Livin和c-myc在子宮內膜異位癥中的表達及臨床意義

凌學民，黃建，駱慧芳，鄧玲娜，周偉新

（深圳市龍崗區第二人民醫院 1.婦科；2.病理科，廣東 深圳 518000 ）

子宮內膜異位癥是一種典型的婦科疾病，其經典定義是異位部位存在子宮內膜腺體和間質，主要是盆腔腹膜、卵巢和直腸陰道隔。它的癥狀包括痛經、性交困難、慢性骨盆疼痛、不規則子宮出血和/或不孕，對生殖和一般健康造成嚴重影響。這種疾病應被視為一個公共衛生問題，對婦女的生活質量有重大影響，同時也是一個巨大的經濟負擔。子宮內膜異位癥影響肝臟和脂肪組織的新陳代謝，導致全身炎癥，從而導致粘連、疤痕、內出血、腸道或泌尿功能障礙，并改變大腦中的基因表達，進而使患者出現疼痛敏感和情緒障礙［1］。該疾病的全部影響尚未得到充分認識，而且遠遠超出了骨盆［2］。了解其發病機制對于正確診斷和做出最有效的判斷和治療至關重要。盡管有許多有關這種病理的數據，關于子宮內膜異位癥起源的統一機理仍然令人費解。眾所周知，子宮內膜異位組織的發育和發展與雌激素關系密切。雌激素通過激活c-myc 和cyclin D1 等來參與細胞增殖。c-myc 作為一種原癌基因，可以通過激活細胞周期調節因子，具有深刻的促有絲分裂作用。它既可以激活或抑制基因表達，可促進細胞增殖。有研究指出，患有子宮內膜異位癥的組織中檢測到c-myc 表達有較大程度的增多［3］。不少研究指出，該病的形成可能與細胞的凋亡和增殖發生差錯相關，其中凋亡抑制蛋白（IAPs）發揮了十分關鍵的作用，Livin 作為其中重要的一員被認為在抑制凋亡引起的細胞死亡以及調節細胞增殖和細胞周期中發揮作用，在癌癥形成和/或進展過程中，有時會檢測到異常的Livin 表達，據報道，Livin 在幾種癌癥類型中過表達，其中與惡性腫瘤和化療耐藥性相關，如腎上腺皮質腫瘤、前列腺癌、甲狀腺乳頭狀癌等［4］。本實驗主要為探究Livin 和c-myc 在子宮內膜異位癥形成過程中的變化，為臨床上該疾病的醫治、預測預后和靶向基因治療尋找新的生物學指標。

1 資料與方法

1.1 一般資料

采集2015 年1 月至2017 年12 月于深圳市龍崗區第二人民醫院婦科就診的72 名患者，將行開腹或接受腹腔鏡手術后經病理學分析確診為子宮內膜異位癥的婦女為實驗組（n=36），將子宮內膜正常的不育癥患者選作對照組（n=36）。實驗組年齡25～40 歲，平均（32.6±5.9）歲；對照組年齡25～43 歲，平均（30.2±6.3）歲。兩組體重指數（BMI）均為正常水平（≤25 kg/m2）。所有參與者均承諾配合研究并簽署知情協議。

實驗組納入標準：①都為絕經前婦女，經過病理學分析進一步確認為子宮內膜異位癥；②在手術前3 個月內均未服用任何甾體激素類藥物，至少3 個月沒有服用避孕藥；③患者未妊娠及哺乳，無全身疾病。排除標準：①婦科感染，全身炎癥或自身免疫性疾病，以及用免疫抑制藥物持續治療；②患者存在內分泌失調相關疾病，或有腫瘤病史。

1.2 方法

采用免疫組化染色（SP 法）：Pipelle 抽吸刮匙從子宮體獲得子宮內膜樣本，并用冰冷的磷酸鹽緩沖鹽水（PBS）洗滌幾次以去除血液。同時，將子宮內膜和子宮內膜異位病變組織固定在10%的甲醛溶液中，然后嵌入石蠟中進行免疫組織化學染色。具體為將子宮內膜標本進行5 μm 厚連續切片，并置于恒溫箱內，將溫度設置為60℃并烘烤20 min，然后取出浸泡于二甲苯中20 min，然后使用無水酒精進行水化，并逐級降酒精濃度，每個濃度中各水化3～5 min，然后使用PBS 緩沖液洗滌標本3 次，共持續15 min，將其放置于濃度為0.01 mol/L 的枸櫞酸緩沖溶液內并升溫煮沸20 min，撈出讓其自然冷卻至室溫并放置至少20 min 以完成抗原修復過程。使用PBS 緩沖液清洗標本3次，使用經PBS 稀釋的正常羊血清在室溫下封閉10～15 min，加入稀釋到適當濃度的一抗置于4℃冰箱過夜，用PBS 洗滌三次后加入經1% FBS/PBS稀釋到適當濃度的二抗，使其室溫放置1 h，PBS緩沖液洗滌3 次后加入酶溶液，然后于37℃放置0.5 h，經PBS 清洗后加顯色劑進行顯色反應，待染色充分后用自來水終止顯色，封片后進行鏡檢。

1.3 結果判定

將處理后樣本進行免疫組織化學評估，通過鏡檢確定每個樣本中的陽性染色細胞的百分數。在所有情況下，觀察者對每個樣本的一個切片中的1 000 個細胞進行了評估。當＜5% 的細胞呈陽性時，染色被視為陰性，以“-”表示。5%～25%（包括25%）為弱陽性，以“+”表示，25%～50%（包含50%）為中等強度陽性，以“++”表示，＞50%為強陽性，以“+++”表示，比較兩組參與者子宮內膜Livin 和c-myc 的表達差異，同時觀察子宮內膜異位癥組織中Livin 與c-myc 表達水平之間的關系。

1.4 統計學方法

采用SPSS 19.0 軟件進行數據分析。Livin 和c-myc 在子宮內膜異位癥患者和健康人中的表達差異行χ2檢驗，子宮內膜異位癥中Livin 和Pc-myc 表達的相互關系通過Spearman 秩相關性分析，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 Livin 在兩組子宮內膜中的表達差異比較

通過鏡檢結果發現，Livin 在實驗組的陽性表達率為80.6%，明顯高于對照組（22.2%），差異有統計學意義（χ2=24.519,P＜0.001），見表1。

表1 Livin 在兩組子宮內膜中的表達差異比較（n=36）

2.2 c-myc 在兩組子宮內膜中的表達差異比較

通過鏡檢結果發現，Livin 在實驗組的陽性表達率為52.8%，明顯超過對照組（0.0%），差異有統計學意義（χ2=22.255,P＜0.001），見表2。

表2 c-myc 在兩組子宮內膜中的表達差異比較（n=36）

2.3 子宮內膜異位癥中Livin 與c-myc 表達水平之間的關系

通過統計學分析表明，子宮內膜異位癥中Livin 和c-myc 的表達水平之間具有顯著正相關性（r=0.403,P=0.015），見表3。

表3 子宮內膜異位癥組織中Livin、c-myc 表達的相關性（例）

3 討論

子宮內膜異位癥是一種和盆腔疼痛和不孕有關的疾病，幾乎只發生在生殖年齡，目前臨床醫生和研究者對其病因和生理學了解甚少。盡管它普遍存在，但診斷通常會延遲數年，誤診很常見，有效治療的時間也會延長。子宮內膜異位癥診斷不足，從癥狀發作到最終診斷的平均潛伏期為6.7年，部分原因是需要手術診斷［5］。該疾病能使人衰弱，針對個體來說，會給其生活帶來許多問題。準確的臨床診斷能幫助醫生對該病做出正確的識別和給予及時的幫助。與子宮內膜異位癥相關的重大個人和公共健康問題強調了了解其發病機制和病理生理學對預防和開發敏感的非手術診斷分析和有效治療的重要性。目前該病的相關機理并未明確，但關于月經逆行、間皮或腹膜化生以及存活子宮內膜細胞植入的理論已被廣泛接受。最近的報告指出，子宮內膜異位癥患者在位子宮內膜上皮的生存能力異常，可能致使其持續生長［3］。目前已有大量的探索發現細胞凋亡同該病的發病進程相關［6-7］。但關于其發病原因及機理的統一理論仍然令人費解。

Livin 是IAPs 家族的重要成員，IAP 是具有抗凋亡能力的蛋白質，與細胞凋亡和增殖關系密切。Livin 蛋白有兩個重要的結構域，為具有鋅結合環的BIR 的結構域和RING 結構域。BIR 是球狀結構，是Livin 蛋白的重要組成成分，RING 結構域能夠在其羧基末端協調兩個鋅原子。BIR 結構域是抑制活性所必需的，并與胱天蛋白酶或APAF1 反應，APAF1 與細胞色素C 一起介導胱天蛋白酶9的激活，而鋅結合環結構域有時會提高抗凋亡活性，但不能單獨抑制凋亡［4］。蛋白質-蛋白質相互作用網絡表明，Livin 蛋白在凋亡過程、催化活性調節、酶抑制劑活性、JNK 級聯和信號轉導中具有重要功能。此外，Livin 還促進凋亡抑制劑拮抗劑的降解［4］。許多研究發現Livin 可以通過多種途徑來抵抗細胞凋亡，其表達水平亦可能與預后不良有關［8-9］。LIU 等［10］應用免疫組化法研究Livin在不同卵巢子宮內膜異位組織中（癌組織，良性腫瘤和普通異位癥組織）的表達差異。研究表明Livin 在癌組織中的表達水平較其他兩組明顯增多，表明Livin 表達水平的上調與癌變的出現有一定的聯系。有研究指出［11］，發生子宮內膜異位癥的女性內膜組織中的Livin 的表達水平明顯超過正常內膜，當它附著于子宮外的細胞上可以使細胞異常增殖，導致異位造的出現。本研究結果顯示，Livin 在子宮內膜異位癥患者組織中的陽性表達率（80.6%）顯著高于正常對照組（22.2%），表明Livin 的高水平表達可能與該病的發生息息相關，與文獻報道［12］實驗結果一致。

病灶粘連、肌動蛋白骨架調節、MAPK 和TGFβ/SMAD 信號通路可能是子宮內膜異位癥發病機制的重要分子機制［13］。子宮內膜異位癥的特征是在雌激素的調節下異位部位的子宮內膜組織生長，在包括人類乳腺癌細胞系在內的不同細胞類型中，雌二醇可上調與細胞增殖有關的幾個基因，如c-myc。它在子宮內膜中的作用尚不清楚，一些研究結果表明，在子宮內膜異位癥中，異位內膜以雌激素依賴的方式生長和退化。更重要的是，子宮內膜異位癥患者的在位子宮內膜不僅含有雌二醇受體，還含有P450arom，這是一種催化雄激素轉化為雌激素的酶，在該組織中引發雌激素微環境，可能通過內分泌途徑起作用［3］。c-myc 作為與增殖相關的雌激素調節基因，是目前研究最廣泛的原癌基因之一，它能編碼細胞生長和分化所需的轉錄調節蛋白，可使細胞發生增殖或者凋亡。c-myc 能調整細胞增殖過程，在用有絲分裂原刺激細胞后，觀察到c-myc 原癌基因表達的快速增加，并且c-myc 誘導足以將靜止細胞驅動進入細胞周期。已經證明，c-myc 在子宮中被雌激素上調，其啟動子含有非典型雌激素反應順式作用元件［14］。近年來的許多實驗研究也發現，c-myc 基因在腹膜子宮內膜中呈現出高表達狀態［14］。本研究對正常子宮內膜和子宮內膜異位癥樣本中c-myc 的蛋白分布進行免疫組化分析。同種型匹配的抗兔抗體作為陰性對照，結果顯示c-myc 在子宮內膜異位癥組中呈高度表達狀態，與研究結果［15-16］基本一致。

本研究結果同時顯示，Livin 與c-myc 這兩種分子參與了這些女性異位子宮內膜細胞增殖的調控，且它們之間存在正相關聯系，提示二者之間可能以正反饋調節方式共同影響該病的發生發展。因此，對Livin 與c-myc 的聯合檢測在未來有機會作為子宮內膜異位癥診斷的新指標，并有希望作為本病預防和治療的新方向，但還需要進行更多的研究來探索這些分子之間復雜而嚴格的相互作用。