傳多樣性占原種質遺傳多樣性的比例,在分組中提取相應數量的樣本;比例法是以各地理分組樣本數占原種質樣本數的大小,抽取相應比例的樣本數;對數法是以各地理分組樣本數的自然對數抽取相應的樣本數。以上方法至少保證各分組有1份材料入選核心種質群體,其余按比例,反復聚類抽取,直至達到該組設定的取樣比例。

表1 不同取樣策略下的樣本數及其比例

1.2.2 核心種質評價

核心種質代表性評價標準:7種取樣策略下構建的蒜頭果核心種質,均采用極差符合率(CR)、多樣性指數(MI)、最大值變化率(CRMAX)和最小值變化率(CRMIN)、變異系數變化率(VR)、均值差異百分率(MD)、方差差異百分率(VD)和平均值變化率(CRMEA)等8個參數評價篩選核心種質,各參數的計算公式見文獻[14]。評價標準:均值差異百分率(MD)<20%,且極差符合率(CR)>80%時,可認為核心種質具有代表性,且MD參數值越小,其他參數值越大,則代表性越強[14-16]。各參數的有效性排序[14]為:CR>MI>CRMAX、CRMIN>VR>MD>VD>CRMEA。

1.2.3 核心種質驗證

核心種質有效性驗證方法:①多樣性指數的t檢驗,核心種質與原種質群體的多樣性指數(H)在21個性狀上差異不顯著,則構建的核心種質有效;②均值、極大值、極小值、多樣性指數的符合率檢驗,核心種質與原種質群體在4個參數上的符合率越高,有效性越好;③主成分分析,核心種質與原種質群體的主成分相比,方差累計貢獻率略有提高,說明去除了部分遺傳冗余;④基于主成分的樣品分布圖,核心種質的樣品分布相對均勻,且顯著降低原種質樣品分布較為集中或重疊的樣本,則構建的核心種質有效。

1.3 數據分析

原種質與7個核心種質的遺傳多樣性指數(H)在R4.2.1軟件中計算;其余7個評價參數(CR、CRMAX、CRMIN、VR、MD、VD和CRMEA)和符合率檢驗,按公式在Excel 2013中計算;核心種質與原種質群體的多樣性指數的t檢驗、主成分分析和基于主成分的樣品分布,在SPSS 22中進行。

2 結果與分析

2.1 核心種質子集的評價

由表2可知, 7種取樣策略下,均值差異百分率(MD)均為0,21個性狀上的極差符合率(CR)在80.95%(P1)～98.22%(G3)之間,說明構建的7個核心種質子集均符合要求,從中選出最優即可。

表2 不同取樣策略下遺傳參數的比較

7個核心種質子集的平均遺傳多樣性指數(H)在1.69(G1)～1.96(G3)之間;最大值變化率(CRMAX)、最小值變化率(CRMIN)和平均值變化率(CRMEA)分別在95.75%(P1)～99.88%(P3)、100.82%(G3)～123.66%(G1)和80.95%(P1)～98.22%(G3)之間;變異系數變化率(VR)和方差差異百分率(VD)分別在116.54%(P3)～128.27%(G1)和0(P3)～23.81%(G1、G2和P1)之間。

按各參數的有效性排序(CR>MI>CRMAX、CRMIN>VR>MD>VD>CRMEA)可知,G3和P3策略構建的核心子集明顯優于其他5種核心子集,而G3的CR和MI略優于P3,加之,G3的樣本數更少,因此,選擇G3策略,即“優先取樣法+遺傳多樣性法+30%的取樣比例”構建的核心種質子集。

2.2 核心種質的驗證

采用多樣性指數的t檢驗、符合率檢驗、主成分分析檢驗和基于主成分的樣品分布等4重方法驗證所構建核心種質的有效性及代表性。

2.2.1 多樣性指數的t檢驗

由表3可知,核心種質與原種質在21個性狀上的多樣性指數差異均不顯著(P>0.05),21個性狀中,15個性狀的多樣性指數高于原種質,6個性狀的多樣性指數略低于原種質;核心種質21個性狀的平均遺傳多樣性指數(1.96)與原種質(1.94)相比,略有提高。

表3 蒜頭果天然群體的性狀變異

以上說明,核心種質去除了原種質中的部分遺傳冗余后,其多樣性指數有所增加,構建的核心種質具有代表性且有效。然而,這并不意味著核心種質擁有比原種質更高的遺傳多樣性,該指數的增加是由于去除遺傳冗余后,基于相同算法,統計頻率改變所致,并非實質意義上遺傳多樣性的增加。

2.2.2 符合率檢驗

核心種質與原種質在21個性狀上的均值、極大值、極小值和多樣性指數的符合率見表4。由表4可知,核心種質與原種質的均值符合率在80.84%～99.92%之間,平均為97.31%;極大值符合率在86.19%～100%之間,平均為99.16%;極小值符合率在82.87%～100%之間,平均為99.18%;多樣性指數的符合率在86.98%～99.49%之間,平均為95.41%。另外,42個性狀極值中,有39個被保留,其中,21個性狀的極大值,有19個被保留;21個性狀的極小值,有20個被保留,說明構建的核心種質對特異種質的保留效果較好。以上說明核心種質具有較好的代表性,尤其在保留特異種質方面具有優勢。

表4 核心種質與原種質表型性狀的符合率檢驗

2.2.3 主成分分析和基于主成分的樣品分布圖

核心種質與原種質在21個性狀上的主成分分析見表5。由表5可知,核心種質與原種質具有相近的特征值、貢獻率和累計貢獻率,兩者的累計貢獻率均在86%以上,即均能解釋原種質86%以上的遺傳信息。21個性狀按特征值(λ>1)可提煉為6個主成分,方差累計貢獻率86.64%。與原種質相比,核心種質同樣提煉出6個主成分,方差累計貢獻率為87.78%,說明構建的核心種質去除了原種質中的部分遺傳冗余,使方差有所增加。

表5 核心種質與原種質的主成分分析

核心種質與原種質基于主成分的樣品分布情況見圖1。由圖1可知,核心種質樣品分布較為均勻,且顯著降低了原種質中樣品分布較為密集和重疊的部分,說明構建的核心種質有效。核心種質中也有個別較為相近的或重疊的樣本,這可能是由于分組取樣時,限于每組必需有1個樣品入選的約束條件所致,如采用不分組構建核心種質,其分布可能會更為理想。

圖1 核心種質與原種質基于第1和2主成分的樣品分布

3 討 論

3.1 種質分組

種質分組與否,是核心種質構建時首先要考慮的問題。分組一方面是為了保證取樣的代表性,以期不同環境條件下的種質材料在核心種質中均有體現;另一方面是部分抵消不同種群表型性狀所受的環境影響[17-18],因為相同區域內環境條件較為接近,是一種近似同質園的做法。如貴州核桃構建核心種質,是將一定區域內的核桃資源近似為同質園[19]。本研究中,相同縣域采樣的蒜頭果樣本基本處于同一群落內,外在環境條件,如氣象因子等接近一致,對其影響較弱,而環境影響到表型的情況通常發生在較大的地理和氣候尺度上。因此,本次在地理區域分組(縣)和多次聚類優先取樣的基礎上構建的蒜頭果初選核心種質,本質上是綜合各地理分組構建的核心種質形成的疊加核心種質。

分組構建的核心種質應用較為廣泛,也是效果較好的一種策略,在小麥、新疆野杏(Armeniacavulgaris)、黍稷(Panicummiliaceum)等的核心種質構建中均有應用[3,20-21]。分組主要依據種質材料的特性和研究目的,并不局限于某一種分組方法,不存在一種通用的分組方法適用于各類動植物材料。目前,按地理分組是較為常見的分組方法,如灰楸(Catalpafargesii)、狗牙根(Cynodondactylon)和格木(ErythrophleumfordiiOliv.)等[22-24],也有按品種體系或成熟期分組[25-26]。也有很多物種采用不分組的方法構建核心種質,如:新疆野蘋果(Malussieversii)、新疆野杏和番茄(Solanumlycopersicum)等[16,20,27],其優勢在于只基于遺傳距離考慮材料間的聚類結果,能最大限度的去除遺傳冗余或相似種質,所構建的核心種質,其評價參數相對較優;其不足在于忽略了植物的表型可塑性,不同環境條件下表現迥異的種質材料,在相同環境條件下,可能表現出近似的表型。不分組的方法適用于在種質資源庫中經過多年生長評價的種質材料,如杜仲(Eucommiaulmoides)和西伯利亞杏(Armeniacasibirica)等[28-29],而利用野生或天然群體初次構建核心種質時,不分組的方法可能會遺失重要種質材料。因此,蒜頭果的核心種質構建采用分組的取樣策略。

3.2 取樣策略及聚類方法

不同的取樣策略影響核心種質構建的目標能否實現。在聚類的基礎上,較為常見的取樣策略有隨機取樣、優先取樣和偏離度取樣。隨機取樣法能夠維持原種質的遺傳多樣性形式,偏離度取樣法能保留原種質的最大的遺傳變異,而優先取樣法能保留原種質最大和最小性狀值,同時也保留了原種質的遺傳變異結構[15]。本研究從育種及種質資源保存的角度,以盡可能多的保留特異種質資源為目的,選擇優選取樣法構建蒜頭果核心種質。

常見的聚類方法,如:最短距離法、最長距離法、中間距離法和重心法等各有優劣及適用條件,有的過于擴張,有的過于濃縮,太擴張的方法在樣本量大時容易失真,太濃縮的方法不夠靈敏,其中類平均法比較適中,而且具有單調性[30]。因此,本研究在類平均聚類的基礎上采用優先取樣的策略,獲得了較為理想的蒜頭果核心種質。

3.3 核心種質評價參數及驗證體系

核心種質構建后,需用一系列的參數及方法來評價驗證其有效性和代表性。一般而言,確定了核心種質的評價參數,對其取樣方法、取樣比例等的研究才有判定標準。對于數量性狀,均值作為數據的代表值,處于核心種質觀察值的中心位置,是一個極其重要的參數[31]。多樣性指數(H)考察核心種質與原種質的表型頻率分布特點,以兩者的分布結構是否一致,確定核心種質的代表性,是核心種質構建中最常用的方法[32]。研究表明:極差符合率(CR)是核心種質代表性評價的首選參數;平均Shannon-Weaver多樣性指數(MI)是評價核心種質代表性的重要參數;變異系數(VR)的大小決定該性狀是否能穩定遺傳,因此,其變化率也是評價核心種質變異程度的重要參數;均值差異百分率(MD)是判斷核心種質是否具有代表性的判定參數[14]。均值差異百分率(MD)<20%,且極差符合率(CR)>80%時,可認為核心種質具有較好的代表性,且MD參數值越小,其他如變異系數變化率(VR)、方差差異百分率(VD)等參數值越大,核心種質的代表性越強[15]。在育種和種質資源保存中,含有極值的個體往往作為特異種質,是重點關注的對象,因此極大值變化率(CRMAX)、極小值變化率(CRMIN)和平均值變化率(CRMEA)也被用于評價本研究構建的蒜頭果核心種質。

核心種質評價參數符合要求后,常采用一些方法進一步驗證其代表性,其中,多樣性指數的t檢驗、符合率檢驗、主成分分析和基于主成分的樣品分布圖是應用較廣的方法[20-24]。核心種質與原種質t檢驗差異不顯著,說明兩者在性狀上對應的基因型頻率近似,具有相似的分布結構;兩者的極值、極差和多樣性指數的符合率越高,核心種質的代表性越強;主成分分析可以近似的描述樣品在幾何空間的分布特征,并反映供試材料的遺傳結構,可以用來比較核心種質和原種質的分布特征[15];基于主成分的樣品分布圖,也反映構建核心種質的分布特征,核心種質的分布特征與原種質越相似,分布越均勻,對原種質重疊部分去除的效果越明顯,則代表性越好。本研究構建的蒜頭果核心種質經以上4重檢驗,均符合要求,說明所構建的蒜頭果核心種質具備有效性、代表性和實用性等特征,可以作為蒜頭果種質資源收集保存和后期建立育種群體等的依據。