DNA 甲基化在食管鱗狀細胞癌中的研究進展△

楊志珍，談艷芳

1成都中醫藥大學醫學技術學院，成都 610000

2德陽市人民醫院檢驗科，四川 德陽 618000

食管癌是一種食管上皮來源的高度惡性腫瘤，2018 年全球癌癥統計數據顯示，全球食管癌病死率居第6 位，發病率居第7 位，其惡性程度高，預后差[1]。2018 年中國食管癌新發病例數和死亡病例數分別居全部惡性腫瘤的第6 位和第4 位[2]。食管鱗狀細胞癌為食管癌的主要亞型，約占食管癌總數的90%，并且患者5 年生存率﹤30%[3]。文獻提示，DNA 甲基化作為一種表觀遺傳修飾，是目前發現的在食管鱗狀細胞癌分子診斷中具有廣泛應用前景的生物學標志物，在食管鱗狀細胞癌的發生和發展中起到重要作用[4]。與傳統影像、內鏡、病理等檢查相比，DNA 甲基化檢測靈敏度高、特異性強、創傷小、無輻射，適合人群早期篩查，在食管鱗狀細胞癌的早期診斷、藥物治療、轉移及預后評估方面顯示出了巨大優勢。因此，本文綜述DNA 甲基化在食管鱗狀細胞癌中的研究進展。

1 DNA 甲基化

DNA 上的表觀遺傳標記是可逆的、可遺傳的修飾，能在不改變DNA 序列的前提下，改變基因的功能或活性。DNA 甲基化是一種重要的表觀遺傳學改變，是DNA 甲基轉移酶（DNA methyltransferase，DNMT）催化DNA 序列上的特定堿基，以S-腺苷甲硫氨酸（S-adenosine methionine，SAM）為甲基供體，通過共價鍵得到甲基的化學修飾過程，這種DNA 甲基化主要指基因組中CpG 二核苷酸胞嘧啶第5 位碳原子的甲基化過程，是哺乳動物DNA 甲基化的唯一形式[5]。根據序列的同源性和功能，真核生物DNMT 目前分為4 種，即DNMT1、DNMT3a、DNMT3b 和DNMT3L。DNMT1 參與CG 序列甲基化的維持；DNMT3a和DNMT3b也被稱為從頭甲基化轉移酶，可以為未修飾的DNA 建立新的甲基化模式；DNMT3L 沒有催化活性，是一種缺乏甲基轉移酶催化結構域的蛋白質，通過與DNMT3a和DNMT3b 結合，發揮甲基轉移酶的作用[5]。DNA甲基化通過改變染色質結構、DNA 構象、DNA 穩定性以及DNA 與蛋白質相互作用等方式，參與細胞分化、基因組穩定性、X 染色體失活、基因印跡等細胞生物學過程，從而控制基因表達[6]。

2 腫瘤與DNA 甲基化

國際癌癥研究機構于2018 年發布的《世界癌癥報告》中指出，在134 個國家中，腫瘤是導致過早死亡（即30～69 歲死亡）的第一大或第二大原因，在另外45 個國家中，腫瘤是導致過早死亡的第三大或第四大原因，全世界的腫瘤發病率和病死率都在上升，與2008 年相比，2018 年全球腫瘤新發病例和死亡病例分別約1810 萬和960 萬，新發病例較2008 年增長了42.5%，死亡病例較2008 年增長了26.3%，排名前十位的腫瘤依次為肺癌、乳腺癌、前列腺癌、結直腸癌、胃癌、肝癌、食管癌、宮頸癌、甲狀腺癌、膀胱癌，占腫瘤總發病例數的60.8%[1]。腫瘤對人類健康造成嚴重威脅，加重了國家經濟負擔，也將可能成為人口預期壽命增長的主要障礙。

DNA 甲基化與腫瘤的發生發展有著密切的關系，已被證明是許多腫瘤的重要標志。DNA 甲基化異常會導致基因異常表達，使其成為腫瘤進展的重要調控因子。因此，通過對DNA 甲基化進行分析，可為早期識別不同的腫瘤類型提供新的可能。DNA 是穩定的，容易從不同種類的物質中分離出來，DNA 甲基化是可逆的，可以很容易地被檢測和分析，這可能會成為一種有效的檢測方法。DNA 甲基化標志物的檢測對于腫瘤的早期篩查、診斷、治療、預后評估是至關重要的。

3 食管鱗狀細胞癌與DNA 甲基化

食管鱗狀細胞癌經歷了一個緩慢、多階段、雙向的轉化過程，可有不同程度的炎癥、不典型增生、低級別上皮內瘤變和高級別上皮內瘤變，最終發展為腫瘤，預防和治療食管鱗狀細胞癌的緊迫性是顯而易見的。食管鱗狀細胞癌的發生是一個多因素的復雜過程，是原癌基因激活和抑癌基因因遺傳和表觀遺傳變化而失活的結果。這種基因的表觀遺傳修飾在一定條件下是可逆的，且不依賴于DNA 序列的變化，特別是DNA 甲基化異常是食管鱗狀細胞癌的常見表觀遺傳學改變。

3.1 DNA 修復相關基因

食管鱗狀細胞癌中DNA 修復基因O-6-甲基鳥嘌呤-DNA 甲基轉移酶（O-6-methylguanine-DNA methyltransferase，MGMT）和mutL 同源物1（mutL homolog 1，MLH1）的失活主要歸因于其啟動子區域的甲基化[7]。避免細胞從鳥嘌呤（G）突變為腺嘌呤（A），以保持基因組的準確性和完整性，其功能異常會影響DNA 的修復能力，從而增加腫瘤發生過程中的突變率。有學者在對原發性食管鱗狀細胞癌患者的研究中發現，脆性組氨酸三聯體二腺苷三磷酸酶（fragile histidine triad diadenosine triphosphatase，FHIT）基因與基因組穩定性及腫瘤進展相關，FHIT基因的甲基化與吸煙相關；由于其常發生在食管鱗狀細胞癌的早期，因此可以作為早期食管鱗狀細胞癌潛在的預后生物標志物，在食管鱗狀細胞癌未進行淋巴結轉移及遠處轉移前被檢測出，大大提高了食管鱗狀細胞癌的診斷率及治療效果[8]。

3.2 細胞周期相關基因

在鱗狀細胞癌中，一些細胞周期相關基因的啟動子被高甲基化，從而抑制了它們的表達。細胞周期相關基因細胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑2A（cyclin dependent kinase inhibitor 2A，CDKN2A）和Ras 相關結構域家族成員1A（Ras association domain family member 1A，RASSF1A）在食管鱗狀細胞癌中經常被高甲基化和轉錄沉默[7]。叉頭框和環指結構域檢查點（checkpoint with forkhead and ring finger domains，CHFR）啟動子區甲基化在食管鱗狀細胞癌中經常被發現，已有研究通過對食管鱗狀細胞癌患者腫瘤組織及癌旁組織的研究發現，隨著組織異型增生級別的增加，CHFR甲基化呈現逐漸升高的趨勢，當用多西他賽或紫杉醇治療時，CHFR甲基化食管鱗狀細胞癌細胞的活力低于未甲基化的細胞，說明CHFR甲基化可降低食管鱗狀細胞癌細胞對多西他賽或紫杉醇的敏感性，可通過監測CHFR甲基化程度判斷食管鱗狀細胞癌的病變程度及這兩種藥物的化療效果[9]。腫瘤抑制基因p16是一種細胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑，有研究顯示，隨著食管病變嚴重程度的增加，細胞學標本中p16甲基化頻率呈增加趨勢，p16甲基化與食管鱗狀細胞癌的發生風險顯著相關[10]。

3.3 細胞凋亡相關基因

谷胱甘肽S-轉移酶P1（glutathione S-transferase pi 1，GSTP1）是一種致癌物質，與煙草代謝相關，食管鱗狀細胞癌的發病過程可能與GSTP1的多態性相關。有學者對食管鱗狀細胞癌組織的研究顯示，GSTP1多態性作為食管鱗狀細胞癌的獨立危險因素，通過體細胞CpG 島啟動子失活的GSTP1在各種腫瘤亞型中被證明是高甲基化的，GSTP1基因去甲基化后，細胞增殖率降低，凋亡率增加，食管鱗狀細胞癌受到抑制，腫瘤細胞對5-氟尿嘧啶的敏感性增加，提示GSTP1基因去甲基化可能會抑制食管鱗狀細胞癌的發生，提高食管鱗狀細胞癌細胞對5-氟尿嘧啶的敏感性[11]。

3.4 侵襲轉移相關基因

鈣黏蛋白1（cadherin 1，CDH1）基因位于染色體16q24 上，編碼E-鈣黏蛋白（E-cadherin），在維持正常上皮細胞的細胞連接中起著關鍵作用。在食管鱗狀細胞癌中，CDH1基因甲基化率為14%～61%，與早期食管鱗狀細胞癌的復發相關，其表達喪失與食管鱗狀細胞癌的侵襲、轉移和預后不良有關[12-14]。去甲基化后，CDH1基因在食管鱗狀細胞癌中的表達恢復，說明CDH1基因的沉默與其啟動子區的高甲基化有關[15]。有研究發現，食管鱗狀細胞癌組織中蛋白酪氨酸磷酸酶非受體6 型（protein tyrosine phosphatase non- receptor type 6，PTPN6）基因的甲基化率為63.4%，PTPN6甲基化水平可能與食管鱗狀細胞癌細胞的增殖、遷移和侵襲有關[16]，可作為食管鱗狀細胞癌轉移的生物標志物，對臨床監測食管鱗狀細胞癌的轉移具有重要意義。

3.5 WNT 信號通路基因

WNT/β-catenin 信號通路被報道與人類食管鱗狀細胞癌的發生和發展有著密切聯系，在許多食管鱗狀細胞癌病例中發現WNT 通路的基因改變[17]。WT1 轉錄因子（WT1 transcription factor，WT1）通過作用于WNT/β-catenin 通路上游而促進上皮-間充質轉化，有研究發現，WT1在食管鱗狀細胞癌中因啟動子甲基化而表達失調[18]。APC 是WNT 通路抑制因子，食管鱗狀細胞癌中APC啟動子高甲基化的患者轉移淋巴結較少，預后較好，可以作為食管鱗狀細胞癌的預后標志物[19]。WNT5a在食管鱗狀細胞癌中出現高頻甲基化[20]。DNA 甲基化標志物已被報道用于評估食管鱗狀細胞癌的復發風險，有研究結果證明，鋅指蛋白382（zinc finger protein 382，ZNF382）作為一種良性腫瘤抑制因子，其啟動子甲基化與食管鱗狀細胞癌分化水平相關，并通過抑制WNT通路來抑制食管鱗狀細胞癌的惡化[21]。

3.6 轉化生長因子-β（transforming growth factorβ，TGF-β）通路基因

轉化生長因子-β 受體2（transforming growth factor beta receptor 2，TGFBR2）是一種重要的腫瘤抑制因子，是TGF-β信號轉導的關鍵介導因子。有研究表明，食管鱗狀細胞癌組織樣本中TGFBR2啟動子相關CpG 位點的甲基化水平高于正常食管組織樣本，TGFBR2啟動子不僅在從非典型增生到癌變的過程中表現出高甲基化，而且在從正常上皮到癌變的過程中也表現出高甲基化，TGFBR2在食管鱗狀細胞癌中由于其啟動子區DNA 超甲基化而表達下調，食管鱗狀細胞癌中TGFBR2CpG 高水平甲基化提示TGFBR2啟動子區DNA 甲基化可能導致TGFBR2mRNA 表達缺失或降低，從而促進食管鱗狀細胞癌的癌變，用DNMT 抑制劑5-氮雜-2’-脫氧胞苷處理腫瘤細胞，可逆轉TGFBR2啟動子的甲基化[22]。研究TGFBR2 在食管鱗狀細胞癌中的作用，可以更深入了解該疾病的發展機制，并可能成為食管鱗狀細胞癌患者個體化治療的生物標志物。

3.7 其他基因

Rh 家族C 糖蛋白（Rh family C glycoprotein，RHCG）是一種新的抑癌基因，在食管鱗狀細胞癌的發生發展中起著重要的作用。RHCG 通過抑制核因子κB（nuclear factor-κB，NF-κB）信號通路和基質金屬蛋白酶1（matrix metalloproteinase 1，MMP1）表達抑制食管鱗狀細胞癌的發生和轉移，具有評估食管鱗狀細胞癌患者預后的潛力[23]。胰島素樣生長因子結合蛋白樣1（insulin like growth factor binding protein like 1，IGFBPL1）在食管鱗狀細胞癌中的表達受啟動子區甲基化的調控，IGFBPL1的甲基化與腫瘤大小和TNM 分期有關，IGFBPL1 通過抑制磷脂酰肌醇-3-羥激酶（phosphatidylinositol 3-hydroxy kinase，PI3K）/蛋白激酶B（protein kinase B，PKB，又稱AKT）信號通路抑制食管鱗狀細胞癌細胞生長，IGFBPL1甲基化是一種潛在的食管鱗狀細胞癌早期檢測標志物，也是食管鱗狀細胞癌PI3K 靶向治療的預測標志物[24]。配對盒5（paired box 5，PAX5）基因甲基化被確定為檢測食管鱗狀細胞癌的一個很好的標志物，其高甲基化與食管鱗狀細胞癌細胞增殖和順鉑耐藥顯著相關[25]。Piwi 相互作用RNA（Piwi-interacting RNA，piRNA）-823 作為一種新型的非編碼小分子RNA，在食管鱗狀細胞癌中具有作為診斷和預后生物標志物的潛力，其可能通過表觀遺傳途徑DNMT3b 誘導DNA 甲基化，從而在食管鱗狀細胞癌中發揮致癌作用[26]。EYA 轉錄輔激活因子和磷酸酶4（EYA transcriptional coactivator and phosphatase 4，EYA4）在大多數被檢測的食管鱗狀細胞癌細胞系中存在低表達和高甲基化，用5-氮雜-2’-脫氧胞苷處理后可恢復食管鱗狀細胞癌細胞系中EYA4 的表達，EYA4 通過失活AKT/糖原合成酶激酶3β（glycogen synthase kinase 3 beta，GSK3B）/Slug 通路和抑制上皮-間充質轉化抑制食管鱗狀細胞癌細胞遷移和侵襲，可能與食管鱗狀細胞癌TNM 分期和淋巴結轉移相關[27]。半胱氨酸雙加氧酶1（cysteine dioxygenase type 1，CDO1）具有酶活性，其甲基化在食管鱗狀細胞癌中很常見，具有抑制腫瘤細胞活性的作用，CDO1 的表達通過降低MDA-MB-231 細胞的活性氧（reactive oxygen species，ROS）解毒能力來降低細胞活性，CDO1甲基化可能是原發性食管鱗狀細胞癌的一個強有力的預后預測因子，并對食管鱗狀細胞癌的治療具有重要的臨床意義[28]。

4 DNA 甲基化作為食管鱗狀細胞癌化療敏感性的標志物及治療靶點

DNA 甲基化異常是食管鱗狀細胞癌中常見的表觀遺傳學改變。DNA 甲基化失調會導致腫瘤抑制基因失活和原癌基因激活。DNA 是穩定的、可逆的，容易從不同種類的物質中分離出來，這為腫瘤的治療提供了新的機會。因此，可以應用去甲基化藥物來恢復抑癌基因的表達，從而抑制腫瘤的發展。DNA 甲基化狀態可評估患者對化療的敏感性。關于DNA 甲基化作為食管鱗狀細胞癌化療敏感性標志物的報道非常有限。PAX5甲基化被確定為鱗狀細胞癌的一個很好的標志物，PAX5的高甲基化與食管鱗狀細胞癌細胞增殖和順鉑耐藥顯著相關，PAX5高甲基化可抑制食管鱗狀細胞癌細胞增殖，增加細胞對化療藥物順鉑的耐藥性，導致無復發生存期和總生存期延長[25]。GSTP1的DNA甲基化是LINC01419 促進食管鱗狀細胞癌進展和5-氟尿嘧啶化療耐藥的原因，下調LINC01419 的表達可增加食管鱗狀細胞癌細胞在體內對5-氟尿嘧啶的敏感性，GSTP1基因去甲基化后，可使細胞增殖減少，凋亡增加，食管鱗狀細胞癌的發展受到抑制，腫瘤細胞對5-氟尿嘧啶的敏感性增加，提示GSTP1基因去甲基化可能抑制食管鱗狀細胞癌的發生，提高食管鱗狀細胞癌細胞對5-氟尿嘧啶的敏感性[11]。

5 小結與展望

表觀遺傳改變已被認為是食管鱗狀細胞癌發生、發展的關鍵因素。DNA 甲基化是食管鱗狀細胞癌早期研究最廣泛的表觀遺傳修飾之一，可作為食管鱗狀細胞癌早期篩查、診斷、治療、預后評估和化療敏感性的標志物。本文總結了食管鱗狀細胞癌發生、發展過程中一些基因異常甲基化對食管鱗狀細胞癌預防、診斷及治療等方面的影響。在食管鱗狀細胞癌中，表觀遺傳調控機制和DNA 甲基化分子標志物尚待進一步研究，未來可建立食管鱗狀細胞癌的診斷、預防、轉移模型，為臨床醫師提供有價值的食管鱗狀細胞癌早期篩查、防治工具，這對于提高食管鱗狀細胞癌患者的生存率、及時挽救患者生命具有非常重要的意義。