基于網絡藥理學探討黃連有效成分治療糖尿病性心肌病的作用機制

董麗妍,方紅城,陳 潔,冼紹祥,李志芳,葉夢思,林劍華,黃小靖

糖尿病性心肌病(diabetic cardiomyopathy,DCM)是糖尿病的并發癥之一,以左心室擴張和肥大、心臟功能下降為特點[1],主要發病機制為代謝紊亂、微血管病變、心肌細胞凋亡、心肌纖維化等[2],最終導致心力衰竭的發生,危及生命。現代醫學診治糖尿病性心肌病方面取得巨大進步,如血管緊張素轉換酶抑制劑(ACEI)或血管緊張素Ⅱ受體拮抗劑(ARB)等藥物可用于逆轉糖尿病性心肌病心室重構;注射用胰高血糖素樣肽1類似物(GLP-1)可用于抑制心肌細胞凋亡,減少心肌受損[3-4]。由于西藥具有副作用明顯、不足以延緩或控制疾病發展等特點,西藥診治糖尿病性心肌病仍存在局限性。中醫藥具有多靶點、毒副作用少等諸多優勢[5],在診治糖尿病性心肌病方面可以彌補西藥的不足,近年來備受關注。

古文獻中未記載糖尿病性心肌病的病名,根據其癥狀可歸屬于中醫學“消渴”“消癉”“胸痹”等范疇。中醫學認為,糖尿病性心肌病的發生多與先天稟賦不足,后天飲食不節、過勞縱欲、情志不暢等因素相關,陰虛燥熱是其發病病機[6],中藥黃連具有清熱燥濕之效,故可用于治療糖尿病性心肌病。古代醫家多用黃連治療消渴及其并發癥。《名醫別錄》有云:黃連能夠“止消渴”[7]。黃連排在《太平圣惠方》治療消渴病常用藥中的前3位。《普濟方》中記載治療消渴的黃連復方13個[8]。現代藥理學亦表明,黃連具有降糖、改善胰島素抵抗、抗炎、調脂、抗氧化等作用,用于治療糖尿病性心肌病療效顯著[9-12],然而其作用機制仍有待進一步深入研究,故基于網絡藥理學探討黃連治療糖尿病性心肌病的作用機制具有重要意義[13]。

1 資料與方法

1.1 數據庫與軟件

主要數據庫包括:中藥系統藥理數據庫和分析平臺(TCMSP)數據庫(https://old.tcmsp-e.com/tcmsp.php),PubChem數據庫(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/),UniProt數據庫(https://www.uniprot.org/),GeneCards數據庫(https://www.genecards.org/),OMIM數據庫(https://omim.org/),STRING數據庫 (https://string-db.org/cgi/input.pl),Venny2.1(https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/),G:profile數據庫(https://biit.cs.ut.ee/gprofiler/gost)和Cytoscape 3.7.1軟件。

1.2 方法

1.2.1 篩選中藥黃連化學成分和靶點

運用TCMSP數據庫和PubChem數據庫收集得到黃連的化學成分,根據口服生物利用度(oral bioavailability,OB)≥30%及類藥性(drug like,DL)≥0.18[14]選取中藥黃連主要活性成分。

1.2.2 疾病靶點的獲取

以“diabetic cardiomyopathy”為關鍵詞,運用OMIM和GeneCards數據庫進行檢索,在GeneCards數據庫中選擇relevance score≥10的靶點,與OMIM數據庫得到的靶點取交集,得到與糖尿病性心肌病相關的疾病靶點。

1.2.3 網絡構建

將得到的黃連成分靶點與糖尿病性心肌病靶點交集,通過Cytoscape 3.7.1軟件制作“疾病-藥物-成分-靶點”網絡圖。

1.2.4 核心靶點篩選

運用STRING數據庫導入交集靶點,選擇“homo sapiens”物種,制作靶點的蛋白-蛋白相互作用(PPI)網絡圖。

1.2.5 富集分析

根據DAVID數據庫行基因本體(gene ontology,GO)生物過程富集分析結果繪制柱狀圖,根據京都基因與基因組百科全書(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG)通路富集分析結果繪制氣泡圖。

2 結 果

2.1 黃連素成分收集及篩選

本研究通過TCMSP數據庫平臺,根據OB≥30%、DL≥0.18,檢索并篩選中藥黃連有效化學活性成分,共搜集到14個黃連符合的活性成分;將其通過PubChem數據庫進行結果辨別,最后得到黃連有效成分10個(見表1)。通過UniProt數據庫進行GeneSymbol轉換,得到對應靶標88個。

表1 中藥黃連有效活性成分

2.2 “疾病-藥物-成分-靶點”網絡構建和分析

以“diabetic cardiomyopathy”為關鍵詞在GeneCards數據庫搜索有關糖尿病性心肌病的基因,按照relevance score≥10,與在OMIM數據庫獲取的靶點取交集,提取靶點856個,將相關靶點信息錄入UniProt數據庫中檢索,選擇人源靶點,最終獲得疾病靶點786個。運用Venny 2.1在線數據庫取交集,繪制88個黃連生物堿化合物靶點與786個糖尿病性心肌病相關疾病靶點基因韋恩圖,得到70個交集靶點基因,可能是黃連治療糖尿病性心肌病的關鍵靶點(見圖1)。通過Cytoscape 3.7.1軟件構建糖尿病性心肌病與黃連相關“疾病-藥物-成分-靶點”網絡(見圖2)。網絡中共有82個節點(其中疾病靶點1個,藥物靶點1個,藥物化合物節點10個,靶基因節點70個)和186條連接邊。其中紅色六邊形代表疾病(糖尿病性心肌病),黃色圓形代表中藥(黃連),綠色箭頭代表黃連有效成分,藍色三角形代表疾病與藥物有效成分相關的作用靶點。其中連接度越大,則節點形狀越大,提示節點在網絡中的位置越重要。對“疾病-藥物-成分-靶點”網絡進行拓撲分析,連接度排在前3位的活性成分為槲皮素、小檗堿及巴馬汀,提示該3種活性成分是整個網絡的關鍵,可能是黃連治療糖尿病性心肌病的主要化合物。

圖1 糖尿病性心肌病-黃連相關靶點基因韋恩圖

圖2 糖尿病性心肌病-黃連藥物活性成分-作用靶點網絡圖

2.3 黃連有效成分作用靶點PPI 網絡的構建及關鍵靶點聚類

已有研究表明,網絡中蛋白的度值(Degree)越大,其重要性越大。對黃連及糖尿病性心肌病的交集靶點網絡進行拓撲分析,選取度值排名前20位的靶點(見表2)。黃連有效成分作用靶點的PPI網絡如圖3所示。通過“MCODE”插件行聚類分析PPI網絡,最終產生4個子網絡。子網絡1得分為4.571分,有5個節點、9條邊,包含的節點有原癌基因(MYC)、B細胞κ輕肽基因增強子核因子抑制因子α(NFKBIA)、過氧化物酶體增殖物激活受體(PPARA)、絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)1和一氧化氮合酶2(NOS2);子網絡2得分為3.000分,有4個節點、6條邊,包含節點趨化因子配體2(CCL2)、細胞間黏附分子1(ICAM1)、白細胞介素8(CXCL8/IL-8)和白細胞介素10(IL-10);子網絡3得分為3.000分,有8個節點、10條邊,包含節點基質金屬蛋白酶(MMP)-1、MMP-2、胰島素樣生長因子2(IGF2)、血管內皮生長因子 A (VEGFA)、表皮生長因子受體(EGFR)、牛蛋白激酶Cβ1(PRKCB)、人蛋白激酶(PRKCA)和嗜中性粒細胞胞漿因子1(NCF1);子網絡4得分為3.000分,有3個節點、3條邊,包含節點血紅素氧合酶1(HMOX1)、核因子紅細胞2相關因子2(NFE2L2)和FOS。詳見圖4。

圖3 黃連有效成分作用靶點PPI網絡

圖4 聚類分析子網絡

表2 黃連對糖尿病性心肌病作用靶點的拓撲學分析(連接度排名前20位)

2.4 靶點生物學功能分析及GO功能富集分析

對糖尿病性心肌病-黃連有效成分交集的70個靶點進行GO分析,GO分析包括分子功能(molecular function,MF)、生物過程(biological process,BP)及細胞組分(cellular component,CC)3個部分。將70個靶點導入g:Profile數據庫進行GO分析,在MF、BP、CC中分別選擇P<0.05且P最小的前10條路徑(P值越小,則通路越關鍵),運用Excel制作條形圖(見圖5)。其中,MF富集的前10條通路包括:酶結合(enzyme binding)、信號受體結合(signaling receptor binding)、相同的蛋白結合(identical protein binding)、細胞因子受體結合(cytokine receptor binding)、DNA結合轉錄因子結合(DNA-binding transcription factor binding)、一氧化氮合酶調節劑活性(nitric-oxide synthase regulator activity)、RNA聚合酶Ⅱ-特異性DNA結合轉錄因子結合(RNA polymerase Ⅱ-specific DNA-binding transcription factor binding)、核受體活性(nuclear receptor activity)、細胞因子活性(cytokine activity)、配體激活的轉錄因子活性(ligand-activated transcription factor activity)。BP富集的前10條通路包括:細胞對化學刺激的反應(cellular response to chemical stimulus)、化學反應(response to chemical)、對含氧化合物的反應(response to oxygen-containing compound)、對有機物質的反應(response to organic substance)、細胞對有機物質的反應(cellular response to organic substance)、細胞對含氧化合物的反應(cellular response to oxygen-containing compound)、細胞表面受體信號通路(cell surface receptor signaling pathway)、細胞過程的正調控(positive regulation of cellular process)、對刺激反應的調節(regulation of response to stimulus)、生物過程的正向調節(positive regulation of biological process)。CC富集的前10條通路包括:膜小凹(caveola)、細胞外間隙(extracellular space)、細胞器內腔(organelle lumen)、微管確定膜性細胞腔(membrane-enclosed lumen)、胞膜外區(extracellular region)、質膜筏(plasma membrane raft)、膜筏(membrane raft)、膜質微區(membrane microdomain)、質膜蛋白復合物(plasma membrane protein complex)、質膜的內在成分(intrinsic component of plasma membrane)。

圖5 黃連靶向糖尿病性心肌病網絡靶點的GO分析

選取經R語言運行后得到的前20個功能的GO功能富集分析結果(共99個),繪制柱狀圖見圖6。其中,富集最多的通路包含13個靶基因,包括:細胞因子受體結合(cytokine receptor binding)、細胞因子活性(cytokine activity)、RNA聚合酶Ⅱ-特異性DNA結合轉錄因子結合(RNA polymerase Ⅱ-specific DNA-binding transcription factor binding)、DNA結合轉錄因子結合(DNA-binding transcription factor binding)、受體配體活性(receptor ligand activity)、信號受體配體活性(signaling receptor ligand activity)等。

圖6 黃連-糖尿病性心肌病作用靶點GO富集柱狀圖

2.5 靶點通路分析

通過KEGG通路富集分析黃連治療糖尿病性心肌病的可能機制及途徑。KEGG分析獲得153條通路,其中128條有統計學意義(P<0.01)。P-adjust數值越小,提示顯著性越大,由低到高選取排名前20名制作氣泡圖(見圖7)。圖中排序越靠前,表明其通路作用影響越大。KEGG通路富集分析主要富集在糖尿病并發癥中的糖化終末產物及其受體信號通路(AGE-RAGE signaling pathway in diabetic complications)、流體剪切力及動脈硬化(fluid shear stress and atherosclerosis)、磷脂酰肌醇-3-激酶(PI3K)-蛋白激酶B(AKT)信號通路(PI3K-AKT signaling pathway)、蛋白聚糖在癌癥(proteoglycans in cancer)、甲型流感(influenza A)、卡波西肉瘤相關皰疹病毒感染(Kaposi sarcoma-associated herpesvirus infection)、人類巨細胞病毒感染(human cytomegalovirus infection)、缺氧誘導因子1(HIF-1)信號通路(HIF-1 signaling pathway)、腫瘤壞死因子(TNF)信號通路(TNF signaling pathway)、乙型肝炎(hepatitis B)、白細胞介素17(IL-17)信號通路(IL-17 signaling pathway)、美洲錐蟲病(Chagas disease)、丙型肝炎(hepatitis C)、松弛素信號通路(relaxin signaling pathway)、膀胱癌(bladder cancer)、前列腺癌(prostate cancer)、利什曼病(Leishmaniasis)、EGFR酪氨酸激酶抑制劑耐藥性(EGFR tyrosine kinase inhibitor resistance)、瘧疾(malaria)、非洲錐蟲病(African trypanosomiasis)。

圖7 KEGG富集分析氣泡圖

3 討 論

研究表明,糖尿病性心肌病的發病機制與代謝異常、線粒體功能障礙、腎素-血管緊張素-醛固酮系統(RAAS)激活、氧化應激、自噬、炎癥和心臟微血管功能障礙等相關[15]。現代醫學在診治糖尿病性心肌病方面取得重要進展,然而,仍然存在副作用多、不足以延緩疾病進展等局限,中醫藥治療糖尿病性心肌病療效顯著,能彌補西藥的不足,相輔相成。中藥具有多靶點、多作用途徑,在治療糖尿病性心肌病方面療效確切,目前關于中藥單味藥或復方作用于糖尿病性心肌病的機制研究已成為熱點,具有廣闊的應用前景[16]。

本研究主要通過網絡藥理學分析黃連治療糖尿病性心肌病的潛在作用機制。在活性成分研究中,共篩選出黃連的有效成分10個,其中,槲皮素、小檗堿及巴馬汀位居前3位,提示該3種成分是整個網絡的關鍵,可能是黃連發揮療效治療糖尿病性心肌病的主要化合物。槲皮素廣泛存在于多種中藥中,能夠抗炎、抗病毒、抗癌及治療糖尿病及其并發癥[17]。研究發現,槲皮素可通過防止三磷酸腺苷(ATP)水平降低和過氧化物酶體增殖物激活受體γ 共激活因子1(PGC-1)、線粒體解偶聯蛋白2(UCP2)和過氧化物酶體增殖物激活受體(PPAR)表達的改變,改善氧化應激狀態,達到減少心肌纖維化、肥大的作用,能夠用于防治糖尿病性心肌病引起的心肌細胞受損[18-21]。黃連的另一個主要有效成分小檗堿又名黃連素[22],可抑制高糖誘導的心肌成纖維細胞增殖和心肌細胞肥大,減少腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、轉化生長因子β1(TGF-β1)含量,提高一氧化氮(NO)水平,進而改善心臟結構。另外,小檗堿可影響糖脂代謝途徑中關鍵酶的含量,調節PPARα、PPARγ和第四型葡萄糖轉運蛋白(GLUT4)的基因和蛋白表達,增加心肌脂肪的降解與轉運及葡萄糖降解,進而降低心肌游離脂肪酸含量,減輕其對心臟的損害。巴馬汀則以抗感染作用為主[23]。

核心靶點分析中,根據PPI網絡聚類分析的4個子網絡,子網絡1中MYC、NFKBIA、PPARA、MAPK1和NOS2靶點主要涉及炎癥、脂質代謝、細胞外信號調節、氧化應激等;子網絡2中CCL2、ICAM1、CXCL8(IL-8)和IL-10主要涉及炎癥反應、免疫調節;子網絡3中MMP-1、MMP-2、IGF2、VEGFA、EGFR、PRKCB、PRKCA和NCF1主要涉及炎癥、氧化應激、細胞分化增殖、血管內皮增生、細胞黏附、細胞凋亡等有關;子網絡4中HMOX1、NFE2L2和FOS與細胞增殖、分化和轉化及細胞凋亡有關。結合GO富集分析結果,提示黃連可能通過細胞周期調節、細胞凋亡、改善微血管病變、調節代謝、抗炎、氧化應激等途徑發揮治療糖尿病性心肌病的作用。

在KEGG通路富集分析方面,排除與癌癥、病毒相關的通路,黃連主要成分靶點主要富集在糖尿病并發癥中的糖化終末產物及其受體信號通路、流體剪切力及動脈硬化、HIF-1信號通路、腫瘤壞死因子信號通路、IL-17信號通路、松弛素信號通路和PI3K-AKT信號通路。本研究結果顯示,糖尿病并發癥中的糖化終末產物及其受體信號通路是通路富集結果中顯著性最高的通路,AGE-RAGE能夠激活核轉錄因子-κB(NF-κB),通過IL-6、TNF-α等炎性因子、生長因子及黏附因子等,導致炎癥反應及細胞黏附反應,這是糖尿病性心肌病發生的主要機制之一[24]。同時,研究表明,流體剪切力及動脈粥樣硬化通路在改善胰島素抵抗、抗炎、抑制細胞凋亡等方面對糖尿病性心肌病有影響[25-26]。當機體發生缺血缺氧時,HIF-1作為觸發各種應激蛋白表達的主要轉錄因子[27],其減少可導致心肌肥厚[28]。HIF-1在心肌中高表達,其靶基因VEGF等可能參與保護心肌,從而達到減輕糖尿病小鼠心肌重構的目的[29-30]。TNF信號通路具有多效生物學效應,研究表明,黃連素能阻止TNF-α誘導血管細胞黏附分子-1(VCAM-1)mRNA增高,減弱細胞黏附作用[31]。同時,黃連素可通過增加脂聯素蛋白分泌,減少瘦素、TNF-α和IL-6等水平來改善胰島素抵抗[32],發揮調節代謝的作用。IL-17是糖尿病病人發生炎癥反應的重要炎性因子之一,能夠啟動p38MAPK、P13K/AKT/細胞外調節蛋白激酶(ERK)等一系列炎性因子通路,發生炎癥反應[33]。近年來研究發現,松弛素信號通路除了與分娩有關,還與減少氧化應激損傷、保護高糖誘發心肌肥厚及細胞凋亡相關[34]。PI3K-AKT信號通路具有調節葡萄糖攝取、糖原合成與糖原合成激酶失活等作用[35],是胰島素發揮作用的關鍵通路,參與細胞凋亡、血管生成、端粒酶活性及抗炎等過程[36],對糖尿病性心肌病的診治具有重要意義。

綜上所述,黃連治療糖尿病性心肌病的可能機制:黃連中的槲皮素、小檗堿及巴馬汀等主要活性成分作用于糖尿病并發癥中的糖化終末產物及其受體信號通路、流體剪切力及動脈粥樣硬化、HIF-1信號通路、腫瘤壞死因子信號通路、IL-17信號通路、松弛素信號通路及PI3K-AKT信號通路等,以MYC、NFKBIA、PPARA、MAPK1、NOS2、CCL2、ICAM1、CXCL和IL-10、MMP-1、MMP-2、IGF2、VEGFA、EGFR、PRKCB、PRKCA和NCF1、HMOX1、NFE2L2和FOS等為關鍵靶點,通過調節代謝、改善微血管病變、抗炎、抗氧化應激、抗細胞凋亡等作用機制來治療糖尿病性心肌病。由此可知,黃連治療糖尿病性心肌病是多成分、多靶點、多通路相互作用的結果。接下來,本團隊將通過基礎研究、臨床研究等途徑進一步驗證。