沙庫巴曲纈沙坦抑制阿霉素誘導大鼠心肌纖維化的作用機制

宋昕雨,李家富,程曉洪,陳俞瑾

心血管疾病和惡性腫瘤是威脅人類生命健康的兩個最重要的疾病,新型化療和免疫療法的出現明顯改善了癌癥病人的預后。然而隨著老年癌癥病人數量的增加和抗腫瘤治療周期的延長,心血管并發癥的處理和治療引起的心臟毒性成為一個重要的問題[1]。蒽醌類藥物是臨床上容易導致心臟毒性的藥物,阿霉素(doxorubicin,DOX)作為有效的蒽醌類抗腫瘤藥物,常與其他藥物聯合治療各種類型的癌癥,這些聯合治療在增強殺滅惡性細胞的同時也有可能損害包括心肌細胞在內的正常細胞結構和功能[2-3]。已有研究證實,阿霉素主要通過刺激心臟成纖維細胞產生膠原蛋白,從而促使心臟纖維化的發生[4],最嚴重可導致伴有充血性心力衰竭的擴張型心肌病,而氧化應激與阿霉素誘導的心肌纖維化和心肌病的機制密切相關[5]。氧化應激是誘導心肌損傷和心肌重塑的主要機制之一,其意味著過量產生活性氧(reactive oxygen species,ROS)對組織細胞造成損傷。

沙庫巴曲纈沙坦(LCZ696)是一種血管緊張素受體腦啡肽酶抑制劑(angiotensin receptor neprilysin inhibitors,ARNI),是由腦啡肽酶抑制劑(neprilysin inhibition)AHU377和血管緊張素受Ⅱ阻滯劑(ARB)纈沙坦以1∶1比例合成的鈉超復合物,通過阻斷腎素-血管緊張素-醛固酮系統(renin-angiotensin-aldosterone system,RAAS)激活和對利鈉肽系統正性效應,而起到擴張血管、利尿排鈉、抗心肌纖維化、抗心肌肥厚、抑制心臟重構的作用[6-7]。現有研究發現,ARNI在高血壓、心肌梗死等疾病中也有治療效果,但目前關于ARNI改善氧化應激、在抗腫瘤治療過程中發揮心臟保護作用及其可能機制的報道仍較少。

本研究旨在探討沙庫巴曲纈沙坦能否改善阿霉素誘導的大鼠心肌纖維化及是否通過調節蛋白激酶C(PKC)/ROS信號通路減輕氧化應激而發揮心臟保護作用,為防止心肌重構和抗腫瘤藥物治療過程中的心臟毒性提供潛在的理論基礎和實驗依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物、試劑及儀器

健康雄性6～8周齡SD大鼠40只,體質量180～200 g,購自西南醫科大學實驗動物中心,動物許可證號SCXK(川)2018-17。沙庫巴曲纈沙坦鈉片(國藥準字J20190001)購自諾華公司。鹽酸阿霉素(貨號SD9280)、佛波酯(PMA,貨號P6741)均購自Solarbio公司。二喹啉甲酸(BCA)蛋白質濃度測定試劑盒(貨號AS1086)、增強型化學發光試劑(ECL)檢測試劑盒(貨號AS1086)均購自ASPEN公司。抗甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)抗體(貨號ab181602)、抗PKC抗體(貨號ab179521)均購自Abcam公司。DYY-6C型電泳儀購自北京市六一儀器廠。TGL-16型冷凍離心機購自湖南湘儀實驗室儀器開發有限公司。JT-12K型脫水機、JB-P5型包埋機均購自武漢俊杰電子有限公司。

1.2 動物模型的建立及分組

適應性喂養1周后將40只大鼠隨機分為對照組(N組,10只)、模型組(30只),模型組腹腔注射阿霉素,每次3 mg/kg,每周2次,共3周,誘導大鼠心肌纖維化,N組注射相同體積溶劑。3周后,模型組再隨機分為DOX組、LZC696干預組(ARNI組)和PMA組,每組10只。ARNI組和PMA組采用沙庫巴曲纈沙坦混懸液60 mg/(kg·d)灌胃,共4周;N組、DOX組灌胃相同體積的溶劑。PMA組大鼠灌胃2周后,腹腔注射PMA 2 μmol/kg,每隔1 d注射1次,共2周。N組、DOX組和ARNI組腹腔注射相同體積的溶劑。

1.3 心臟超聲檢查

藥物干預結束后,大鼠均用水合氯醛(300 mg/kg)麻醉后進行心臟超聲檢查,記錄左心室射血分數(LVEF)、左心室短軸縮短率(LVFS),完成超聲心動圖檢測后稱得體質量,處死大鼠后解剖大鼠并迅速取出心臟稱取心臟重量(heart weight,HW)。計算心臟重量指數,心臟重量指數=心臟重量/體質量。

1.4 組織標本檢測

取甲醛固定的心臟組織標本,制作為厚度約為4 μm的石蠟切片。蘇木精-伊紅(HE)染色觀察心肌細胞形態及結構改變,Masson染色觀察各組心肌組織膠原沉積情況并計算心肌膠原容積分數(collagen volume fraction,CVF),ROS熒光探針-DHE檢測心肌細胞ROS含量。

1.5 酶聯免疫吸附試驗(ELISA)法測定N末端腦鈉肽前體(NT-proBNP)水平

收集血液樣本后,4 ℃下,2 000×g離心10 min,收集上清液,-20 ℃溫度保存備用。采用雙抗夾心法,分別設空白孔(空白對照孔不加樣品及酶標試劑,其余各步驟操作相同)、待測樣品孔。在酶標包被板上待測樣品孔中加樣品50 μL,將樣品加于酶標板孔底部,盡量不觸及孔壁,輕輕晃動混勻。1)加酶:每孔加入酶標試劑100 μL,空白孔除外。2)溫育:用封板膜封板后置37 ℃溫育60 min。配液:將20倍濃縮洗滌液用蒸餾水20倍稀釋后備用。3)洗滌:小心揭掉封板膜,棄去液體,甩干,每孔加滿洗滌液,靜置30 s后棄去,如此重復5次,拍干。4)顯色:每孔先加入50 μL顯色劑A,再加入50 μL顯色劑B,輕輕震蕩混勻,37 ℃避光顯色15 min。5)終止:每孔加終止液50 μL,終止反應(此時藍色立轉黃色)。6)測定:以空白孔調零,450 nm波長依序測量各孔的吸光度(OD)值。測定應在加終止液后15 min以內進行。

1.6 蛋白免疫印跡法(Western Blot)測定相關蛋白水平

心肌組織塊用預冷的磷酸緩沖鹽溶液(PBS)漂洗2次或3次,去除血污,剪成小塊置于勻漿器中。加入10倍于組織體積的組織蛋白提取試劑,冰浴徹底勻漿,于離心管內振蕩勻漿液,冰浴30 min,同時用移液器反復吹打以確保勻漿液完全裂解。4 ℃下12 000 r/min離心5 min,收集上清液。使用BCA蛋白質濃度測定試劑盒測定樣品蛋白濃度,保證每個樣品總蛋白上樣量均為40 μg。在蛋白樣品中加入適量的5×蛋白上樣緩沖液,95～100 ℃沸水浴5 min。配制分離膠及濃縮膠,進行電泳分離;轉聚偏二氟乙烯(PVDF)膜,將轉好的膜加入封閉液室溫封閉1 h;除去封閉液,加入用一抗稀釋液,4 ℃孵育過夜;TBST洗膜3次,每次5 min;加入二抗稀釋液稀釋好的二抗,室溫孵育30 min,用TBST在室溫下搖床上洗四次,每次5 min;滴加新鮮配制的ECL混合溶液(A∶B=1∶1)到膜的蛋白面側,暗室中曝光;根據不同的光強度調整曝光條件,顯影、定影。用AlphaEasLVEFC軟件處理系統分析目標帶的光密度值。

1.7 統計學處理

2 結 果

2.1 各組體質量、心臟重量和心臟重量指數比較

與N組比較,DOX組體質量明顯下降(P<0.05),心臟重量指數明顯升高(P<0.05)。與DOX組比較,ARNI組和PMA組體質量明顯增加(P<0.05),心臟重量指數明顯降低(P<0.05)。與ARNI組比較,PMA組體質量降低、心臟重量指數升高,但差異均無統計學意義(P>0.05)。各組間心臟重量變化差異無統計學意義(P>0.05)。詳見表1。

表1 各組體質量、心臟重量和心臟重量指數比較(±s)

2.2 各組LVEF、LVFS值比較

與N組比較,DOX組LVEF、LVFS均明顯降低(P<0.05)。與DOX組比較,ARNI組LVEF、LVFS均明顯升高(P<0.05),表明沙庫巴曲纈沙坦干預可一定程度改善大鼠的心功能。與DOX組比較,PMA組LVEF、LVFS明顯升高(P<0.05);與ARNI組比較,PMA組LVEF、LVFS明顯降低(P<0.05)。詳見表2。

表2 各組LVEF、LVFS值比較(±s) 單位:%

2.3 沙庫巴曲纈沙坦對大鼠心肌纖維化的影響

2.3.1 HE染色

N組心肌纖維染色均勻,排列整齊,分布均勻,輪廓清晰,細胞核位于細胞中央,細胞間隙正常,而DOX組心肌纖維著色不均,排列紊亂,輪廓模糊,細胞核散亂分布,可見細胞水腫、肥大。ARNI組、PMA組心肌纖維較整齊,輪廓較清晰,細胞水腫、肥大較DOX組有所改善。詳見圖1。

圖1 各組大鼠心肌HE染色圖(×400)

2.3.2 Masson染色

N組膠原纖維呈藍色,肌纖維呈紅色。DOX組心肌細胞排列紊亂,心肌間質藍色膠原纖維明顯增多,心肌纖維化明顯。ARNI組、PMA組心肌細胞排列較好,心肌間質膠原纖維較DOX組明顯減少。ARNI組、PMA組較DOX組排列整齊,藍色膠原纖維面積下降,提示ARNI組、PMA組心肌纖維化改善,詳見圖2。CVF分析顯示,N組CVF為(0.31±0.09)%,DOX組CVF為(6.01±0.24)%,DOX組CVF較N組升高(P<0.05),ARNI組、PMA組CVF分別為(1.36±0.11)%、(2.18±0.25)%,均較DOX組下降(P<0.05),ARNI組CVF較PMA組下降(P<0.05),提示PMA組心肌纖維化較ARNI組加重,詳見圖3。

圖2 各組大鼠心肌Masson染色(×400)

圖3 各組CVF比較

2.4 沙庫巴曲纈沙坦對心肌纖維化大鼠心臟組織ROS含量的影響

N組大鼠心臟組織ROS含量為(10.21±1.62)%;DOX組心肌內紅色熒光較N組明顯增強,ROS含量為(65.61±4.86)%,較N組明顯上升(P<0.05)。ARNI組、PMA組熒光強度較DOX組明顯減弱,ROS含量分別為(28.8±2.37)%、(44.3±2.3)%,較DOX組明顯下降(P<0.05)。與ARNI組比較,PMA組ROS含量升高(P<0.05)。詳見圖4、圖5。

圖4 各組ROS含量比較

圖5 各組大鼠心肌ROS熒光強度(×400)

2.5 沙庫巴曲纈沙坦對心肌纖維化大鼠NT-proBNP的影響

N組血清NT-proBNP為(0.13±0.03)ng/mL,DOX組血清NT-proBNP為(0.99±0.07)ng/mL,與N組比較,DOX組NT-proBNP水平明顯上升(P<0.05);ARNI組血清NT-proBNP為(0.42±0.04)ng/mL,PMA組血清NT-proBNP為(0.58±0.06)ng/mL,與DOX組比較,ARNI組、PMA組血清NT-proBNP水平下降(P<0.05);與ARNI組比較,PMA組血清NT-proBNP水平升高(P<0.05)。詳見圖6。

圖6 各組血清NT-proBNP水平比較

2.6 Western Blot測定大鼠心臟組織PKC蛋白水平

N組PKC表達為0.08±0.00,DOX組PKC表達為0.38±0.03,與N組比較,DOX組PKC表達明顯上升(P<0.05);ARNI組PKC表達為0.19±0.04,PMA組PKC表達為0.51±0.02,與DOX組比較,ARNI組PKC表達下降,PMA組PKC表達上升(P<0.05);與ARNI組比較,PMA組PKC表達升高(P<0.05)。詳見圖7。

圖7 各組PKC蛋白表達水平比較

3 討 論

阿霉素是臨床常用的蒽醌類廣譜抗腫瘤藥物,其抗腫瘤特性歸因于其插入DNA、破壞拓撲異構酶Ⅱ介導的DNA復制,從而導致腫瘤細胞的DNA破壞和細胞凋亡。同時DOX還通過其醌基團氧化還原反應生成ROS,生成超氧陰離子(O2-)、過氧化氫(H2O2)和羥自由基,這些聯合作用可能增強殺傷惡性腫瘤細胞的效果,然而也損害了包括心肌細胞在內的非正常細胞的結構和功能[3]。心肌纖維化是阿霉素所致心肌病發生發展過程中的重要病理改變,而氧化應激在該過程中起重要作用。氧化應激通常提示機體抗氧化防御系統中ROS的生成和清除嚴重失衡,導致ROS大量積聚。研究表明,阿霉素可明顯上調心肌組織氧化應激水平,并導致心肌細胞凋亡,從而損傷心肌及心臟功能[3,8]。本研究結果顯示,阿霉素誘導的心肌纖維化大鼠心肌間質膠原纖維增多明顯,紊亂排列,左室心肌中ROS含量明顯上升,超聲心動圖也顯示左心收縮功能明顯下降,心力衰竭標志物NT-proBNP明顯升高,提示阿霉素誘導的模型組大鼠存在明顯的心肌纖維化和收縮功能減退。

抗腫瘤藥物治療所致心臟毒性與其劑量呈正相關,臨床治療可以通過限制藥物累積劑量以減輕毒性,或在劑量不變以保證治療效果的同時改變用藥方式,或予以有效保護心臟的藥物治療[2]。血管緊張素轉化酶抑制劑(ACEI)或血管緊張素Ⅱ受體拮抗劑(ARB)、β受體阻滯劑和他汀類藥物都被證明在抗腫瘤治療過程中具有一定的心臟保護作用[2]。沙庫巴曲纈沙坦通過抑制腦啡肽酶同時增強利鈉肽系統,并通過阻斷RAAS系統,通過改善利鈉和利尿、降低交感神經張力、減少心肌纖維化和誘導有益的心臟逆向重構的血流動力學和電生理改變而產生多種有益效果[9],該藥物作用也為其在抗腫瘤治療中發揮心臟保護作用提供了基礎。Peng等[10]研究表明ARNI可能通過調節去乙酰化酶3(Sirt3)/錳超氧化物歧化酶(Mn-SOD)通路減輕壓力超負荷誘導的心力衰竭中心肌氧化應激和細胞凋亡。Gao等[11]研究發現,ARNI通過減少血管內皮細胞內ROS的產生和丙二醛水平來減輕脂多糖誘導的氧化應激。Ye等[12]研究發現,ARNI通過減少Toll樣受體2(TLR2)-髓分化因子88(MyD88)復合物形成、通過抑制核轉錄因子κB(NF-κB)介導的炎癥反應來預防阿霉素引起的心臟擴張衰竭、纖維化和炎癥。Xia等[13]研究表明,ARNI可能通過減輕Drp1介導的線粒體功能障礙而起到對阿霉素誘導的心臟功能障礙的保護作用,減輕阿霉素心肌病左室心肌纖維化及改善心功能。總之,ARNI可能通過多種途徑或信號通路起到減輕氧化應激、抗炎、改善心肌纖維化與心室重構的作用。

PKC信號通路廣泛表達于全身,參與氧化應激、炎癥反應、膠原合成和細胞凋亡,被認為在心肌纖維化、心力衰竭、心律失常過程中發揮重要作用,且研究表明PKC信號通路可在阿霉素的作用下被激活[3,14-19]。多項研究發現,PKC可調節ROS的生成以提高氧化應激水平而導致細胞或器官的損傷、影響其正常功能。Volpe等[20]的研究表明,高血糖狀態下持續激活的 PKC可引起還原型輔酶Ⅱ(NADPH)氧化酶增多,繼而導致ROS的產生,提升氧化應激水平而影響正常細胞功能。Lu等[21]研究發現,salusin-β通過激活PKC/ROS信號通路,引發腎小管細胞的凋亡和死亡,從而導致急性腎損傷。Liu等[15]研究結果顯示,PKC能間接通過增加線粒體活性氧(mitoROS)的生成而下調Nav1.5的表達,可能具有誘發心律失常的作用。本研究利用阿霉素心肌纖維化大鼠模型,經沙庫巴曲纈沙坦治療后,ARNI組較DOX組大鼠心功能改善,LVEF和LVFS增加,NT-proBNP水平下降,病理染色結果顯示,心肌纖維化明顯改善,心肌膠原纖維、CVF明顯減少,ROS含量、PKC蛋白表達水平明顯下降,提示沙庫巴曲纈沙坦可能通過抑制PKC而減少ROS生成,以減輕過度氧化應激,最終改善阿霉素誘導大鼠心肌纖維化而起到保護心肌的作用;經PMA干預后,PMA組CVF、NT-proBNP水平、ROS含量、PKC蛋白水平較ARNI組增加(P<0.05),進一步表明沙庫巴曲纈沙坦減輕氧化應激、改善阿霉素誘導大鼠心肌纖維化的作用可能是通過抑制PKC/ROS信號通路表達而達到的。由此可見,沙庫巴曲纈沙坦可改善阿霉素引起的心肌纖維化。

綜上所述,沙庫巴曲纈沙坦可以改善阿霉素誘導的大鼠心肌纖維化,從而抑制心肌重構,該保護心臟的作用可能與抑制PKC/ROS信號通路表達從而減輕氧化應激有關。