基于網絡藥理學分析探討檳榔促進口腔黏膜下纖維化的活性成分及其潛在分子作用機制

馮奕晨

（蘭州大學 口腔醫學院，甘肅 蘭州 730030 ）

口腔黏膜下纖維化（oral submucous fibrosis,OSF）是一種常見口腔癌前病變，臨床上的癥狀包括灼痛、口干、吞咽困難、進行性張口受限等。不同地區OSF 的發病率有明顯差異，一般于0.04%～24.40%不等。而在南臺灣的土著居民中，咀嚼檳榔物的流行率約為69.5%［1］。在口腔癌患者中，口腔癌常與OSF 纖維性變并存［2］。OSF 在我國內陸地區主要發生于湖南、海南及臺灣等地，與當地居民生活飲食習慣密切相關。謝賽飛等［3］近期就曾發表過中藥藥方通過Wnt/β-catenin 信號通路對OSF 的調控作用研究。盡管如此，OSF 的致癌率仍趨于高發，且臨床缺乏有效控制手段，尚未見檳榔致OSF 的具體機制研究。

檳榔是棕櫚科檳榔的種子，全世界檳榔咀嚼者約6 億～12 億［4］。經常咀嚼含煙草的檳榔制品與諸如OSF、白斑等口腔癌前病變的發生之間的關系已經得到肯定。檳榔堿是檳榔的活性成分，具有毒性，在從檳榔分離出的生物堿中含量最高。此外，從檳榔分離出的生物堿還包括少量去甲基檳榔次堿和檳榔次堿及含量更少的檳榔副堿、異去甲基檳榔次堿和去甲基檳榔堿等。檳榔堿是強堿性油狀液體，無色無臭，易溶于水、酒精及部分有機溶劑，能隨水蒸氣揮發［5］。

通過建立新型“疾病-基因-靶點-藥物”協同研究網絡，網絡藥理學從整體的角度揭示藥物對機體的復雜作用和藥物對疾病的干預機制［6］。該方法所具有的系統性恰好契合生物提取物作用的協同性、整體性等特點［7］。近年來，口腔領域研究也逐漸應用網絡藥理分析方法探討相關機制。顧磊等［8］應用網絡藥理學預測了白花蛇舌草中353 個相關靶點，并發現25 條相關作用通路與口腔癌治療密切相關，功能方面則證實白花蛇舌草與口腔癌的細胞凋亡，增殖，炎性反應及氧化應激等多個生物過呈密切相關。本研究旨在通過網絡藥理學篩選出檳榔促進OSF 的主要有效成分、潛在的復雜關系網絡和主要的作用核心靶點，為揭示檳榔致病機制提供科學參考，為探究OSF 癌變的預防和靶向治療提供新途徑和可靠理論基礎。

1 方法

1.1 篩選活性成分

以“Arecae Semen”（檳榔）為關鍵詞在中醫藥系統藥理學數據庫和分析平臺（TCMSP）（http：//lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.Php）進行查找。隨后設置參數標準為藥物相似性（DL）≥0.18，口服生物利用度（OB）≥30%，對檳榔的活性成分展開篩選。

1.2 篩選靶點

1.2.1 預測檳榔活性成分的靶點 經過與靶點的相互作用，藥物活性成分才能夠發揮其生物功能，于是本研究采用TCMSP 數據庫查找檳榔活性成分潛在的作用靶點，接著采用SwissTargetPrediction（http：//www.swisstargetprediction.ch/）數據庫，對結果開展標準化匹配。

1.2.2 篩選OSF 靶點 本研究通過在DisGeNET（https：//www.disgenet.org/）、GeneCards（https：//www.genecards.org/）數據庫中輸入“oral submucous fibrosis”來得到有關的非重復靶點。

1.2.3 分析OSF 相關的藥物活性成分靶點 將藥物活性成分相關靶點與疾病相關靶點進行比較，取交集，最后得到OSF 相關的藥物活性成分靶點，待后續討論分析。

1.3 建立蛋白質-蛋白質相互作用（PPI）網絡和成分-靶點（C-T）網絡

1.3.1 PPI 網絡 借助String 數據庫（https：//string-db.org/），探究OSF 相關的藥物活性成分靶點，建立靶點蛋白間的互做網絡關系。隨后，通過對PPI 網絡圖的拓撲分析深入研究核心靶點，詳見材料方法“1.4”項。

1.3.2 C-T 網絡 采用Cytoscape 3.8.2 軟件將藥物活性成分與核心靶點進行聯系，建立藥物活性成分與核心靶點的關系網絡圖，再進一步探究起主要作用的藥物活性成分。

1.4 網絡拓撲分析

打開Cytoscape 3.8.2 軟件并導入材料方法“1.3”項建構的PPI 網絡分析結果，根據“度”“度介中心度”和“接近中心度”這三個主要參數對網絡拓撲結構進行分析，再篩選其中的核心靶點網絡。

1.5 GO 和KEGG 富集分析

登陸DAVID 數據庫（https：//david.ncifcrf.gov/），導入疾病相關的藥物活性成分靶點，對其進行GO 與KEGG 富集分析。隨后將前20 個GO/KEGG 結果歸類展示。信號通路中各種靶點與相關藥物成分的藥理作用關系越密切，則結果顯示的FDR 數值越高。

2 結果

2.1 活性成分

TCMSP 數據庫中可以檢索到52 個與檳榔相關的化合物成分。按照DL≥0.18 以及OB≥30%的參數標準，最終篩選出5 個活性成分。見表1。

表1 檳榔相關活性成分

2.2 靶點的篩選

依據化學結構的相似性篩選5 個檳榔活性成分靶點，共得到213 個活性成分相關的靶點。在GeneCards 和DisGeNET2 數據庫中得到與OSF 有關的疾病靶基因，再通過整合數據庫除去重復靶點，最終得到596 個OSF 的相關靶點。然后通過對疾病靶點與藥物活性成分靶點的結果取交集，得到31 個OSF 相關的藥物活性成分靶點（見圖1），待后續進行分析。

圖1 藥物-疾病交集基因

2.3 PPI 網絡和核心靶點分析

為了更好地理解檳榔對OSF 的作用機制，借助String 數據庫構建PPI 網絡，再把PPI 網絡上傳至Cytoscape3.8.2 軟件，繪制互作網絡圖（見圖2）。31 個核心靶點分別為TERT、TP53、MMP2、MMP9、VEGFA、PTGS2、EGFR、HIF1A、ACE、KIT、MMP3、MDM2、MPI、BCL2、MAPK1、KRAS、MMP8、MAP2K1 等（見圖3）。

圖2 核心基因網絡互作圖

圖3 PPI 對接圖

2.4 GO 功能富集

GO 功能富集獲得檳榔作用生物學過程，根據FDR≤0.01 的標準進行篩選后對前20 條顯著的生物學功能進行做圖展示，主要包括細胞周期、細胞凋亡、細胞增殖和炎癥反應4 個方面（見圖4）。具體涉及的功能包括：①細胞對缺氧的反應；②基因表達的正向調控；③MAPK 級聯正調控［9-10］；④細胞外基質分解。基于以上4 個主要方面可以看出，檳榔對OSF 促進作用可能是一個復雜的多途徑協同作用的結果。

2.5 KEGG 通路富集

KEGG 通路富集能對已篩選出的31 個靶點開展分析，其目的是揭示檳榔對OSF 的潛在促進作用機制。本研究根據FDR≤0.01 的標準，篩選得到KEGG 信號通路。其中前20 條中跟癌癥有關的信號通路涉及：①內分泌代謝；②中樞代謝；③PI3K-Akt［11-13］等（見圖5）。

圖5 KEGG 基因通路富集分析

3 討論

其中多個基因與口腔癌前病變的惡性轉化密切相關，如原癌基因MDM2 已被證實與OSF 的癌變過程相關聯，尹曉敏等［14］通過免疫組織化學法檢測對比OSF 組織、OSF 癌變組織及正常口腔黏膜組織中MDM2 蛋白的表達及分布發現，MDM2蛋白在正常口腔黏膜中呈陰性表達，在OSF 及OSF 癌變組織中陽性表達率逐漸增加，OSF 組及OSF 癌變組織組顯著高于正常對照組。

基因靶點MMP-2/-9 是癌細胞遷移和入侵所必需的，在癌細胞的轉移（遷移和入侵）中具有重要作用。PENG 等［15］發現石榴提取物（POMx）可以抑制口腔癌細胞的轉移。基于口腔癌HSC-3 和Ca9-22 細胞的酶圖和MMP-2/-9 的Western 印跡分析，口腔癌細胞的POMx 抑制性遷移可以通過MMP-2/-9 的失活來實現。這表明MMP-2/-9 的表達是口腔癌細胞轉移的重要影響因素之一。

人類癌癥中最常發生突變的基因是p53（TP53）。李懷奇等［16］采用免疫組織化學染色法檢測HPV16E6 和p53 在不同組織中的表達，發現p53 在口腔癌中的陽性表達率為23.7%，在癌前病變中的陽性表達率為57.1%，在癌周正常組織中的陽性表達率為89.9%，口腔癌中p53 的陽性表達率顯著低于癌前病變與癌周正常組織。得到結論：p53 基因的表達抑制在癌癥病變的過程中具有重要意義。

基于KEGG 通路富集分析可知，PI3K-Akt 是口腔癌的發生發展的重要干預通路，多個研究亦證實其作為關鍵靶點的意義及價值。王璞等［17］探討細胞周期蛋白B1 基因對口腔癌增殖，侵襲和遷移的影響及作用機制。研究發現敲低細胞周期蛋白B1 表達的細胞增殖、侵襲和遷移能力及MMP-2、MMP-9、PI3K、p-Akt 蛋白表達均明顯低于對照組（P＜0.05），兩組間Akt 蛋白表達差異無統計學意義（P＞0.05）。獲得結論：口腔癌的干預和發展的作用機制可能與抑制PI3K/Akt 信號通路的激活有關。

綜上所述，OSF 是一種口腔潛在惡性疾患，這意味著患者需要長期監測疾病進展情況，進行定期隨訪以預防癌變的發生，或盡早發現癌變和治療癌變。患者初診時須根據病變范圍、嚴重程度等因素選擇適宜部位取活檢，明確組織病理學診斷，對于伴發口腔鱗狀細胞癌者應早期采取外科治療。綜上所述，本研究基于網絡藥理學的模式，預測了檳榔的活性成分及相應的作用靶點，對其促進誘導OSF 轉化成癌的潛在分子機制進行了分析。檳榔對OSF 的作用是多靶點、多途徑、多化合物共同作用的結果。將來的研究中，本人會更深入探究檳榔中不同化學成分的代謝機制和相互協同作用，為揭示檳榔致病機制提供科學的參考，為治療OSF 疾病提供可靠的理論基礎。