miR-153-3p 對于腰退行性病變調節機制的初步探討

庾 珊，肖 林，龔東平，梁樓峰，梁安偉，許夏懿，林 杰，梁華新

（廣西中醫藥大學附屬國際壯醫醫院 疼痛科，南寧 廣西 530200）

我國不同地區報道的成人腰痛患病率為7.21%～39.0%，年患病率為 20.88%～29.88%，已經成為我國一個非常嚴峻的公共衛生問題[1]，而腰椎間盤退變（lumbar disc degeneration，LDD）是導致下腰痛的重要因素[2]。椎間盤是人體最大的乏血管神經的組織，當椎間盤發生退變 時血管神經向椎間盤內延伸，極易誘發椎間盤退變，進而出 現腰痛，但其具體的發病機制有待深入探討。髓核（nucleus pulposus，NP）細胞是椎間盤中主要的細胞，其異常增殖或過度凋亡是LDD 中最明顯的細胞和生化變化之一。而H2O2和miR-153-3p可能是調節這一過程的重要因素之一。本研究旨在闡明H2O2對于腰椎髓核細胞的影響及初步探討miR-153-3p 對于腰退行性病變的調節機制。

1 材料與方法

1.1 標本來源

本實驗研究標本采用從Sciencell 公司購買正常腰椎髓核細胞：Human Nucleus Pulposus Cells，Catalog #4800。

1.2 實驗分組

實驗分為：（1）對照組；（2）H2O2組；（3）miR-153-3p inhibitor NC（以下簡稱inhibitor-NC 組）；（4）miR-153-3p inhibitor（以下簡稱inhibitor 組）。總例數n=48，每組例數n=12。

1.3 標本處理方法

對照組：采用髓核細胞培養基（DMEM 細胞培養液、品牌：GIBCO）體外培養；H2O2組：髓核細胞培養基體進行體外培養，并予200 μmol/L H2O2處理6 h；inhibitor 組：加入miR-153-3p inhibitor，是一段序列跟miR-153-3p 序列互補的抑制序列miRNA；inhibitor-NC 組：miR-153-3p inhibitor NC 是一段無功能序列的miRNA，起對照作用。實驗時，按照要求將加入對應分組的RNA。

1.4 檢測方法

1.4.1 RT-qPCR 檢測miR-153-3P、COL-Ⅱ、MMP3、Nrf2 總RNA 提取后，反轉錄cDNA，根據試劑盒說明書進行9PCR。反應條件95℃，30 s 預變性，95℃ 5 s，60℃ 35 s 共40 個循環。相對表達量用2-△△Ct法計算，引物序列見表1。

表1 RT-qPCR 引物序列Tab.1 Rt-qPCR primer sequence

1.4.2 WesternBlot 檢測Nrf2 表達加入裂解液提取總蛋白，蛋白濃度用BCA 法測定。隨后進行電泳，轉膜，封閉1.5 h，4 ℃加封閉液稀釋的一抗過夜后，TBST 洗膜，加封閉液稀釋的二抗37 ℃孵育90 min，加入顯影液顯影，利用蛋白條帶的吸光度計算蛋白表達量。

1.5 檢測指標

實驗分兩部分進行：（1）采用CCK8 檢測對照組及H2O2組細胞活力，流式檢測兩組細胞活性氧及線粒體膜電位，另外采用qPCR 檢測上述兩組的基質金屬蛋白酶3（MMP3）、Nrf2、miR-153-3p、Ⅱ型膠原（COL-Ⅱ）表達含量。（2）采用qPCR 檢測對照組、miR-153-3p inhibitor-NC 組及miR-153-3p inhibitor 組的Nrf2、miR-153-3p表達含量；采用Westernblot 檢測對照組、miR-153-3p inhibitor-NC 組及miR-153-3p inhibitor 組的Nrf2 表達含量。

1.6 統計學處理

2 結果

2.1 H2O2 對髓核細胞活性影響

用CCK8 檢測對照組、H2O2組的細胞活力進行檢測，結果提示經H2O2處理的腰椎髓核細胞活力較對照組明顯下降，差異具有統計學意義（P＜ 0.05），見表2。

表2 C CK8 檢測對照組、H2O2 組細胞活力比較[（）%]Tab.2 Comparison of cell viability between CCK8 control group and H2O2 group [（）%]

表2 C CK8 檢測對照組、H2O2 組細胞活力比較[（）%]Tab.2 Comparison of cell viability between CCK8 control group and H2O2 group [（）%]

2.2 用流式細胞檢測對照組、H2O2 組的細胞活性氧、線粒體膜電位

結果提示經200 μmol/L H2O2處理的腰椎髓核細胞活性氧含量明顯增加（P＜ 0.05，差異具有統計學意義）；H2O2組細胞線粒體膜電位較對照組明顯降低（P＜ 0.05，差異具有統計學意義），提示H2O2處理的腰椎髓核細胞線粒體膜電位降低，見表3，表4。

表3 流式檢測對照組、H2O2 組細胞活性氧（）Tab.3 Flow detection of reactive oxygen species in control group and H2O2 group（）

表3 流式檢測對照組、H2O2 組細胞活性氧（）Tab.3 Flow detection of reactive oxygen species in control group and H2O2 group（）

表4 流式檢測對照組、H2O2 組細胞線粒體膜電位（）Tab.4 Flow cytometry detection of mitochondrial membrane potential in control group and H2O2 group（）

表4 流式檢測對照組、H2O2 組細胞線粒體膜電位（）Tab.4 Flow cytometry detection of mitochondrial membrane potential in control group and H2O2 group（）

注：經正態性檢驗，兩樣本符合正態分布，采用兩獨立樣本的t檢驗。*P ＜ 0.05。

2.3 采用qPCR 檢測對照組、H2O2 組的miR-153-3p、COL-Ⅱ、MMP3、Nrf2 表達含量

結果提示對照組、H2O2組Nrf2 表達量無明顯差異（P＞ 0.05），H2O2組的miR-153-3p、MMP3表達量較對照組明顯減少，而其COL-Ⅱ表達量較對照組明顯減少（P＜ 0.05，差異具有統計學意義），見表5。

表5 qPCR 檢測對照組、H2O2 組相關miRNA 或mRNA 相對表達量（）Tab.5 Relative expression levels of miRNA or mRNA in control group and H2O2 group detected by qPCR（）

表5 qPCR 檢測對照組、H2O2 組相關miRNA 或mRNA 相對表達量（）Tab.5 Relative expression levels of miRNA or mRNA in control group and H2O2 group detected by qPCR（）

與對照組相比，*P ＜ 0.05。

2.4 采用qPCR 檢測對照組、miR-153-3p inhibitor-NC 組 及miR-153-3p inhibitor 組的Nrf2、miR-153-3p 相對表達量

結果提示：與對照組、inhibitor-NC 組相比，inhibitor 組 的miR-153-3p 表達量降低、Nrf2 表達量增高（P＜ 0.05，差異具有統計學意義）；而inhibitor-NC 組與對照組的Nrf2、miR-153-3p 表達量無明顯差異（P＞ 0.05），見表6，圖1。

圖1 qPCR 檢測3 組miR-153-3p 相對表達量圖Fig.1 Relative expression of miR-153-3p in the three groups detected by qPCR

表6 qPCR 檢測3 組的Nrf2、miR-153-3p 相對表達量（）Tab.6 Relative expression levels of Nrf2 and miR-153-3p in the three groups detected by QPCR（）

表6 qPCR 檢測3 組的Nrf2、miR-153-3p 相對表達量（）Tab.6 Relative expression levels of Nrf2 and miR-153-3p in the three groups detected by QPCR（）

*P ＜ 0.05。

2.5 采用Westernblot 檢測對照組、inhibitor-NC 組及nhibitor 組的Nrf2 表達含量

結果提示，與對照組、inhibitor-NC 組相比，inhibitor 組胞質及胞核中Nrf2 表達量增高（P＜0.05，差異具有統計學意義），而inhibitor-NC 組胞質及胞核中Nrf2 表達量與對照組無明顯差異（P＞ 0.05），見表7。

表7 Westernblot 檢測3 組的Nrf2 相對表達量（）Tab.7 Relative expression of Nrf2 in the three groups detected by Westernblot（）

表7 Westernblot 檢測3 組的Nrf2 相對表達量（）Tab.7 Relative expression of Nrf2 in the three groups detected by Westernblot（）

與對照組，inhibitor-NC組相比，*P ＜ 0.05。

inhibitor-NC 組胞質及胞核中的Nrf2 表達量與對照組比較，P＞ 0.05，差異無統計學意義，見圖2。

圖2 Westernblot 檢測3 組的Nrf2 相對表達量Fig.2 Relative expression levels of Nrf2 detected by Western blot in the three groups.

3 討論

3.1 NPCs 退變和ECM 代謝失衡是LDD 的主要病理特征

椎間盤主要由外周的纖維環、中央的髓核和上下終板組成。髓核和纖維環的細胞數量較少，但細胞外基質（ECM）豐富，約占整體的99%，后者主要由膠原（Ⅰ、Ⅱ型）和蛋白聚糖組成。髓核細胞（NPCs）可產生蛋白聚糖、Ⅱ型膠原和其他ECM 因子，有利于維持椎間盤完整性。LDD 是一個復雜的過程，典型特征是ECM 成分的丟失。LDD 的早期退變出現在NPCs 中，表現為水和蛋白聚糖的丟失，NPCs 功能退化，合成分泌Ⅱ型膠原及蛋白聚糖的能力減弱，ECM 合成與分解代謝失衡，使椎間盤結構與成分發生變化，導致椎間盤功能減弱或喪失[3]，引起神經痛甚至功能障礙。

在正常椎間盤中，ECM 合成和降解處于動態平衡狀態，其代謝依賴于基質金屬蛋白酶（MMPs）、蛋白聚糖酶與基質金屬蛋白酶組織抑制劑（TIMPs）之間的平衡調節[4]。MMPs 是一類蛋白水解酶，可降解除多糖外的幾乎所有ECM 成分。蛋白聚糖酶是解聚素樣金屬蛋白酶家族的重要成員（ADAMTSs），主要降解蛋白聚糖。MMPs 和ADAMTSs 的活性可被內源性特異性的TIMPs 所抑制。研究發現，在不同退變程度的人髓核組織樣本中，MMPs 和ADAMTSs 表達明顯升高，TIMPs 表達與椎間盤退變程度呈負相關[5]，因而會導致ECM 成分降解增強，引起椎間盤結構和成分的改變，最終導致LDD。故MMPs、ADAMTSs與TIMPs 之間的失衡在LDD 的發病機制中發揮重要作用。

3.2 氧化應激通過激活多種通路影響NPCs 功能以及ECM 代謝，進而介導LDD

LDD 病因復雜，越來越多的證據表明年齡、性別、環境、行為影響、氧化應激、炎癥和遺傳與LDD 風險相關[6]。其中，氧化應激能夠通過加速椎間盤細胞的衰老、凋亡，調節細胞自噬以及ECM 的合成與降解等多種途徑介導椎間盤的退變，被認為是引起LDD 的主要因素之一。活性氧簇（ROS）是細胞氧化代謝過程中的必然產物，廣泛參與信號轉導，代謝調節、程序性細胞死亡，衰老和椎間盤的表型轉換等[7]。當各種原因造成機體內ROS 產生增多或機體對抗ROS 能力下降時，機體處于氧化應激狀態，此時ROS 可通過細胞膜直接造成DNA、蛋白質、脂質的氧化損傷，從而引起NPCs 功能損傷。在本實驗中，H2O2組中腰椎髓核細胞活性氧含量增加、MMP3 表達增加、Col Ⅱ含量下降，可以說明氧化應激可以影響NPCs 功能以及ECM 代謝，進而介導LDD。而這一進程可能與ROS 可激活p38MAPK、Wnt/βcatenin 等多種可引起炎癥反應的信號通路有關[8-9]。

3.3 線粒體自噬清除受損線粒體，減少ROS 積聚，miR153/Nrf2/PINK1 通路在其中發揮重要作用

在本實驗中，H2O2處理的腰椎髓核細胞線粒體膜電位下降，說明H2O2誘導的NPCs 衰老和凋亡與線粒體功能障礙有關。線粒體是產生ROS 的能量工廠，線粒體自噬是神經退行性疾病中重要的細胞抗氧化途徑，通過自噬途徑對受損線粒體的選擇性降解，在氧化應激過程中改善線粒體功能障礙，維持線粒體質量控制。大量研究表明，線粒體自噬可以保護NPCs 免受線粒體途徑誘導的氧化應激、衰老、細胞凋亡[10-12]。

Nrf2 作為一種可以調節含有細胞保護基因的抗氧化反應元件（ARE）的表達的轉錄因子，可進入細胞核并與包含靶基因的ARE 序列結合，可激活靶基因的轉錄，參與氧化應激和ROS 代謝過程。最近研究證實，在神經元中，Nrf2 通過激活PINK1 啟動子的ARE 序列，進而上調PINK1，PINK1 通過清除受損的線粒體和減少ROS 等多種機制參與線粒體穩態的維持，使細胞在細胞存活方面具有優勢[13-14]。此外，通過Nrf2/PINK1 途徑可調節和減弱管狀細胞的氧化應激損傷和凋亡以維持線粒體質量，由此激活PINK1/Parkin 誘導的線粒體自噬，影響下游Drp1 和Mfn2 表達量，最終可改善ROS 的生成。

microRNA（miRNAs）是一類非編碼小RNA，參與細胞增殖、ECM 代謝、自噬、炎癥反應、氧化應激、凋亡、線粒體功能調節等多種細胞活動，介導多種生理和病理反應。其中，miR-153 被認為是一種神經富集miRNAs，在中樞神經系統的發育和功能以及神經退行性疾病的發病機制中均發揮重要作用。研究發現，miR-153 靶向Nrf2 3’UTR，上調miR-153 表達可影響Nrf2 及其活化功能，進而削弱了神經元的抗氧化防御，使神經元死亡增多[15]，還可升高ROS 水平，通過ROS 激活p38MAPK 通路[16]。大量證據已表明，miRNAs在退行性和正常NPCs 之間存在差異表達，可通過調節MMPs 的表達，進而影響ECM 代謝，參與LDD 進程[17]。本實驗結果已顯示miR-153-3p可調控Nrf2 表達，而調節miR-153-3p 對于LDD進程的影響及相關機制，需要進一步地深入研究。

H2O2可引起腰椎髓核細胞活性氧含量增加、細胞活力下降、線粒體膜電位下降、MMP3 增加、Col Ⅱ含量下降、miR-153-3p 表達增加，說明了H2O2可引起腰椎髓核細胞線粒體功能障礙，導致ROS 增加，引起腰椎髓核細胞外基質成分改變，從而加速腰椎間盤細胞的衰老、凋亡，促進LDD進程。Nrf2 是PINK1 基因轉錄調控因子，PINK1通過清除受損的線粒體和減少ROS 等多種機制參與維持線粒體穩態，抑制miR-153-3p 表達，可上調腰椎髓核細胞Nrf2 表達水平，提示miR-153-3p 參與存進LDD 進程的過程可能與其調控Nrf2表達、調節線粒體自噬過程有關，但是相關機制有待進一步深入研究。