m6A 去甲基化酶alkB 同源物5 在非小細胞肺癌中的研究進展△

孫月，李媛媛

哈爾濱醫科大學附屬腫瘤醫院科技學術部，哈爾濱 150081

肺癌是全球最常見的惡性腫瘤之一，也是人類惡性腫瘤死亡的主要原因之一。盡管近年來肺癌在早發現、早診斷及手術、放療、化療和藥物治療方面有所改善，但肺癌患者的5 年生存率仍然較低[1]。肺癌的病理類型主要包括非小細胞肺癌（nonsmall cell lung cancer，NSCLC）和小細胞肺癌，NSCLC 最為常見。值得注意的是，已有研究證明60%～70%的NSCLC 患者的不良預后與腫瘤轉移有關[2]。導致NSCLC 患者生存率低的主要原因如下：NSCLC 的早期癥狀通常不明顯，大多數患者發現時已處于中晚期；醫學統計發現，僅少數NSCLC患者在早期被診斷，接受根治性手術治療才能延長生存期；轉移是腫瘤細胞從腫瘤起源部位擴散到身體遠處部位的復雜過程，是惡性腫瘤患者死亡的最常見原因[3]。術后腫瘤復發和遠處轉移非常常見，約50%的NSCLC 患者在5 年內出現復發和轉移；靶向治療和免疫治療的患者數量非常有限，盡管靶向治療和免疫治療非常有效，但尚未明確其具體的分子機制，臨床上常用的靶向藥物包括表皮生長因子受體-酪氨酸激酶抑制劑（epidermal growth factor receptor-tyrosine kinase inhibitor，EGFR-TKI）（如厄洛替尼、吉非替尼和阿法替尼），免疫治療藥物包括程序性死亡受體1（programmed cell death 1，PDCD1，也稱PD-1）/程序性死亡受體配 體 1（programmed cell death 1 ligand 1，PDCD1LG1，也稱PD-L1）抑制劑（如派姆單抗、尼魯單抗）[4]。因此，研究NSCLC 發生發展的分子機制，制訂有效的診斷和治療策略，對提高肺癌患者的生存率具有重要意義，目前迫切需要開發更多新的肺癌分子靶點。alkB 同源物5（alkB homolog 5，ALKBH5）是一種重要的m6A 去甲基化酶，在不同腫瘤中的表達水平、目標基因以及發揮的作用均不同。本文圍繞ALKBH5 的結構、作用機制、在NSCLC 惡性進展中的生物學功能及針對ALKBH5修飾的靶向治療等方面的研究進展進行綜述，旨在為NSCLC 的早期臨床診斷和靶向藥物的研發提供新思路。

1 m6A 概述

關于腫瘤的發病機制，DNA 和RNA 修飾的表觀遺傳學已被廣泛研究[5-6]，其中，m6A 修飾是新興的研究前沿，是指RNA 腺苷酸的N6 位置發生甲基化修飾。m6A 可修飾不同類型的RNA，包括轉運RNA（transfer RNA，tRNA）、信使RNA（messenger RNA，mRNA）、核糖體RNA（ribosomal RNA，rRNA）、核小RNA（small nuclear RNA，snRNA）和長鏈非編碼RNA（long non-coding RNA，lncRNA）等，上述均是在真核生物中轉錄后修飾[7]。研究發現，m6A 修飾存在于超過7600 個mRNA 和超過300個非編碼RNA（non-coding RNA，ncRNA）中[8]。m6A 修飾可以改變RNA 的加工過程，如剪接、輸出、細胞內分布穩定性和翻譯[9]。細胞中的m6A 狀態受到一系列調控因子的嚴格調控，包括m6A 甲基轉移酶（稱為“甲基化執行者”）、去甲基化酶（稱為“m6A 位點識別者”）和m6A 結合蛋白（稱為“去甲基化執行者”）。ALKHB5 是alkB 家族的一員，在調控許多生物學過程中發揮重要作用，如mRNA加工[6]。研究發現，ALKBH5 在人類惡性腫瘤的發生發展過程中起著重要作用，能夠抑制結腸癌細胞轉移[6,8,10]。另有研究發現，m6A 修飾對腫瘤的起始和進展至關重要[11]。

2 ALKBH5 概述

ALKBH5 是一種m6A 去甲基化酶，近年來，ALKBH5 在許多生物學過程中的作用已被證實，包括腫瘤細胞增殖[11]、侵襲[12]、轉移[13]、滲透[14]等過程。此外，ALKBH5 還參與了各種腫瘤和非腫瘤的發生發展過程，如胃癌[13]、膠質母細胞瘤[15]、胰腺癌[16]、結腸癌[17]、乳腺癌[18]、肺癌[19]、卵巢癌[20]、糖尿病[21]以及生殖系統疾病[22]。

2.1 ALKBH5 的結構

ALKBH5 是alkB 蛋白家族成員之一，是一種依賴亞鐵和2-氧戊二酸的核酸加氧酶，據報道，ALKBH5 可以催化RNA 中的m6A 去甲基化[23-25]。Zhou 和Han[26]及Aik 等[27]鑒定了ALKBH5 的晶體結構，并揭示了去甲基化機制中很重要的保守殘基。Chen 等[28]和Feng 等[29]分別鑒定了斑馬魚ALKBH5（fALKBH5）和人類ALKBH5 的晶體結構，促進了對ALKBH5 底物識別特異性的理解。此外，Xu 等[30]通過等溫滴定量熱法發現了ALKBH5 的m6A 結合部位和與m6A 識別相關的關鍵殘基。此外，m6A作為一種“構象標記”，在RNA中通過誘導不同的構象影響其與ALKBH5 的相互作用[31]。DEAD 盒解旋酶3（DEAD-box helicase 3，DDX3）是DEAD 盒RNA 解旋酶家族成員，研究發現，ALKBH5 的DSBH 結構域與DDX3 的腺苷三磷酸（adenosine triphosphate，ATP）結構域相互作用，在細胞周期、凋亡和RNA 代謝等關鍵生物學過程中發揮重要作用[32]。alkB 同源物9（alkB homolog 9，ALKBH9，又稱FTO）與ALKBH5 的單核苷酸多態性（single nucleotide polymorphism，SNP）也有很大的聯系[33-34]。Purslow 和Venditti[35]采用alkB 蛋白無序構象狀態的原子解析模型進一步研究了ALKBH5 在溶液中的結構，發現ALKBH5 的主要活性部位為1H、15N、13C。

2.2 ALKBH5 的作用機制

ALKBH5 在人類惡性腫瘤中的潛在機制尚不清楚，且存在爭議。迄今為止，研究發現ALKBH5在多種惡性腫瘤中的表達均上調或下調，并在乳腺癌、胃癌、肺癌、結腸癌等腫瘤中發揮致癌或抑癌作用[17,13,23]。ALKBH5 的作用機制與lncRNA、微小RNA（microRNA，miRNA）、mRNA 的表達相關[13,20,23]，同時，ALKBH5 通過介導RNA 之間的通信進一步調控腫瘤細胞增殖、凋亡、存活、遷移、侵襲等重要的生物學過程[24-25]。

2.2.1 ALKBH5 調控lncRNA 轉錄 FOXM1 反義RNA（RNA antisense to FOXM1，FOXM1-AS）是細胞核內位于12 號染色體上（chr12：2945982-2968961，GRCh37/hg19）的lncRNA，是ALKBH5 和叉頭框蛋白M1（forkhead box M1，FOXM1）轉錄過程中的關鍵因子。FOXM1-AS 與ALKBH5和FOXM1的轉錄本定位于同一細胞，研究表明，FOXM1-AS 能夠上調FOXM1 的表達，并在膠質母細胞瘤的發生發展過程中發揮重要作用[24]。此外，ALKBH5 能夠去甲基化lncRNA KCNK15 和WISP2反義RNA1（KCNK15 and WISP2 antisense RNA 1，KCNK15- AS1），使胰腺癌組織中lncRNA KCNK15-AS1 表達下調，從而提高胰腺癌細胞的運動性，包括細胞遷移和侵襲[25]。ALKBH5 能夠抑制lncRNA 漿細胞瘤變異易位1（plasmacytoma variant translocation 1，PVT1）降解，使PVT1 在骨肉瘤組織和細胞中表達上調，進而與m6A 閱讀器YTH 結構域家族蛋白（YTH domain family，YTHDF）2 結合，促進骨肉瘤細胞的體外增殖和體內生長。另有研究表明，ALKBH5 能夠降低NSCLC 中lncRNA 核旁斑點組裝轉錄本1（nuclear paraspeckle assembly transcript 1，NEAT1）的表達水平[13]。由此可見，ALKBH5 可以通過調控lncRNA 轉錄影響腫瘤的生物學進程。

2.2.2 ALKBH5 調控腫瘤干細胞 腫瘤干細胞又稱腫瘤起始細胞，具有自我更新復制的能力，可產生與其不同的子代，并形成繼發性（復發性或轉移性）腫瘤。ALKBH5 通過催化Nanog 同源框蛋白（Nanog homeobox，NANOG）mRNA 3'非翻譯區（3'-untranslated region，3'-UTR）中的腺苷殘基去甲基化，促進乳腺癌干細胞（breast cancer stem cell，BCSC）在腫瘤微環境中的特化和富集[23]。ALKBH5 在膠質母細胞瘤干細胞樣細胞中的表達升高，能夠去甲基化FOXM1新生轉錄本，增強FOXM1 的表達，從而促進干細胞遺傳、增殖和腫瘤發生[24]。

2.2.3 ALKBH5 調控自噬 在腫瘤細胞的凋亡-抵抗作用中，自噬可通過相關細胞死亡通路提高化療或放療誘導的細胞毒性。沉默m6A 相關基因甲基轉移酶樣3（methyltransferase like 3，METTL3）可增強自噬通量并抑制缺氧導致的心肌細胞凋亡，但ALKBH5 可以逆轉這一現象[35]。轉錄因子EB（transcription factor EB，TFEB）通過與ALKBH5啟動子結合激活ALKBH5的轉錄。然而，TFEB 對METTL3 的抑制作用并不依賴于轉錄抑制，而是下調mRNA 的穩定性。負反饋回路揭示了METTL3-ALKBH5 與自噬之間的重要聯系[36]。ALKBH5 的異位表達通過激活表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）/磷脂酰肌醇-4，5-二磷酸3-激酶催化亞基α（phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate 3- kinase catalytic subunit alpha，PIK3CA）、蛋白激酶B（protein kinase B，PKB，又稱AKT）/雷帕霉素靶蛋白（mechanistic target of rapamycin，MTOR）信號通路抑制體內外上皮性卵巢癌細胞的自噬，提高B 細胞淋巴瘤/白血病-2（B cell lymphoma/leukemia-2，Bcl-2）mRNA 的穩定性，增強Bcl-2 與Beclin 1 之間的相互作用[21]。

2.2.4 ALKBH5 介導缺氧腫瘤微環境 腫瘤細胞得到養分就會生長，腫瘤的體積和重量就會變大，從而導致腫瘤細胞更加缺氧，能量轉化效率進一步下降，致使細胞更加饑餓，促使細胞從血液流動中獲得更多養分，于是形成惡性循環，這可能是腫瘤的主要驅動因素。低氧會誘導乳腺癌細胞表達缺氧誘導因子（hypoxia-inducible factor，HIF）-1α和HIF-2α，使ALKBH5 表達上調，通過增強NANOG的表達介導缺氧腫瘤微環境中乳腺癌細胞富集，從而促進體內腫瘤形成[23]。此外，在缺氧/復氧處理的心肌細胞中，TFEB 可促進ALKBH5 表達，并控制溶酶體-自噬通路。ALKBH5 與肺腺癌細胞的間歇性缺氧過程密切相關。機制分析表明，m6A 去甲基化酶ALKBH5 通過下調FOXM1mRNA 中m6A 的水平，增強FOXM1mRNA 的翻譯能力，導致FOXM1 蛋白過表達，從而增強了間歇性缺氧條件下肺腺癌細胞的增殖和侵襲能力[37]。

2.2.5 ALKBH5 與肺癌患者的預后 有研究使用LASSO Cox 模型預測5 種調節因子G3BP 應激顆粒組裝因子1（G3BP stress granule assembly factor 1，G3BP1）、甲基轉移酶樣5（methyltransferase like 5，METTL5）、ALKBH5、胰島素樣生長因子2 mRNA 結合蛋白3（insulin like growth factor 2 mRNA binding protein 3，IGF2BP3）和RNA 結合基序蛋白15B（RNA binding motif protein 15B，RBM15B）的m6A 評分，該研究將肺癌患者分為兩組，結果發現，m6A 評分高的患者總生存期短于m6A 評分低的患者，差異有統計學意義（P﹤0.05）。在兩個分組中驗證5 種調節因子（G3BP1、METTL5、ALKBH5、IGF2BP3 和RBM15B）的m6A評分，最終發現這5 種關鍵因子可以作為評估肺癌患者預后的指標，通過時間依賴性受試者工作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲線和C指數分析發現，m6A 評分較其他臨床特征具有更好的預后預測能力。多中心多變量分析顯示，m6A 評分是一個獨立的預后指標，5 種調節因子（G3BP1、METTL5、ALKBH5、IGF2BP3 和RBM15B）的m6A評分與肺癌患者的預后相關[38]。有研究者收集119例NSCLC 患者和74 例年齡匹配的健康對照者的外周血，從白細胞中分離總RNA 進行m6A 分析，并回顧性分析受試者的臨床特征，結果發現，與健康對照者相比，119 例NSCLC 患者的白細胞m6A 水平顯著升高，NSCLC中白細胞m6A水平升高與腫瘤的臨床分期和分化程度相關，術后m6A 水平顯著降低，NSCLC中白細胞m6A水平升高是由甲基轉移酶復合物上調且FTO和ALKBH5下調引起的[39]。

ALKBH5 在人類腫瘤中的作用不是十分明確。目前的研究顯示，ALKBH5 在不同腫瘤中的表達水平存在較大差異，發揮致癌或抑癌作用。

3 ALKBH5 在NSCLC 中的作用機制

3.1 ALKBH5 調控NSCLC 細胞增殖

在間歇性缺氧條件下，肺腺癌細胞中ALKBH5表達升高，下調ALKBH5 的表達可通過降低FOXM1 的m6A 水平來抑制肺腺癌細胞的增殖和侵襲[11]。此外，與正常肺組織和細胞相比，ALKBH5在NSCLC 組織和細胞系中的表達明顯上調，并通過抑制m6A 去甲基化修飾的mRNA 的穩定性促進NSCLC 細胞的惡性生物學特性[19]。ALKBH5 可通過抑制Yes 相關蛋白（Yes associated protein，YAP）的表達和活性，并以人類抗原R（human antigen R，HuR）依賴的方式調節miRNA-107/大腫瘤抑制激酶2（large tumor suppressor kinase 2，LATS2）信號通路，從而抑制腫瘤的生長和轉移[40]。上述結果表明，m6A 修飾YAP 是潛在的NSCLC 治療靶點。

3.2 ALKBH5 調控NSCLC 干細胞干性

ALKBH5 通過影響p53 的表達調節上皮-間充質轉化（epithelial- mesenchymal transition，EMT）和干細胞干性，從而抑制NSCLC 的進展。m6A 去甲基化酶ALKBH5 在由NSCLC 衍生的腫瘤干細胞（cancer stem cell，CSC）中高表達。敲除ALKBH5可增加整體m6A 水平和E-鈣黏蛋白水平，降低干細胞標志物NANOG 和八聚體結合轉錄因子4（octamer-binding transcription factor 4，OCT4）的表達水平，并抑制CSC 的干性。在NSCLC 中，通過基因表達譜交互分析（Gene Expression Profiling Interactive Analysis，GEPIA）在線工具發現，ALKBH5與p53的表達呈正相關。p53能夠在轉錄水平上調控ALKBH5表達，隨后調控整體m6A 甲基化水平。通過添加p53 特異性抑制劑（p-fifty three inhibitor，PFT）抑制p53的轉錄活性，可顯著降低ALKBH5表達水平，從而抑制惡性腫瘤細胞增殖、侵襲和腫瘤形成能力，表明p53 可能通過影響ALKBH5 的表達影響惡性腫瘤進展[40]。

3.3 ALKBH5 調控NSCLC 細胞侵襲

過表達ALKBH5 可以抑制轉化生長因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β）誘導的EMT和NSCLC 細胞遷移、侵襲。ALKBH5 過表達可降低TGFβR2和SMAD 家族成員3（SMAD family member 3，SMAD3）的表達以及二者mRNA 的穩定性，同時增加SMAD6 的表達并增強其mRNA 穩定性，而敲低ALKBH5導致相反的結果。此外，m6A 結合蛋白YTHDF1/3 能夠促進TGFβR2和SMAD3 表達，YTHDF2 能夠抑制SMAD6 表達，YTHDF1/2/3 能夠促進TGF-β刺激的EMT和NSCLC細胞增殖。在機制上，ALKBH5 通過擦除m6A 影響TGFβR2、SMAD3和SMAD6 的表達及mRNA 穩定性，從而修飾NSCLC 細胞。ALKBH5 削弱了YTHDF1/3 介導的TGFβR2和SMAD3mRNA 穩定，并抑制了YTHDF2介導的SMAD6mRNA 降解。綜上所述，ALKBH5對調節TGF-β/SMAD 信號轉導具有重要作用，ALKBH5 通過介導TGFβR2/SMAD3/SMAD6 信號通路抑制NSCLC中TGF-β誘導的EMT[41]。

3.4 ALKBH5 調控NSCLC 血管生成

PVT1 在體內和體外促進NSCLC 的進展，并調控肺癌中血管內皮生長因子A（vascular endothelial growth factor A，VEGFA）的表達和血管生成。敲低ALKBH5能夠抑制NSCLC 的生長和轉移。此外，敲低ALKBH5可以抑制NSCLC 的體內外血管生成。機制研究表明，敲低ALKBH5降低了PVT1在NSCLC 中的表達和穩定性[13]。

3.5 ALKBH5 與NSCLC 患者預后的關系

ALKBH5 在NSCLC 中表達升高，ALKBH5 表達升高與NSCLC 患者的預后不良相關。體外研究表明，敲低ALKBH5可抑制PC9 和A549 細胞的增殖能力，促進G1期停滯并顯著增加凋亡細胞的比例。此外，ALKBH5 過表達會增加A549 細胞的增殖能力。敲低ALKBH5會增加周期蛋白依賴性激酶抑制因子1A（cyclin dependent kinase inhibitor 1A，CDKN1A）或組織金屬蛋白酶抑制因子3（tissue inhibitor of metalloproteinase 3，TIMP3）的表達。這些改變被ALKBH5 和IGF2BP 抵消[42]。由此可見，ALKBH5/IGF2BP 信號通路通過促進細胞增殖和致瘤性導致NSCLC 預后不良。

4 小結與展望

綜上所述，NSCLC 是一種高度惡性腫瘤，臨床發病率和病死率均較高。NSCLC 患者即使早期接受手術治療，由于腫瘤細胞易轉移和侵襲，患者的生存率也較低。因此，迫切需要找到一個可有效抑制NSCLC 細胞生長和轉移的新靶點。目前ALKBH5在NSCLC 中的研究仍處于初級階段，但ALKBH5修飾影響NSCLC 細胞侵襲、轉移已經初步得到證實，其耐藥機制尚未明確，未來可研發用于治療NSCLC 的小分子抑制劑或納米藥物。雖然目前ALKBH5 在NSCLC 中的分子機制仍待進一步挖掘，但ALKBH5 可能為NSCLC 的治療提供新的突破點并可能改變治療效果及患者預后。