DNA 甲基化在肺癌診治中的研究進展△

徐晗，蔡志平，高揚，邵國，時靜華，張穎寧

1內蒙古科技大學包頭醫學院，內蒙古 包頭 014060

2內蒙古科技大學包頭醫學院第二附屬醫院呼吸科，內蒙古 包頭 014060

3深圳市龍崗區第三人民醫院轉化醫學中心，廣東 深圳 518100

肺癌是目前世界范圍內發病率和病死率均居第一位的惡性腫瘤[1-2]。肺癌按組織病理類型可分為小細胞肺癌（small cell lung cancer，SCLC）和非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC），其中發病率最高的是NSCLC 中的腺癌，約有70%的患者診斷時即為晚期[3]。影響腫瘤發生的因素有許多，長期處于化學有害物質的環境中容易誘發腫瘤的發生[4-5]。吸煙和空氣中的細顆粒物污染是導致肺癌發生的主要因素[6-7]。研究表明，在女性NSCLC患者中，從未吸煙的原發性肺癌患者也占據了很大一部分，但有吸煙史的患者預后更差[8-10]。對于肺癌的診斷，以病理學診斷為金標準，由于大部分肺癌診斷時即為中晚期，故患者的5 年生存率較低[11]。隨著分子診斷學技術的不斷進步，表觀遺傳學的發展為肺癌的診斷打開了新的思路。表觀遺傳學是指DNA 序列不改變，而其表型發生了變化，并且將這種變化穩定地遺傳至細胞發育和增殖過程中。DNA 甲基化作為表觀遺傳學中的一種常見修飾方式，在腫瘤的發生發展方面有著重要作用[12]。在已知研究的基礎上，本文就DNA 甲基化在肺癌診斷和治療中的研究進展進行綜述。

1 DNA 甲基化機制

DNA 甲基化是DNA 修飾的一種形式，可以在不改變DNA 序列的前提下，改變生物的遺傳學表現。DNA 甲基化能夠引起染色質結構、DNA 構象、DNA 穩定性以及DNA 與蛋白質相互作用方式的改變，從而控制基因的表達。一般研究的DNA甲基化主要是指發生在胞嘧啶磷酸-鳥嘌呤（cytosine phosphate-guanine，CpG）二核苷酸中胞嘧啶上第5 位碳原子的甲基化，即在DNA 甲基轉移酶（DNA methyltransferase，DNMT）的作用下，使DNA基因組中CpG 二核苷酸中胞嘧啶上的第5 位碳原子和以S-腺苷甲硫氨酸（S-adenosyl methionine，SAM）為甲基供體的兩部分相結合，產生5-甲基胞嘧啶甲基基團，并遺傳至后代的過程[13]。CpG 在DNA 中的分布不一，一部分以甲基化的狀態散在DNA 中，其分布密度較低，另一部分集中分布于0.5～4.0 kb 區域中，密度較高，稱作CpG 島，多以非甲基化的形式處于基因啟動子區域上，影響相關基因轉錄表達[14]。存在于哺乳動物體內的CpG 二核苷酸處于穩定的非甲基化狀態，這種狀態使基因的轉錄處于開放狀態，異常的甲基化會導致轉錄過程異常，從而影響基因的正常表達[15]。如在轉錄起始階段，啟動子發生甲基化則會沉默啟動子的表達，進而沉默整段基因的轉錄。

在哺乳動物的胚胎早期，DNA 甲基化會逐漸發生改變，隨著胚胎的發育完成，甲基化的形勢趨于穩定。而腫瘤細胞中的DNA 甲基化模式并不處于穩定狀態。腫瘤的發生與基因組整體甲基化水平降低和部分啟動子區域的高甲基化密切相關，基因組整體低甲基化可以使原本處于沉默狀態下的人體自身的原癌基因活化，而部分啟動子區域的高甲基化使得抑癌基因失活，增加了腫瘤的發生率[16-17]。

2 DNA 甲基化與肺癌的關系

2.1 DNA 甲基化與肺癌的早期診斷

肺癌患者的早期表現多樣，且相應的臨床癥狀并不明顯，為肺癌的早期診斷、篩查帶來困難。檢測與診斷肺癌常用的方法包括肺部影像學檢查、痰細胞學檢查和組織活檢。但由于肺癌的早期癥狀不典型，在診斷時患者分期已經較高，使得肺癌患者的5 年生存率不足20%[18]。因此提高肺癌的早診早治率，成為提高患者生存率的關鍵[19]。DNA甲基化輔助診斷肺癌的方法主要有肺泡灌洗液、痰液、血液和呼出氣體的采集檢查等幾種方法[20]。現在已有很多廠家推出比較成熟的商業化試劑盒，可以很方便地檢測DNA 甲基化，包括亞硝酸鹽轉化試劑盒、甲基化DNA 定量檢測試劑盒、甲基化DNA 免疫沉淀試劑盒和甲基化DNA 擴增試劑盒，例如BisulFlash DNA Modification Kit 可檢測的DNA 片段大小一般為250 bp，MethylFlash Global DNA Methylation（5-mC）ELISA Easy Kit（colorimetric）采用比色法測定DNA 中的5-甲基胞嘧啶，以及EpiQuik Tissue Methylated DNA immunoprecipitation Kit 和Methylamp MS-qPCR Fast Kit 等。用生物標記DNA 甲基化可以檢測細胞的異常變化，在肺癌發生的初期階段，DNA 甲基化的發生頻率很高，整體DNA 甲基化可以作為肺癌早期診斷的生物標志物。目前，采用肺癌患者的外周血樣本，檢測早期至中期的異常甲基化位點是較有效的檢測方式，檢測肺癌患者血漿鈣黏蛋白13（cadherin 13，CDH13）、脆性組氨酸三聯體二腺苷三磷酸酶（fragile histidine triad diadenosine triphosphatase，FHIT）、p16、視黃酸受體β（retinoic acid receptor β，RARβ）和Ras 相關結構域家族成員1A（Ras association domain family member 1A，RASSF1A）基因中任意兩者的甲基化，診斷肺癌的靈敏度和特異度均可達73%以上，可作為NSCLC 早期診斷的潛在標志物[21]。Richter 等[22]在研究中發現，受精卵阻滯基因1（zygote arrest 1，ZAR1）在正常肺組織中表達，但是在肺癌組織中被啟動子甲基化滅活。通過抑制DNMT 的表達可以恢復ZAR1 在肺癌中的表達。文獻報道，在NSCLC 中DNMT1、DNMT3A和DNMT3B 的表達增加，并與腫瘤抑制基因如細胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑2A（cyclin-dependent kinase inhibitor 2A，CDKN2A）、FHIT和RARβ的基因沉默相關[23]。NSCLC 組織中的死亡相關蛋白激酶1（death associated protein kinase 1，DAPK1）啟動子和WNT 信號通路抑制因子-1（WNT inhibitory factor-1，WIF-1）基因啟動子的甲基化頻率高于正常肺組織[24-25]。基于人類客觀生活環境的影響，吸煙是造成肺癌高發的一個關鍵因素，煙霧中的致癌物質可導致細胞中的抑癌基因啟動高甲基化模式，導致抑癌基因失活，造成腫瘤發生。對于有吸煙史的患者，可檢測7 個高甲基化基因[CDKN2A、RASSF1、O-6-甲基鳥嘌呤-DNA 甲基轉移酶（O-6-methylguanine-DNA methyltransferase，MGMT）、RARβ、DAPK、WIF-1和FHIT]，對肺癌患者進行早期篩查診斷[26]。

進行痰標本檢查，利用支氣管肺泡灌洗是另外一種選擇。腫瘤細胞可以通過不典型的細胞形態來識別，運用痰細胞學檢查，可以較準確地識別診斷原發性肺癌。對痰標本中RASSF1A 結合硫酸乙酰肝素-氨基葡萄糖3-O-磺基轉移酶2（3-O-sulphotransferase 2，3OST2）啟動子甲基化的分析表明，該方法診斷肺癌的靈敏度為85%，特異度為74%，同時，研究人員觀察到55%的Ⅰ期和Ⅱ期患者的腫瘤樣本中mutL 同源物1（mutL homolog 1，MLH1）啟動子高甲基化[27]。若使用幾種不同基因組合，可以使痰細胞學檢查的靈敏度和特異度分別達到98%和71%，而血漿的靈敏度和特異度分別達到93%和62%[28]。Liu 等[29]通過大樣本（2238 例肺癌患者和2563 例健康者）和多基因（32 個基因）的Meta 分析表明，甲基化的SRY 盒轉錄因子17（SRY-box transcription factor 17，SOX17）、半胱氨酸雙加氧酶1（cysteine dioxygenase type 1，CDO1）、鋅指蛋白42（zinc finger protein 42，ZFP42）、速激肽前體1（tachykinin precursor 1，TAC1）、TAFA 趨化因子樣家族成員4（TAFA chemokine like family member 4，FAM19A4）、FHIT、MGMT、p16和RASSF1A是篩選和輔助檢測肺癌的潛在生物標志物。在基因聯合檢測方法中，運用SHOX 同源盒2（SHOX homeobox 2，SHOX2）與RASSF1A基因甲基化聯合檢測，可以提高NSCLC 患者的早期檢出率[30-31]。

采用低劑量CT（low-dose CT，LDCT）檢測早期肺癌有較高識別率，但不能區分惡性腫瘤和良性孤立性肺結節，而采用亞硝酸鹽測序進行甲基化分析可以很好地彌補這一不足[32]。運用超靈敏方法和肺癌特異性基因結合來檢測痰液和血漿中的DNA 甲基化，可以提高CT 檢測早期肺癌的準確度[28]。血漿中的游離DNA 甲基化檢測采用實時定量甲基化特異性聚合酶鏈反應，可以發現肺癌患者降鈣素相關多肽α（calcitonin related polypeptide alpha，CALCA）、RASSF1A、CDKN2A、纖毛和鞭毛相關蛋白1（ciliary and flagella-associated protein 1，DLEC1）、CDH13、配對樣同源域2（paired like homeodomain 2，PITX2）、同源框A9（homeobox A9，HOXA9）和WT1 轉錄因子（WT1 transcription factor，WT1）基因的甲基化水平均較非肺癌患者高[33]。由此可以推斷，檢測血液中的DNA 甲基化水平，可以有效提高肺癌診斷陽性率。

2.2 DNA 甲基化與肺癌的治療

肺癌的標準治療方案包括手術治療、含鉑方案化療、放療、免疫治療和靶向治療。此外，基于腫瘤細胞DNA 甲基化改變而采取的不同治療方法，亦可以作為腫瘤的潛在治療方法。治療NSCLC 的藥物順鉑如受到hMLH1啟動子甲基化影響，藥物的敏感性會降低，影響患者的治療效果，故hMLH1 可成為NSCLC 患者個體化治療時的生物標志物[34]。與傳統遺傳學不同，表觀遺傳學的改變是一個可逆的過程，對某些因高甲基化誘導的癌基因活化所引起的腫瘤，臨床上已開始嘗試使用去甲基化療法治療。去甲基化治療是指通過去甲基化藥物靶向改變腫瘤中相關基因的異常高甲基化，還可增加細胞對治療的敏感性[35-36]。由于啟動子區的甲基化而導致重要抑癌基因失活，是人體大多數腫瘤發生發展的主要機制之一，而甲基化催化過程中起關鍵作用的是DNMT。因此，可使用DNMT 抑制劑降低DNMT 的活性，以此誘導腫瘤細胞向正常細胞分化，從而達到對腫瘤的治療[37]。地西他濱和5-氮胞苷均為甲基化抑制劑，已應用于血液系統腫瘤、急性粒細胞白血病和骨髓異常綜合征的治療中[38-39]。一些非腺苷類DNMT抑制劑主要抑制DNMT 活性，包括普魯卡因、普魯卡因胺和肼屈嗪等。牛磺酸上調基因1（taurine-upregulated gene 1，TUG1）在NSCLC 組織中表達下調，而在胃癌、膀胱癌和骨肉瘤中卻過表達，表明該基因具有組織特異性[40]。p53基因與TUG1啟動子區相互作用，直接調控TUG1 的表達，而TUG1 能夠與多梳抑制復合物2（Polycomb repressive complex 2，PRC2）結合調節生物活性，PRC2 的重要組分zeste 2 多梳抑制復合體2 亞基增強子（enhancer of zeste 2 polycomb repressive complex 2 subunit，EZH2）能靶向結合HOXB7的啟動子區，使HOXB7 的組蛋白H3 第27位賴氨酸H3K27 甲基化，HOXB7 通過激活促分裂原活化的蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）和磷脂酰肌醇-3-羥激酶（phosphatidylinositol 3-hydroxy kinase，PI3K）/蛋白激酶B（protein kinase B，PKB，又稱AKT）通路促進腫瘤細胞增殖，敲低TUG1后，可抑制腫瘤細胞增殖，故p53/TUG1/PRC2/HOXB7 之間的相互作用也許可作為NSCLC 診斷和治療的靶點[40-42]。

研究表明，SOX 家族蛋白對很多腫瘤都有很大的影響，在NSCLC 中，該家族蛋白影響腫瘤的發生發展進程。SOX 在胚胎發育的各個階段都有表達，發揮著轉錄因子的作用，SOX30 轉錄因子可以促使NSCLC 細胞凋亡，在正常肺細胞中SOX18蛋白低表達，因此，可以推測肺癌患者的SOX18蛋白水平增高，可作為肺癌患者病程發展的監測手段[43]。此外，Nehme 等[44]指出，T-BOX 轉錄因子2亞家族在人NSCLC中顯著下調，對肺惡性腫瘤發揮抑制作用，同時其甲基化狀態可以作為NSCLC對抗腫瘤藥物5-氮胞苷臨床反應的指標。微小RNA（microRNA，miRNA）在腫瘤治療方面的作用近年來受到了更多的關注。Wei等[45]研究發現，miRNA-9可以抑制NSCLC 細胞的遷移，增加腫瘤放射敏感性，其效應受到基因啟動子甲基化狀態的調控。

2.3 DNA 甲基化與肺癌患者預后的關系

腫瘤患者的預后主要與腫瘤的類型、分期、治療手段和治療方案有關。研究表明，在肺癌的不同分期，DNA 甲基化程度有明顯的變化，尤其在NSCLC 中，DNA 甲基化程度可以很明顯地反映腫瘤的進展情況[46-47]。不同階段的甲基化狀態可以揭示相同組織學類型肺癌患者的預后，而相同的甲基化狀態也可以揭示不同肺癌患者的預后[48]。Liu等[49]的研究指出，跨膜蛋白196（transmembrane protein 196，TMEM196）的高甲基化狀態可以作為早期肺癌的診斷標志物，也是肺腺癌和肺鱗狀細胞癌患者的預后指標。不同位點的甲基化可以作為特異性生物標志物，反映肺癌細胞的變化，如配對盒6（paired box 6，PAX6）可能是NSCLC 預后評估的生物標志物；腫瘤抑制因子RASSF1A 可以確定為與細胞外基質機械特性相關的臨床生物標志物，增加了肺腺癌的腫瘤干性和轉移性進展風險[50]。由此就可以針對性地依據患者個體生物標志物的不同，采用相應的治療手段，從而更加準確地判斷患者的預后情況，提高肺癌患者的生存率。

3 小結與展望

對于不同類型和分期的肺癌，其傳統診斷與治療已有了較完整的體系。肺癌的早診早治可以提高患者的生存率和治愈率。DNA 甲基化在基因層面影響了腫瘤發生和發展的全過程，使得患者的個體化表現更加明顯，使治療具有針對性，是對傳統的肺癌診療方法的補充。隨著更多肺癌相關的DNA 甲基化位點被發現，其在肺癌領域的研究和應用與日俱增，與之相關的DNMT 及其DNMT 抑制劑在肺癌診治及預后評估中的作用更加顯著。隨著表觀遺傳學的進步，有關DNA 甲基化的相關研究加深了人們對于腫瘤細胞的認知，更深入了解了DNA 甲基化對于基因的調節模式，幫助臨床對肺癌進行診治，提高早診早治率，也為未來阻斷肺癌的發生提供新的思路。