貴州野生獼猴桃表型遺傳多樣性分析

韓振誠,李葦潔,王加國,任春光,李良良,蘇文文

(貴州省山地資源研究所,貴陽 550001)

獼猴桃為獼猴桃科(Actinidiaceae)獼猴桃屬(Actinidia)植物,全世界共有54個種,約75個變種、變型[1]。近年來,中國在獼猴桃種質資源的調查、收集、保存、遺傳多樣性檢測、 起源與演化以及經濟性狀評價和種質創新方面研究較多,培育了東紅、臍紅等優良品種[2-3],并廣泛應用于生產栽培中。遺傳多樣性越豐富,物種對環境變化的適應能力越強[4],用于選育新品種的潛力就越大,貴州是獼猴桃屬植物的集中分布區之一[5],但隨著貴州獼猴桃產業的發展,加強獼猴桃種質資源的收集、保存與利用,明確野生獼猴桃資源的植物學分類地位,準確評價貴州獼猴桃資源的遺傳多樣性,對于獼猴桃新品種選育具有重要意義。

表型多樣性是植物遺傳多樣性的重要組成部分,亦是優異單株鑒選的重要依據[6-7]。表型多樣性研究主要通過科學有效的采樣,合理的數學統計,采用形態特征、生理生化等性狀揭示群體的遺傳規律和多樣性[8-9]。表型多樣性廣泛應用于獼猴桃遺傳多樣性的研究中,姜存良利用15個表型性狀將云南省24個野生獼猴桃種分為4 組,屬間各種存在著豐富的變異,性狀間變異系數相差較大,能了解現階段云南省部分地區獼猴桃野生資源的分布狀況[10];李紅莉等通過對98份野生軟棗獼猴桃資源的表型遺傳多樣性分析得出,黑龍江軟棗獼猴桃枝條、葉片和果實表型性狀變異類型豐富、變異程度高且幅度大,遺傳多樣性豐富,育種選擇潛力大[11];秦紅艷等對70份軟棗獼猴桃資源的果實表型性狀、果實品質性狀等指標進行相關分析表明,果實質量、果徑以及果實營養品質等性狀可作為區分和評價軟棗獼猴桃資源的主要性狀指標[12];而湯佳樂等的研究表明毛花獼猴桃在野生狀態下存在豐富的表型性狀多樣性,其果實形狀、果實縱橫徑、果心、果實橫截面形狀、果基、果頂形狀以及被毛的顏色等性狀均表現出較高的多樣性和差異性,且野生資源中存在優良果實表型的單株[13]。

貴州擁有豐富的獼猴桃資源,但資源遺傳信息分析評價欠缺,遺傳多樣性狀況尚不明確,資源保護力度不夠。基于此,本研究采用文獻查閱、實地踏查的方法系統調查和研究貴州146份獼猴桃種質資源(140份野生資源、6份品種資源)的57個表型性狀,運用主成分分析和聚類分析法進行遺傳多樣性綜合評價,以期為優良單株鑒選及新品種選育提供理論依據和種質基礎。

1 材料和方法

1.1 材 料

在野生獼猴桃資源調查前,根據查閱文獻[14-17]和咨詢專家,進行采集地的選擇。2016年8月-2021年9月,課題組實地調查貴州四大山脈8個地區(州、市)30個縣(區、市),收集到146份獼猴桃資源(140份野生資源、6份品種資源),參照《中國植物志·第四十九卷》和《貴州植物志·第三卷》[18-19]所描述的文字和圖片資料,對所采資源進行分類鑒定(表1)。

表1 貴州野生獼猴桃資源采集地基本信息

1.2 方 法

1.2.1 貴州野生獼猴桃種質資源采集

根據貴州的地形地貌和四大山脈自然生態區域將采集地分為北部大婁山(遵義市)、南部苗嶺(貴陽市、黔東南州、黔南州、黔西南州)、西部烏蒙山(畢節市、六盤水市)和東部武陵山(銅仁市)。

采摘獼猴桃果實、葉片、枝條,根據所保存資源的順序編號對其進行命名,記錄所采集樣品的地址、海拔等信息(表1),參照《獼猴桃種質資源描述規范和數據標準》[20]的方法,在現場進行記錄。將成熟果實置于冰盒中帶回實驗室,待果實后熟后(手捏稍軟),切成小塊液氮速凍,放置于-80 ℃冰箱保存備用,并標記名稱和日期。

1.2.2 貴州野生獼猴桃種質資源質量性狀賦值

質量性狀包括果實、枝條、葉片、花朵的48個描述性表型性狀,參照《獼猴桃種質資源描述規范和數據標準》的方法進行描述和賦值,并進行標準化數值轉化。

1.2.3 貴州野生獼猴桃種質資源數量性狀測定

參照《獼猴桃種質資源描述規范和數據標準》的記錄,測定資源的9個數量性狀,測量146份資源葉縱徑、橫徑、葉柄長,記錄數據并統計;利用電子天平稱量果實單果重,用游標卡尺測量果實縱徑、橫徑,計算果形指數,每個指標重復6次;可溶性總糖含量采用蒽酮比色法測定;可滴定酸含量采用酸堿滴定法測定;Vc含量采用2,6-二氯靛酚染料滴定法測定[21]。每個指標重復3次。

1.2.4 數據處理

整理獼猴桃種質資源質量性狀的轉化標準數據和數量性狀的測定數據,利用Excel統計各性狀的標準差、平均值、變異系數、變幅等;利用SPSS 23.0進行主成分分析、R型聚類分析和Q型系統聚類分析,得出各主成分因子負荷量、特征向量、貢獻率、累計貢獻率[22-24],歐氏遺傳距離[25-27]等。

利用Shannon-Weinner方法對4個生態區域的表型性狀遺傳多樣性指數進行計算,將每個地區內所有種質的質量性狀的類型分布頻率進行統計,計算多樣性指數平均值表示此區域內的遺傳多樣性程度[28-29],計算公式為:

式中:S為表型分類數;Pi為該性狀第i類的表現頻率[7]。

2 結果與分析

2.1 貴州野生獼猴桃資源分布及各區域遺傳多樣性指數

由圖1可知,本次調查與研究貴州野生獼猴桃資源共計12個種(變種)146份資源,其中引進并嫁接保存在資源圃的國內外資源6份,貴州本土收集的野生資源140份,分布于貴州8個地州市,南部苗嶺8個種65份資源,東部武陵山5個種26份資源,西部烏蒙山4個種26份資源,北部大婁山4個種23份資源,使用當地野生美味獼猴桃繁育的苗木作為砧木,將資源進行嫁接保存。遺傳多樣性指數是反映物種豐富度的重要指標[28],其數值的高低可以反映地區間物種的栽培演化趨勢[30-31]。將146份資源按照采集地點劃分為4個區域,以不同地區間樣品的差異進行遺傳多樣性分析。

圖1 貴州野生獼猴桃種質資源分布

貴州各區域獼猴桃種質資源的表型遺傳多樣性有一定差異,146份貴州獼猴桃種質資源表型遺傳多樣性指數為1.28;其中,南部苗嶺(1.26)、西部烏蒙山(1.22)位于貴州南部和西北部,在云貴高原的過渡地區,均高于北部大婁山(1.21)和東部武陵山(1.17),以各區域遺傳多樣性指數可初步判斷貴州野生獼猴桃資源間南部苗嶺、西部烏蒙山、北部大婁山與東部武陵山在演化進程上從遺傳多樣性指數高的地區向低的地區進行演化(圖2)。

圖2 貴州野生獼猴桃資源區域間遺傳多樣性指數

2.2 貴州野生獼猴桃資源質量和數量性狀

146份獼猴桃資源的48個質量性狀存在豐富的多樣性(表2),果實形狀主要為長圓形,約20.5%;葉片形狀中闊卵形葉片占比例最大,約40.41%;果肉顏色黃綠占比例最大,約45.21%;果心顏色有白色、綠白色、淺黃、橙色、紫紅,其中白色占85.62%。

表2 貴州野生獼猴桃質量性狀分布頻率

以9個數量性狀對146份獼猴桃資源的數據統計結果(表3),9項指標變異系數為14.98%～74.33%,呈現出豐富多樣性。獼猴桃資源Vc變異范圍為3.87～277.00 mg/(100 g),均值為67.11 mg/(100 g),變異度為74.33%;糖酸比的變異范圍為1.18～26.57,均值為7.80,變異度57.60%;單果重變異范圍為0.75～135.00 g,均值為33.77 g,變異度為70.21%,單果重最小的為革葉獼猴桃,僅為0.75 g;果形指數的變異范圍為0.82～3.15,均值為1.31,變異度為25.66%;可溶性總糖的變異范圍為1.30%～15.8%,均值為6.77%,變異度為46.87%。

表3 貴州野生獼猴桃資源的數量性狀

2.3 貴州野生獼猴桃資源主成分分析

由表4看出,主成分以累計貢獻率大于75%的依據來選擇,前14個主成分累計貢獻率達75.076%,基本可以反映原始因子所代表的大部分信息。

表4 貴州野生獼猴桃各表型性狀因子負荷量

表4中下劃線表示特征向量絕對值最大的3個值,以反映其對應性狀的貢獻率,第一主成分特征值為19.629,與新梢被毛、果實被毛、果實被毛類型呈正相關;第二主成分與單果重呈正相關,與果實形狀和花冠類型呈負相關;第三主成分與髓部形狀呈正相關,果點大小、果點狀況呈負相關;第四主成分與果心大小和枝條髓部呈正相關,與糖酸比呈負相關;第五主成分與樹勢、葉橫徑呈正相關,與花序類型呈負相關;第六主成分與枝條色澤、可溶性總糖含量呈正相關,與花藥顏色呈負相關。

51.911%的累計貢獻率來自前6個主成分,所以評價貴州獼猴桃種質資源的重要指標可認為是新梢被毛、果實被毛、果實被毛類型、單果重、果實形狀、花冠類型、髓部形狀、果點大小、果點狀況、果心大小、枝條髓部、糖酸比、樹勢、葉橫徑、花序類型、枝條色澤、可溶性總糖含量、花藥顏色。這樣可以簡化描述指標,提高貴州野生獼猴桃種質資源評價和選育鑒定工作的效率。

PC1(第一主成分)和PC2(第二主成分)的貢獻率分別是19.629%和9.166%,以PC1 和PC2 分別為縱橫坐標,繪制不同性狀主成分值散點圖(圖3)。圖3 揭示了不同性狀之間在PC1和PC2坐標軸上的關系,使主成分分析結果更加直觀的通過位置分布看出性狀之間是否相關。

新梢被毛(HAB)、果實被毛(FH)、果實被毛類型(TFH)、果實被毛色澤(HCF)等性狀在PC1 主成分值上基本一致,與PC1呈正相關,比重較高;花冠類型(BT)和果實形狀(FS)在PC2 主成分值上比較接近,且與PC2呈負相關,單果重(FW)在PC2 主成分上值較大,在主成分分析中,性狀間位置相近的性狀說明存在相關性。

2.4 貴州野生獼猴桃各性狀R型聚類分析

如圖4所示,貴州野生獼猴桃在歐氏距離D=19.0 處可將貴州獼猴桃的57個性狀分為3類。第Ⅰ類包括花瓣內側主色、花絲顏色等性狀,主要描述花朵和果實內在的相關性狀;第Ⅱ類包括被毛密度和果實被毛密度等指標,主要描述枝條、果實、葉片的被毛情況;第Ⅲ類有果點大小、果點狀況等指標,主要描述皮孔、果點、葉片的相關性狀。

圖4 貴州野生獼猴桃57個性狀R型聚類分析

歐氏距離最近的性狀是花瓣內側主色和花絲顏色,果實被毛和果實被毛色澤,新梢被毛和被毛顏色,被毛類型(新梢)和果實被毛類型,說明這幾個性狀存在相似性,在聚類分析中差異不明顯,在應用時保留其中一個性狀可起到簡化作用,不影響聚類效果。

2.5 貴州野生獼猴桃資源表型性狀Q型聚類分析

Q型聚類分析的功能是建立一種分類方法,綜合利用多個變量的信息對樣本按照它們在性質上的親疏程度進行分類,使得分類結果直觀、清楚地表現其分類結果并且比傳統分類方法更細致、全面、合理。

通過聚類分析,同一類群內的樣品資源在形態特征上較為相似,可反映出相近的遺傳背景[30,32]。采用組間聯結、平方歐氏距離的方法對146份獼猴桃種質資源的57個表型性狀指標進行分析,圖中數字按照資源采集序號進行標注。

在聚類分析中(圖5),146份資源在歐氏距離D=19.25處,將146份資源分為6個類群。第Ⅰ類群有“貴山F203”、“貴山F204”等117份資源,特點是新梢被毛,果實被毛,皮孔長梭形、灰白,果皮顏色為褐色,包括蒙自獼猴桃、糙毛獼猴桃、中華獼猴桃和美味獼猴桃;第Ⅱ類群包括“貴山F126”、“華特”等6份資源,為毛花獼猴桃,其特點是新梢和果實均密被白色絨毛;第Ⅲ類群包括“貴山F134”“貴山F179”“貴山F210”3份資源,包括葛棗獼猴桃和大籽獼猴桃,其特點是果實光凈無毛,無果點,枝條髓心單孔狀,花序類型為單花,新梢無毛,果肉顏色在成熟時呈橙黃色等;第Ⅳ類群只有“貴山F096”“貴山F128”2份資源,為革葉獼猴桃,花瓣內側主色為粉紅色; 第Ⅴ類群包括“貴山F008”和“貴山F053”等4份資源,包括闊葉獼猴桃,其特點是花序為多歧聚傘花序,果實無毛或脫落,果點較大,果頂形狀為淺尖凸;第Ⅵ類群包括“龍城2號”“魁綠”等14份資源,包括軟棗獼猴桃、硬齒獼猴桃和京梨獼猴桃,特點是枝條皮孔明顯、葉片呈披針形,葉尖急尖,果實無毛。

圖5 貴州野生獼猴桃資源Q型因子聚類分析

3 討 論

3.1 貴州野生獼猴桃種質資源分布現狀

貴州地處中國西南,喀斯特地貌突出,區域生物多樣性豐富、生態系統復雜。貴州野生獼猴桃分布最廣、最多的地區是南部苗嶺地區,表型遺傳多樣性指數1.26,包含8個種,65份資源,其中分布有種群數量較小的蒙自獼猴桃;該地區資源性狀類型呈現多樣性,如果實形狀有短圓、梯形等10個類型,葉片形狀包括披針形、卵圓形、心臟形等7個類型,果實被毛類型有6個,種群多樣和性狀類型多樣同時說明該地區的獼猴桃多樣性最豐富。在地理區劃上可以看出,苗嶺在云貴高原的中間地帶,海拔落差(地形起伏)較大,植物類群多樣性較高,有多個自然保護地,比如雷公山國家級自然保護區、茂蘭國家級自然保護區等,植被茂密,適宜獼猴桃的生長繁衍,很多獼猴桃資源的分布呈現出點狀分布的特征,比較適合探討其生物地理起源與擴散途徑。其次是西部烏蒙山,遺傳多樣性指數為1.22,有4個種26份資源,地處貴州西北部高寒冷涼地區,果實形狀有10個類型,葉片形狀7個類型,類型多樣可能是該地區多樣性指數較為豐富的原因;北部大婁山遺傳多樣性指數為1.21,包含4個種,23份資源,種群和資源數量較少,從而導致該地區的多樣性稍低;東部武陵山遺傳多樣性指數為1.17,野生獼猴桃的性狀類型較少,多樣性最低。

現有研究顯示,貴州有27個種[5],本文對收集到的12個種(變種)進行了區域分布探討。其中分布最多的是美味獼猴桃和中華獼猴桃,在全省各地均有分布,野生果實產量可觀,具有一定經濟價值,優異的資源較多,有大果型、硬毛紅肉型、高Vc型等;硬齒獼猴桃和京梨獼猴桃分布也較廣,尤其是以武陵山脈梵凈山區域為主,田間溝坎隨處可見;毛花獼猴桃在多個地區均有分布,苗嶺山脈最多,單果重較小,成熟期在10月底至11月份,口感較酸,Vc含量均較高;葛棗獼猴桃在全省多地均有分布,因其成熟時果實橙色,在野外也極容易辨別;革葉獼猴桃僅在武陵山脈發現,其花呈粉紅色,可作為觀賞性資源進行發掘利用;闊葉獼猴桃花序為總狀花序,果實呈串狀,在貴州黔東南州分布較多;糙毛獼猴桃在苗嶺地區分布較多,當地俗稱“馬奶子”,果實較小且澀,口感較差;大籽獼猴桃在貴州多處均有發現,多數分布在苗嶺山脈,被當地農戶作為抗澇性砧木;在荔波發現蒙自獼猴桃,果實小,果點明顯、大、零星有黃褐色糙毛。

貴州獼猴桃資源種類豐富,有巨大的遺傳價值。但近年的調查數據顯示,整個獼猴桃屬植物野生種群的現狀不容樂觀,一方面是部分野生獼猴桃種質資源的經濟性狀不明顯,得不到當地群眾的重視,缺乏有效保護,從而造成了資源流失;另一方面是野生獼猴桃分布不均、雌雄比例失調、人類活動的擴張、自然環境日益惡劣及野外采集的破壞性都會對野生獼猴桃資源帶來不利影響。在后續資源收集過程中,應加強資源保護的宣傳力度,健全種質資源的保存規范,在獼猴桃集中分布的核心區建立自然保護區,設立隔離柵欄和警告標志,禁止無關人員進入,還要加強貴州野生獼猴桃外植體活體保存的相關技術研發,建立獼猴桃種質資源圃等方式進行保護。

3.2 貴州野生獼猴桃優異資源、優良性狀分布情況

植物穩定的優良性狀是植物基因型和環境共同作用的結果[33],穩定且優良的性狀可作為實生選種或雜交親本的重要材料,貴州存在大量的優異資源和優良性狀,為獼猴桃資源鑒選工作提供重要的種質基礎。在此次調查中,不僅探討了貴州獼猴桃的遺傳多樣性水平和各種(變種)的分布,還發現資源的優良性狀分布具有區域性,比如,貴州野生獼猴桃中的大果資源,貴山F115,最大單果重達到137 g,平均單果重77.16 g,貴山F005的平均單果重114.17 g,此類“大果型”資源多存在于東部武陵山,少數在南部苗嶺,推測該地區資源中控制獼猴桃果實單果重的功能基因表達突出,可在后續育種中深入挖掘利用;在貴州西部烏蒙山發現野生美味獼猴桃果肉為紅色或紫紅色性狀的資源,顏色較“紅陽”獼猴桃更加鮮艷,可作為“紅肉獼猴桃”的預備育種資源進行利用;野生獼猴桃中Vc含量高的資源多在南部苗嶺分布,其中貴山F121、貴山F144和貴山F179的Vc含量分別達到203.85,187.27,200.69 mg/(100 g),此外,該地區的毛花獼猴桃數量較多,其中是否存在自然雜交或遺傳漸滲有待進一步探討;獼猴桃抗逆性狀在獼猴桃生產中也極為重要,比如部分野生資源具有耐澇性,較強的樹勢等,耐澇性相對較強的資源有大籽獼猴桃和葛棗獼猴桃,在南部苗嶺和西部烏蒙山均有發現;樹體生長勢極強的資源在全省都有分布,都為美味獼猴桃,這些資源的實生苗可作為抗逆型砧木進行培育,也可作為雜交育種親本。

3.3 貴州野生獼猴桃種質資源表型遺傳多樣性

表型性狀變異是生物遺傳多樣性在形態水平上的表現[34],表型聚類分析中,貴州獼猴桃種質資源的歐氏距離為1.00～25.00之間,表明貴州獼猴桃資源具有豐富的多樣性。初步聚類結果顯示被分為6個類群,可以得到每個類群在育種中的利用價值。第I類群主要包含生長勢強、大果型資源,可作為育種的主要材料,包括糙毛獼猴桃、蒙自獼猴與美味獼猴桃桃和中華獼猴桃,中華獼猴桃與美味獼猴桃能夠聚類到一起,說明2個種(變種)的遺傳距離較近,與劉磊和黃宏文的研究一致,均表示這2個種在貴州分布最多、最廣,且種間具有同域分布及天然雜交現象[5,17,35],糙毛獼猴桃和蒙自獼猴桃遺傳距離較近,且與中華獼猴桃近緣,在表型聚類中,新梢均為被毛,密度稀疏,髓部均為片層狀等共同特點,其真實的遺傳關系在后續的分子標記分析中再次進行研究討論;第Ⅱ類群中只有毛花獼猴桃,特點是果實和新梢均被白色絨毛,其中,Li等的研究顯示,中華獼猴桃與毛花獼猴桃遺傳距離較近,存在近緣關系[36],本文中,毛花獼猴桃與中華獼猴桃、美味獼猴桃的距離一致,均存在近緣關系,與Li等的研究稍有不同;第Ⅲ類群中葛棗獼猴桃與大籽獼猴桃聚到一類,這2個種的特點是髓實心,白色,果面光滑無毛,無果點,成熟時果肉橙色;第Ⅵ類群包括硬齒獼猴桃、京梨獼猴桃和軟棗獼猴桃,硬齒獼猴桃與京梨獼猴桃親緣關系較近,此研究與黃宏文、姜存良的研究相符[5,10],在這些資源中,軟棗獼猴桃果實不需后熟直接食用,且果實光潔無毛,可作為特色資源進行小面積種植。聚類分析區分了各類群間資源的親緣關系,明確種間性狀特征。

3.4 聚類分析在種質資源應用分類中的意義

本文調查了146份資源的57個性狀指標,數據量、工作量較大,在數據處理中,使用R型聚類和主成分分析進行指標的簡化。R型聚類分析是對研究對象的表型指標進行聚類,討論各性狀間的關系,從而得出差異,分類后可評價性狀間的關聯性,驗證主成分分析結果,簡化種質資源的篩選、評價指標[26]。主成分分析主要通過原變量間具有較強相關性的特點,對原變量進行降維,采用綜合因子或少量的因素來描述多種指標或因素之間的關系,使這些綜合因子盡可能保留原變量的信息量,而且彼此之間互不相關,從而達到簡化的目的[24,27-28,37]。從R型聚類樹狀圖可以看出,在歐氏距離19.0處,將57個獼猴桃資源性狀分為3類,每一類群下各性狀關聯性較強,邏輯相關的指標有花瓣內側主色和花絲顏色,果實被毛和果實被毛色澤,新梢被毛和被毛顏色,被毛類型和果實被毛類型,這幾個性狀之間可進行簡化,對數據分析能起到精簡的作用,這與主成分分析的結果是相吻合的,也說明了用這2種方法對表型指標進行簡化、篩選是可行的,有效的。

獼猴桃的表型性狀是基因遺傳與環境協同作用的綜合體現,此研究中,貴州省野生獼猴桃資源分布區域的生態條件存在差異,對聚類結果也可能會產生影響。今后結合分子標記研究獼猴桃的遺傳多樣性并與此文結論相互印證將會更加準確地評價貴州遺傳多樣性水平,也將是后續工作的重點。

4 結 論

本文有效揭示了貴州省野生獼猴桃種質資源豐富的多樣性和親緣關系,明確獼猴桃各種群間性狀區分特征和部分優良資源性狀的地理分布,對貴州獼猴桃種質資源的種質鑒定、保護利用和品種選育有重要意義。