前蛋白轉化酶枯草桿菌蛋白酶/kexin 9型(PCSK9)在大腦中作用及與卒中關系

田竺，胡群亮

人類前蛋白轉化酶枯草桿菌蛋白酶/kexin 9型(proprotein convertase subtilisin/kexin，PCSK9)基因位于染色體1p32.3上，血漿中PCSK9主要由肝細胞分泌，并以活性和非活性的形式存在于血漿中[1]。PCSK9活性形式由全長異二聚體組成，該異二聚體主要與低密度脂蛋白(low-density lipoprotein，LDL)顆粒相關，無活性的異二聚體占總循環15%～40%[2]。長期以來PCSK9在調節血漿低密度脂蛋白膽固醇(low-density lipoprotein cholesterol，LDL-C)及其在家族性高膽固醇血癥中研究較多[3-4]。但在2003年，在原代小腦神經元中首次發現PCSK9在細胞凋亡過程中上調的mRNA[5]。

PCSK9最突出的作用是它與肝臟中的低密度脂蛋白受體(LDL receptor，LDLR)的相互作用，它還與LDL 受體相關蛋白1(LDL receptor-related protein 1，LRP1)和B類清道夫受體CD36結合[6-7]。LRP1是一種細胞膜上的大型內吞受體，參與脂質穩態、細胞內信號傳導和Aβ肽的清除，它在肝臟中的肝細胞和腦中的血管細胞、神經元和星形膠質細胞中均可表達。CD36參與原纖維Aβ介導的小膠質細胞活化和氧化LDL攝取，PCSK9水平升高刺激巨噬細胞中CD36的表達。在大腦中，PCSK9與幾種將膽固醇運輸到神經元的受體相互作用，包括LDLR、極低密度脂蛋白受體和載脂蛋白E受體2(apolipoprotein E receptor 2，ApoER2)[8]。

近年來逐漸證實了PCSK9在中樞神經系統中的重要作用[9-10]。盡管大腦是體內膽固醇含量最高的器官，幾乎占人體總膽固醇的25%，但其膽固醇的合成和穩態維持獨立于其他器官和組織。膽固醇和PCSK9在正常條件下都不會穿過血腦屏障。但在不同疾病狀態下，由于血腦屏障通透性改變和血管破裂可能導致影響大腦內膽固醇穩態。腦脊液中的PCSK9的平均濃度為5 ng/mL，并在24 h內保持穩定水平，而血清PCSK9平均濃度存在一定晝夜濃度變化，可由下午183 ng/mL到凌晨升高到552 ng/mL[11]。大腦中的膽固醇代謝和穩態維持獨立于外周血液系統。基于此，本文綜述了PCSK9在神經系統中的生理作用及與卒中的關系。

1 P CS K9在大腦中的作用

1.1 神經元分化 PCSK9在包括肝細胞腎間充質細胞和腦神經元細胞等有增殖能力的細胞中高表達[12]。在發育過程中，在斑馬魚的神經發生開始時及小鼠端腦和小腦神經發生期間即可檢測到PCSK9。成年后，PCSK9僅在斑馬魚的皮層、顱內和小腦顆粒神經元等區域以及小鼠部分延髓區域表達[13]。PCSK9可通過驅動神經元分化促進神經發生，在小鼠胚胎神經祖細胞中發現，PCSK9的過度表達導致有絲分裂后神經元數量增加，同時未分化神經上皮細胞數量減少[5]。

PCSK9在神經元分化的機制作用可能與其在LDLR代謝中的機制作用無關。在小鼠P19胚胎癌細胞中，維甲酸誘導的神經外胚層內源性PCSK9 mRNA水平增加了7倍，但LDLR蛋白水平保持恒定[14]。

此外，神經發生過程中PCSK9的表達不受參與膽固醇調節的轉錄因子的控制。在肝臟中，PCSK9轉錄被固醇調節元件結合蛋白2(SREBP-2)高度上調，SREBP-2是一種膜結合轉錄因子，可激活編碼參與膽固醇合成的酶的基因表達。與PCSK9不同，維甲酸不會改變SREBP-2 mRNA的表達，這表明這些神經外胚層細胞衍生物中PCSK9表達的增加受到與其他膽固醇生成器官(如肝臟)中PCSK9表達不同的機制的調節[15]。

1.2 LDL受體家族代謝 PCSK9通過促進LDL受體家族的溶酶體降解來增加發育中大腦的膽固醇水平。這些受體結合腦中的主要膽固醇載體載脂蛋白E(apoE)，并將apoE 結合的膽固醇從細胞周圍液轉運到神經元中，從而降低膽固醇水平。在PCSK9 基因敲除小鼠的大小端腦和小腦的LDLR蛋白水平顯著高于野生型小鼠，apoE水平降低約25%[13]。

成年小鼠的體外和體內關于大腦中PCSK9是否靶向LDLR，VLDLR和ApoER2降解之間的研究結果目前仍存在一定矛盾。如與未加入PCSK9的空白對照組相比，加入PCSK9共培養的人胚胎腎細胞293(HEK293細胞)的LDLR、VLDLR、ApoER2受體蛋白水平顯著降低[16]。而在PCSK9基因敲除的成年小鼠中發現，盡管PCSK9和LDLR mRNA在延髓中共定位，但與野生型小鼠相比，延髓或腦脊液中的LDLR和ApoE蛋白水平沒有顯著差異[13]。此外，PCSK9的過表達或缺失并不影響成年小鼠大腦海馬體和腦皮質中的LDLR、VLDLR 或ApoER2水平[16]。

成人大腦中體外和體內結果之間的差異一方面原因是PCSK9在膽固醇調節中的作用具有一定細胞或組織特異性，另一方面可能由于成年時期內源性PCSK9 濃度遠低于發育過程中的濃度，PCSK9水平的變化不足以改變受體水平。例如，與野生型小鼠相比，在大鼠大腦中動脈短暫性閉塞模型誘發的缺血性卒中后病變側齒狀回的PCSK9表達顯著增加。盡管缺血性卒中后野生型和PCSK9基因敲除小鼠的LDLR蛋白水平均降低，但PCSK9基因敲除小鼠的LDLR水平降低更多，降低幅度達到了50%，這也提示PCSK9對于LDLR降解是必需的[13]。上述這些發現表明PCSK9可調節成年大腦中LDLR水平，但PCSK9水平變化僅在大腦發生卒中等顯著病理改變時才可能被檢測到。

1.3 細胞凋亡 最初PCSK9在神經細胞凋亡細胞模型中發現，但隨后的研究顯示PCSK9同時具有促凋亡和抗凋亡作用。

PCSK9可促進缺鉀小腦顆粒神經元的凋亡，PCSK9的過表達也可誘導細胞死亡，而PCSK9的沉默限制細胞死亡。此外，PCSK9在包括星形孢菌素(STS)誘導的缺鉀小腦顆粒神經元和神經生長因子剝奪的背根神經節神經元等其他凋亡模型中也證實了其具有促凋亡特征[17]。在人神經膠質瘤U251 細胞中發現，沉默PCSK9 后細胞表現出凋亡特征，包括細胞收縮，膜完整性喪失，核碎裂和染色質壓縮，而PCSK9過表達的細胞具有正常形態[18]。提示PCSK9可促進神經膠質瘤U251細胞的存活。

目前已經證實，PCSK9可通過外在和內在的凋亡途徑促進細胞死亡，并且可能通過JNK途徑發揮作用[19]。在缺鉀小腦顆粒神經元模型中，被RNA干擾(RNAi)抑制的具有PCSK9的缺鉀小腦顆粒神經元細胞具有較低水平的磷酸化的c-Jun和切割的半胱天冬酶-3(caspase-3)兩種促凋亡蛋白，其中磷酸化的c-Jun是JNK依賴性細胞凋亡所必需的，而切割的caspase-3是參與細胞凋亡的重要分子。有趣的是，ApoER2已被證明可通過對JNK途徑失活來促進神經元存活。與對照細胞相比，被RNAi抑制的具有PCSK9的缺鉀小腦顆粒神經元細胞中的ApoER2水平增加了41%。而缺鉀小腦顆粒神經元細胞中ApoER2水平降低導致先前較低水平的切割的caspase-3增加，表明PCSK9至少部分通過控制ApoER2水平而介導細胞凋亡[20]。在星形孢菌素誘導的缺鉀小腦顆粒神經元細胞凋亡模型中，RNA干擾PCSK9后降低了神經元細胞中caspase-3的活化，但對磷酸化c-Jun活性沒有影響，表明PCSK9 也可能通過JNK非依賴性途徑促進細胞凋亡[20]。

此外，PCSK9還通過內在或線粒體凋亡途徑介導神經膠質瘤U251細胞存活。PCSK9小干擾RNA(siRNA)增加促凋亡蛋白caspase-3的活化，下調抗凋亡蛋白如XIAP和p-Akt，并增加Bax/Bcl-2的比例，導致細胞色素c釋放增加從線粒體進入細胞質。PCSK9過表達具有相反的作用，減少切割的caspase-3水平，Bax/Bcl-2的比例和細胞色素c釋放的量，并增加細胞中存在的XIAP 和p-Akt 的含量[18]。雖然PCSK9調節細胞凋亡的途徑已經闡明，但PCSK9改變途徑中不同蛋白質濃度水平的確切機制仍不清楚，需要更多的研究來確定PCSK9是直接作用于這些蛋白質還是通過下游作用信號通路的影響。

與LDLR代謝相似，在體內未證實上述體外研究結果。在心臟缺血/再灌注損傷(左前降支冠狀動脈結扎術)之前，期間或之后施用PCSK9抑制劑(PCSK9i)Prep2-8三氟乙酸鹽不影響通過TUNEL測定法測量的凋亡細胞的百分比和大鼠腦中Bax和Bcl-2的水平[21]。此外，在小鼠中動脈阻塞實驗后的海馬梗死或半影中未觀察到PCSK9 mRNA表達，這表明PCSK9在嚙齒動物模型的神經元死亡中沒有顯著作用[13]。

1.4 神經炎癥 最近研究表明PCSK9可能促進神經炎癥[21-22]。心臟缺血/再灌注損傷的大鼠模型顯示p-NFκB/NFκB水平升高以及星形膠質細胞和小膠質細胞的活化。靜脈內施用PCSK9抑制劑Prep2-8三氟乙酸鹽顯著降低p-NFκB表達并減少由心臟缺血/再灌注損傷誘導的反應性小膠質細胞和星形膠質細胞增殖和肥大。有趣的是，PCSK9抑制劑并未降低大腦中PCSK9的水平，這表明PCSK9抑制劑并未穿過血腦屏障，也未直接作用于大腦。這些結果提示抑制PCSK9表達可降低血清PCSK9水平、降低炎癥狀態，以減少大腦內炎癥水平。PCSK9也可能通過控制LDLR和apoE水平參與局部神經炎癥。在BV2小膠質細胞和人THP-1單核細胞中的研究發現apoE和apoE模擬物通過與LDLR相互作用降低LPS介導的TNF-α和IL-6分泌以及p44/42MAPK，JAK2和STAT3磷酸化[23]。當然今后仍需要更多的研究來確定PCSK9在控制大腦炎癥和免疫方面中的全身和局部作用。

2 P CS K9與卒中

嚙齒動物研究顯示短暫性大腦中動脈閉塞后PCSK9 mRNA 水平上調以模擬缺血性卒中[12]。PCSK9 mRNA表達在齒狀回中增加，但在梗死或半影中未增加，表明PCSK9在缺血性卒中后的神經元凋亡中不起作用。在短暫性大腦中動脈閉塞后野生型和PCSK9 基因敲除小鼠海馬中發現LDLR蛋白水平均降低，但PCSK9基因敲除小鼠降低50%，提示PCSK9促進缺血性卒中后LDLR代謝。對由心臟缺血/再灌注損傷誘導的大鼠腦損傷的研究表明，PCSK9抑制顯著減少了損傷后反應性星形膠質細胞和小膠質細胞的數量，表明PCSK9也參與神經炎癥[12]。

人類的遺傳研究報告了缺血性卒中風險與PCSK9 基因中幾個功能獲得性(gain-of-function，GOF)突變之間的關聯，這些突變導致血漿LDL-C升高。如研究顯示，rs2479408和rs1711503 GOF變異與408例漢族腦缺血性卒中患者和348例非漢族對照者的腦缺血性卒中顯著相關。rs505151(E670G)GOF 突變與同一人群的缺血性卒中風險無關[24]；然而，對同一基因變異的另外兩項研究確實發現了突變與卒中發病率之間的關聯[25]。比利時卒中研究(BSS)分析了237名中歐小血管閉塞或大血管動脈粥樣硬化(LVA)的rs505151(E670G)GOF突變，發現該基因變異與血漿LDL-C水平升高，冠狀動脈粥樣硬化和LVA卒中的風險顯著相關[26]。

PCSK9 基因中的大多數功能喪失(loss of function，LOF)變異與缺血性卒中風險無關。著名的ARIC動脈粥樣硬化研究在15年間跟蹤了3 363例黑人受試者(其中2.6%存在PCSK9突變)和9 524例白人受試者(3.2%存在PCSK9突變)，并未發現PCSK9 LOF Y142X或C679X變異與受試者間卒中發生率存在差異[27]。同樣在對8個觀察隊列和一項他汀類藥物治療隨機試驗的Meta分析發現，在具有相同LOF變異的患者中，PCSK9突變與卒中發病率之間沒有關聯[28]。在161例漢族缺血性卒中患者和483例匹配對照中，rs11583680 LOF變異與缺血性卒中或其亞型的風險無關[29]。而對功能喪失rs11591147(R46L)PCSK9變異的幾項研究Meta分析也發現與缺血性卒中和缺血性卒中亞型無關。有趣的是，來自英國生物庫的337 536 個個體的PCSK9 LOF變體rs11591147(R46L，G/T)的孟德爾隨機研究發現T等位基因在假設驅動組中對缺血性卒中具有保護作用，并且與卒中具有名義上顯著的相關性[30]。雖然大多數研究表明PCSK9 LOF變異與缺血性卒中發病率無關，但由于卒中的測量和分類不同，研究人群之間的差異以及研究之間統計分析方法的差異，研究結果也有所不同。

雖然低PCSK9和LDL-C水平可能不會降低基線卒中風險，但可以肯定的是PCSK9抑制劑有助于降低高膽固醇和心血管疾病高風險患者的卒中發病率。一項薈萃分析得出結論，所有降膽固醇治療均降低了患者的卒中風險，因為降低循環膽固醇水平可降低動脈粥樣硬化和栓塞血栓的風險[31]。針對PCSK9的單克隆抗體evolocumab的干預對卒中效果的研究顯示，與接受安慰劑組相比，接受evolocumab藥物的組中卒中顯著減少，而他汀類藥物組與安慰劑組結果并無統計學差異[32]。然而，PCSK9抑制劑的其他分析發現與卒中減少無關。著名的長期評估低密度脂蛋白膽固醇的開放性研究(OSLER 研究和ODYSSEY LONG TERM研究) 表明，evolocumab和alirocumab在高心血管風險的高膽固醇血癥患者中的長期安全性和耐受性及對短暫性腦缺血發作、卒中發生率并無顯著影響[33]。但上述兩個研究時間相對較短，研究時間分別為1年和1.5年，今后需要更長時間的研究來充分評估evolocumab和alirocumab對此類患者卒中發病率的影響。

出血性腦卒中發病率相對較少，針對此類患者的遺傳學研究也相對較少，而研究觀察到PCSK9與出血性卒中間并無關聯。對23項研究的Meta分析發現，低LDL-C水平與出血性卒中有關，但理論上可能是由于患者總體健康狀況不佳，而不是PCSK9或低LDL-C的致病作用[28]。

3 總結及展望

盡管PCSK9 在肝臟中的作用已得到充分研究，但PCSK9在大腦中的作用仍不清楚。但關于PCSK9在神經系統中的作用也越來越多。PCSK9參與神經祖細胞向神經元的分化，LDLR家族中受體靶向溶酶體降解，神經元凋亡的調節以及大腦中星形膠質細胞和小膠質細胞的活化。在細胞系、動物模型和遺傳研究也揭示了PCSK9在缺血性卒中中的作用。關于PCSK9是否直接對大腦有局部作用還是通過對外周組織的全身作用再影響大腦是今后需要進一步研究的問題，同樣尚不清楚PCSK9是否通過升高血漿LDL-C水平對炎癥產生全身作用，或者PCSK9是否也在大腦局部中起作用以控制炎癥。對PCSK9單克隆抗體的全身性和局部性腦效應研究，以及這些抗體在腦卒中等不同中樞神經疾病中能否或在多大程度上可以穿過血腦屏障都是今后值得探索的話題。